酵母硒总硒、无机硒、有机硒含量的测定方法

摘要

本发明公开了酵母硒总硒、无机硒、有机硒含量的测定方法。样品经酸加热消化后，在盐酸介质中，将试样中的硒统一还原成四价硒，四价硒在微酸性条件下与2，3-二氨基萘（DAN）生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取。用荧光光度计测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。对总硒的测定使用了3mL混合酸，大大减少了混合酸的用量；消解和提取在加盖的圆底烧瓶中水浴进行，可以避免强氧化还原性酸对实验室环境的污染，同时可防止硒的挥发损失，得到较高回收率；取消了甲酚红指示剂的使用，避免了样品对指示剂颜色变化的判断造成干扰，也减少了指示剂对待测液的干扰。总硒和无机硒的测定时间大大缩短，总硒的消化和无机硒的提取同时在约一个小时可以完成。

说明书

技术领域

本发明涉及酵母硒中硒含量，尤其是有机硒含量的测定方法。

背景技术

1974年，美国食品药品监督管理局（FDA）开始允许在畜禽和猪饲料中添加硒。至此，无机硒和有机硒的研究与应用进入了更加开阔的领域（Ullrey，1992）。获得有机硒最经济的来源之一是通过酵母富集无机硒（Neve，1998）。酵母能够吸收碳、氮、磷、硫和矿物质以及微量元素，因为硒与硫是同族元素，在物理及化学特性上具有相似性，使得其在酵母细胞生物合成反应中取代硫（Jian Zheng，2003），富硒酵三母就是在酵母培养过程中加入亚硒酸钠等形式的无机硒, 使之转化为有机硒形式并在酵母中富集而生产出的一种微生物发酵产物（蒋守群，2006）。富硒酵母中所能达到的最大硒量约为3000 mg/kg (Demirci，1999；Gassner，1999)，而商业富硒酵母的含硒量一般为500～2000 mg/kg( 0.05%～0.20%) ( Schrauzer, 2006) 。我国的饲料添加剂品种目录（2013）中将亚硒酸钠和酵母硒作为矿物元素饲料添加剂用于养殖动物补硒剂。亚硒酸钠作为硒添加剂，硒源丰富，价格较低，但是存在生物有效性低、中毒量与需要量之间范围小、毒性大、易污染环境等缺陷，因而被严格限制其使用量（刘恒，2014），欧盟等一些国家和地区已经限制或禁止使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂（刘娜，2010），例如瑞典已限制其在乳猪料中使用。而日本则禁止在动物饲料中添加亚硒酸钠（沈银书，2008）。富硒酵母作为有机硒饲料添加剂，具有硒利用率高、毒性低、对环境污染小等优点，其添加效果大大优于亚硒酸钠，因而受到广泛的关注，并呈现逐渐取代亚硒酸钠在饲料中添加的趋势（沈银书，2008）。

目前，酵母硒的有机硒含量测定方法还没有形成国家标准。常用的总硒的含量测定是基于分光光度法分析硒与有机试剂间形成的苤硒脑衍生物，如3，3-二氨基联苯胺（Porcella，1991）、双硫腙（Campbell，1980）、邻苯二胺（周建波，1993）、2，3-二氨基萘（Juana, 2004）、6-氨基-1-萘酚-3-磺酸（Ramachandran，1993；Manish，1994）、2，3-二氨基-1，4-二溴代萘（Johansson，1995）；氢化物发生-原子吸收光谱法（Masscheleyn，1991；Ragnar，1987）和原子荧光光谱法（高建忠，2006；王世成，2013），也被报道用于硒的测定，氢化物-原子荧光光谱法成为我国国家标准食品中硒的测定法的标准（GB/T 5009.93-2010）。

对于有机硒样品中总硒的测定，我国国家标准食品中硒的测定法（GB/T 5009.93-2010）和饲料中硒的测定（GB/T 13883-2008）中，将试样置于消化瓶或烧杯中加入20 mL混合酸，再用电热板加热煮沸消化，后用用氨水或盐酸调至淡红橙色（pH1.5~2.0），并用甲酚红溶液来做指示剂。上述方法中，20 ml混合酸带来环境污染和资源浪费；消化是否完成则以观察消化过程中产生的浓白烟来判定，由于没有一个明确的指标，大多数情况下都是凭借经验做出判断，使判定结果很难精确，受主观因素影响很大；硒在上述消化过程中很容易挥发损失，使测定结果难于保证；另外由于样品消化液本底的干扰，指示剂对颜色变化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。

国家标准方法中尚无无机硒的测定方法，文献报道先用缓冲盐或酸来提取（高建忠，2006），再采取总硒的测定方法来进行测定；也有报道为了测定硒酵母中有机硒的含量, 首先建立了一种无机硒和有机硒的鉴别方法, 再采用透析处理法使硒酵母中的无机硒和有机硒得以分离。上述提取方法耗时较长且十分繁琐。

发明内容

 针对现有硒检测技术的不足，本发明提供一种酵母硒总硒、无机硒、有机硒含量的测定方法。

     一种酵母硒总硒含量的测定方法，称取50 mg的酵母硒于100 mL的圆底烧瓶中，加入1 mL的质量百分比为69%的浓硝酸，再加入2 mL质量百分比为70 %~72%的高氯酸，置于沸水浴中磁力搅拌1h；结束冷却后，加入8.4 mL浓度为6 mol/L的 HCL，再置沸水浴中反应10 min，将上述溶液转移到容量瓶中，并用水定容至100mL，取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30～40mL的水，调节pH至 1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN（2，3-二氨基萘）溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度，从而得到酵母硒中总硒含量。

    所述的调节pH至 1.7~1.9。

    一种酵母硒无机硒含量的测定方法，称取25 mg的酵母硒于100 mL的圆底烧瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，置于沸水浴中磁力搅拌10 min，冷却后调节pH至 1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min；取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度，从而得到酵母硒中的无机硒含量。

    一种酵母硒有机硒含量的测定方法，总硒含量根据所述方法测定，无机硒含量根据所述方法测定，相差得到有机硒的含量。

本发明的有益效果

本发明得到了有机硒含量测定方法：对总硒的测定使用了3 mL混合酸，大大减少了混合酸的用量；对总硒和无机硒含量的测定避免了使用电热板加热煮沸消化，消解和提取在加盖的圆底烧瓶中水浴进行，该操作可以避免强氧化还原性酸对实验室环境的污染，同时可防止硒的挥发损失，得到较高回收率，同时有效提高样品前处理的可操作性和准确性；取消了甲酚红指示剂的使用，用pH计来监测酸性环境，避免了样品对指示剂颜色变化的判断造成干扰，同时也减少了指示剂对待测液的干扰的可能性；通过测定环己烷萃取层的荧光值可计算硒的含量，避免了使用成本较高的原子荧光分光谱仪的使用，使普通实验室能够用该方法完成硒样品中有机硒含量的检测；总硒和无机硒的测定时间大大缩短，总硒的消化和无机硒的提取同时在约一个小时可以完成。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明；

    图1为硒标准溶液的标准曲线及线性方程。

具体实施方式

方法原理

样品中的硒可能以不同的化学形式存在，包括无机硒和有机硒。样品经酸加热消化后，在盐酸介质中，将试样中的硒统一还原成四价硒，四价硒在微酸性条件下与2，3-二氨基萘（DAN）生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取。用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为520 nm条件下测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。

总硒含量测定方法，准确称取50 mg左右的酵母硒于100 mL的具塞圆底烧瓶中，加入1 mL的浓硝酸（69%），再加入2 mL的高氯酸（70 %~72%），再置沸水浴中磁力搅拌1h；冷却后加入8.4 mL HCL（盐酸浓度为6 mol/L），再置沸水浴中反应10 min。我国国家标准食品中硒的测定法（GB/T 5009.93-2010）和饲料中硒的测定（GB/T 13883-2008）将试样置于消化瓶或烧杯中加入20 mL混合酸，再用电热板加热煮沸消化。20 ml混合酸带来环境污染和资源浪费；消化是否完成以观察消化过程中产生的浓白烟来判定，由于没有一个明确的指标，大多数情况下都是凭借经验做出判断，使判定结果很难精确，受主观因素影响很大；硒在上述消化过程中很容易挥发损失，使测定结果难于保证；由于样品消化液本底的干扰，指示剂对颜色变化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。

本方法将上述溶液无损转移到容量瓶中，并用纯水定容至500 mL，取出2.5 mL加入至锥形瓶中，再加入30~40mL的水，用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至 1.7~1.9，上述国标用氨水或盐酸调至淡红橙色（pH1.5~2.0），并用甲酚红溶液来做指示剂，由于样品消化液本底的干扰，指示剂对颜色变化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。

用0.1 mol/L盐酸溶液稀释定容至100 mL，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温（一般为25摄氏度），全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，于荧光分光光度计上，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm ，测定环己烷层的荧光强度，从而结合标准曲线得到总硒含量。

无机硒含量测定方法，准确称取50 mg左右的酵母硒于100 mL的圆底烧瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，置于沸水浴中磁力搅拌10 min，冷却后用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至 1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。文献报道先用缓冲盐或酸来提取（高建忠，2006），再采取总硒的测定方法来进行测定；也有报道为了测定硒酵母中有机硒的含量, 首先建立了一种无机硒和有机硒的鉴别方法, 再采用透析处理法使硒酵母中的无机硒和有机硒得以分离。上述提取方法耗时较长且十分繁琐。

仪器与试剂

softmax pro5多功能连续光谱酶标仪（美国Molecular Devices公司），集热式恒温加热磁力搅拌器（杭州惠创仪器设备有限公司），数显恒温水浴锅（常州国华），pH计       （美国Mettler Toledo 公司），纯水仪（日本Yamato公司），纯水来自本纯水仪。

色谱级硒粉和2，3-二氨基萘（DAN）分析纯从sigma公司购买。DAN 试剂（1.0 g/L）：此试剂在暗室内配制。称取DAN（纯度95%~98%）200 mg 于一带盖锥形瓶中，加入0.1 mol/L 盐酸200 mL，振摇约15 min 使其全部溶解。加入约40 mL 环己烷，继续振荡5 min。将此液倒入塞有玻璃棉（或脱脂棉）的分液漏斗中，待分层后滤去环己烷层，收集DAN 溶液层，反复用环己烷纯化直至环己烷中荧光降至最低时为止（约纯化12 次）。将纯化后的DAN 溶液储于棕色瓶中，加入约1 cm 厚的环己烷覆盖表层，至冰箱内保存。必要时在使用前再以环己烷纯化一次。至荧光值约为7~8；氨水、高氯酸、浓硝酸、EDTA二钠、盐酸羟胺、环己烷均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；EDTA 混合液：称取EDTA 二钠盐2.5 g，加水并加热至完全溶解，冷却后稀释至125mL；加入6.25 g 盐酸羟胺溶于水中，稀释至250 mL。

酵母硒样品由浙江科盛饲料有限公司提供。

实施例1 标准曲线的绘制

     硒粉的前处理： 准确称取元素硒100.0 mg，溶于1 mL浓硝酸（69%）中，加入2 mL 高氯酸（70 %~72%），至沸水浴中加热4 h；冷却后加入8.4 mL HCL（盐酸浓度为0.1 mol/L），再置沸水浴中反应10 min。准确稀释至1000 mL，此为储备液（Se 含量：100 μg/mL）。使用时用10 mL 0.1 mol/L 盐酸将储备液稀释定容至50 mL，得到每毫升含0.2 μg 硒标准工作液。

标准曲线的绘制：分别准确量取0.00，0.20，0.60，1.00，3.00，12.00，14.00以及20.00mL硒标准工作液。相当于0.00 μg，0.04 μg，0.12μg，0.20 μg，0.60 μg，2.40 μg，2.80 μg以及4.0 μg硒，用水稀释至40 mL，用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，于荧光分光光度计上，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。

实施例2 酵母硒总硒含量测定

准确称取50 mg左右的酵母硒于100 mL的具塞圆底烧瓶中，加入1 mL的浓硝酸，再加入2 mL的高氯酸（70 %~72%），再置沸水浴中磁力搅拌1h；冷却后加入8.4 mL HCL（盐酸浓度为6 mol/L），再置沸水浴中反应10 min。将上述溶液无损转移到容量瓶中，并用纯水定容至100 mL，取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30~40mL的水，用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至 1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，于荧光分光光度计上，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。

实施例3酵母硒无机硒含量测定

准确称取25 mg左右的酵母硒于100 mL的圆底烧瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，置于沸水浴中磁力搅拌10 min，冷却后用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至 1.5~2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。

实施例4 有机硒含量测定

有机硒含量为总硒与无机硒的差值。

实施例5加标回收率的测定

在50 mg酵母硒中加入50 ug硒标准溶液，按实施例2进行前处理并检测；在50 mg酵母硒中加入0.2 ug硒标准溶液，按实施例3进行前处理并检测。

根据以上实施例1-5得到的结果与讨论：

1、标准曲线的绘制

10 mL环己烷中所含硒的量作标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为y=642.7x+81.99，相关系数平方为0.997，0~4.0 ug硒在每10 mL环己烷中浓度与荧光强度呈良好的线性关系。

 2、酵母硒中硒含量测定结果

    在酵母硒的总硒和无机硒测定步骤中加标准硒溶液，结果如表1所示，结果表明这种方法精度高。测得酵母硒有机硒含量为2034.06 ug/g。

表1 酵母硒中硒含量测定结果

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