一种口服酵母携带DNA片段作为新型水产口服DNA疫苗的制备方法及应用

摘要

本发明一种由口服酵母携带DNA片段活体靶向水产动物肠道免疫细胞，诱导水产动物产生免疫反应的制备方法。该疫苗生产成本低，使用方法简单，适合大规模生产，而且与传统减毒疫苗相比对动物无毒力威胁。可用在鱼类贝类等水产动物的多种细菌性、病毒性和寄生虫等口服DNA疫苗的开发应用上，使水产动物健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，同时避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

说明书

技术领域

本申请涉及一种酵母携带DNA片段的口服DNA疫苗，属于基因工程领域。

背景技术

DNA疫苗是指将病原体抗原基因插入可在真核生物体内表达的质粒中获得重组质粒，将该质粒DNA接种给鱼体后，质粒能够在其体内复制、转录、翻译成相应的抗原蛋白，并以不同的路径和方式刺激鱼体的免疫系统从而产生针对该抗原的免疫应答起到持续的免疫保护作用。

与传统的鱼类疫苗相比，DNA疫苗制备过程简便，且效率较高，具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，因此越来越受到科研工作者的重视。目前鱼类DNA疫苗均采用肌肉注射，但是肌肉注射作为DNA疫苗最为有效的免疫方式耗时耗力，在实际运用中存在一定的局限，不适合在规模化鱼类养殖中推广应用。相比之下，口服免疫安全方便，不受鱼体大小的限制，因此，口服DNA疫苗更具实用优势。目前为止，全世界只有针对鱼感染性造血坏死病毒的DNA疫苗在加拿大获得许可并投入商业化使用，国内被许可的应用于水产的商品化口服DNA疫苗还未见报道。

针对口服疫苗，有效的载体则能够避免保护性抗原在鱼体消化道内被消化而保证疫苗的免疫效果。酵母作为一种食用微生物长期被用于制备食物如面包、馒头，以及啤酒，具有安全性高的特点；酵母的细胞壁含有大量葡聚糖，是一种优质的免疫多糖；酵母具有较强的免疫佐剂效应；重要的是，研究证明酵母对胃肠的分泌物有较强的抵抗能力。因此，酵母是一种理想的口服疫苗的载体。

发明内容

本发明一种由口服酵母携带DNA片段活体靶向水产动物肠道免疫细胞，诱导水产动物产生免疫反应的制备方法。该疫苗生产成本低，使用方法简单，适合大规模生产，而且与传统减毒疫苗相比对动物无毒力威胁。可用在鱼类贝类等水产动物的多种细菌性、病毒性和寄生虫等口服DNA疫苗的开发应用上，使水产动物健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，同时避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

鸡卵白蛋白ovalbumin(OVA)是一个很好的模式抗原，经常用于多种免疫研究中。本研究以OVA基因为例，所述重组酵母含有真核基因表达载体pRS426-CMV-OVA，该表达盒在酵母中不表达，但可在哺乳动物细胞中表达。真核基因表达载体可以作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。将该重组酵母混合到鱼饲料中饲喂25g左右红鲫，免疫14天后就能在红鲫血清中检测到特异性抗体的产生，21天抗体达到峰值。本研究证明了口服酵母可以携带DNA片段靶向鱼类免疫细胞引起免疫反应。在此过程中，酵母不仅发挥了呈递抗原的功能，同时还扮演了佐剂的角色。本发明具有应用基因工程酵母作为DNA运送载体，靶向调控水产动物肠道免疫细胞的功能，将本实验所用载体的OVA片段可以替换为多种水产动物病毒或细菌等抗原基因，能够应用于新型口服DNA疫苗开发和生产，实现对水产动物免疫的调节、疾病预防与治疗。

附图说明

图1：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中,泳道M为Trans2K Plus DNAMarker；泳道1,2为CMV和OVA基因片段的PCR扩增产物。

图2：pRS426-CMV-OVA载体的质粒图谱。

图3：pRS426-CMV-OVA，并经SacII/BamHI/XhoI酶切图，其中泳道M为DNAMarker；泳道1为pRS426-CMV-OVA经SacII/BamHI/XhoI酶切的产物

图4：转化了JMB84-CMV-OVA质粒的细胞表达的OVA SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为western blot用Easy See蛋白marker(购自全式金公司)，泳道2为空细胞裂解的蛋白，泳道3为转染了pRS426-CMV-OVA的细胞蛋白。

图5：OVA蛋白SDS-PAGE跑胶图，其中泳道1为Blue Plus II蛋白预染marker(购自全式金公司)，泳道2为OVA上样量20μL，泳道3为OVA上样量30μL。

图6：Western Blot检测鱼血清中OVA抗体的产生图，其中泳道1为Easy See蛋白marker，泳道2为PBS对照组，泳道3为JMY1空酵母对照组，泳道4为免疫了含有pRS426-CMV-OVA酵母的试验组。

图7：检测免疫后不同时间抗体的滴度的ELISA检测结果图。

图8：OVA①组21天所产生抗体的效价。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合OVA基因的具体试验案例对本发明通过口服重组酵母表达外源基因的方法(即利用口服基因工程发酵酵母向水产动物体内靶向运送功能DNA片段的方法)作进一步的说明。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1、酵母真核表达载体pRS426-CMV-OVA的构建

首先以载体质粒pEGFP-C1(clontech)为模板，PCR扩增CMV片段；以鸡基因组DNA为模板扩增OVA的cDNA序列(GenBank:J00895.1)，其中在起始密码子后面紧接着一段HA标签序列(YPYDVPDYA)。

1.引物设计与合成

以载体质粒pEGFP-C1为模板，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计扩增CMV的引物为CMV-F和CMV-R，其中CMV-F中加入SacII酶切位点，CMV-R中加入BamHI酶切位点，引物序列如下：

CMV-F(SacII):5'TCCccgcggTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG 3'

CMV-R(BamHI):5'CGCggatccAGCTCTGCTTATATAGACCTC 3'

以鸡基因组DNA为模板，设计扩增OVA的引物OVA-F和OVA-R，并在上游引物OVA-F中引入BamHI酶切位点和HA标签序列，下游引物OVA-R中引入XhoI酶切位点。设计所扩增片段长度为1194bp。引物序列设计如下：

OVA-F(BamHI)：

CGCggatccATGTACCCATACGACGTTCCAGACTACGCTGGCTCCATCGGCGCAGCAAG

OVA-R(XhoI)：CCGctcgagTTAAGGGGAAACACATCTGCC

其中：引物5’端的红色字体为保护碱基，小写字母为相应酶切位点，OVA-F引物序列中下划线部分为HA标签序列。

所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

2.PCR扩增CMV启动子与鸡基因OVA片段

分别以pEGFP-C1载体质粒和鸡基因组DNA为模板，CMV-F/CMV-R，OVA-F/OVA-R为引物，PCR扩增CMV和OVA基因片段，PCR反应体系为如表1所述，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min 20s，35个循环；最后72℃延伸10min。

表1扩增CMV和OVA的PCR反应体系

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小正确结果如图1所示。其中泳道M为Trans2K Plus DNA Marker；泳道1,2为CMV和OVA基因片段的PCR扩增产物。

3.构建酵母表达载体pRS426-CMV-OVA

SacII/BamHI，BamHI/XhoI双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表2所示)与经BamHI/XhoI双酶切后的酵母真核表达载体pRS426(Addgene)连接，酶切体系如表3，连接体系如表4，16℃连接过夜，构建质粒pRS426-CMV-OVA，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。

表2扩增得到的CMV/OVA片段BamHI/XhoI双酶切反应体系

表3 pRS426的BamHI/XhoI双酶切反应体系

表4 CMV、OVA和pRS426的连接反应体系

所构建的pRS426-CMV-OVA酵母表达载体的质粒图谱如图2所示，可以看到该酵母表达载体是CMV启动子，可以启动后面的基因(OVA)在水产动物中表达，但不能在酵母中表达。该真核基因表达盒作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。

提取质粒pRS426-CMV-OVA，并经SacII/BamHI/XhoI酶切鉴定，结果如图3所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1为pRS426-CMV-OVA经SacII/BamHI/XhoI酶切的产物。送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。

实施例2、HA标签抗体检测pRS426-CMV-OVA在HEK293T细胞中的表达

pRS426-CMV-OVA质粒测序正确后，将该质粒转染HEK293T细胞检测OVA蛋白是否能够正确表达。利用表达载体pRS426-CMV-OVA中带有的HA标签，插入的外源基因片段能与之融合表达，然后用HA标签抗体检测目的蛋白的表达情况。

1.pRS426-CMV-OVA转染HEK293T细胞

HEK293T细胞系置于含DMEM，10％胎牛血清，100μg/mL青链霉素的培养基中，37℃，5％的CO2培养箱培养。HEK293T细胞系的转染：以12孔板为例，接种HEK293T细胞至12孔板中，待细胞密度接近70％时，换新鲜培养基。吸出12孔中的培养基，每孔加入37℃预热的新鲜培养基500μL，2-4小时后开始转染。取两个1.5mL灭菌EP管，一个加入约2μg的质粒，然后加入Opti-MEM至总体积50μL；另一个EP管内加入2μL So-Fast转染试剂和Opti-MEM至50μL。轻轻混匀两个EP管内的混合物，然后将含转染试剂的Opti-MEM缓慢加入含质粒的EP管中，边加边轻轻震荡，使其充分混匀。加完混匀后，将混合物置于室温20min，然后将一个转染混合体系滴加至一个12孔中，轻轻晃动几下，将培养板放回培养箱，12小时后换新鲜培养基。

2.RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白

(1)800g 4℃离心5分钟收集培养细胞，估计细胞离心后的体积(10⁶cells＝～20μLPCV,10⁷cells＝～100μL PCV)；

(2)每50～100μL PCV加入5倍体积RIPA裂解缓冲液(250～500μL)，冰浴中放置10分钟，并每隔5分钟在漩涡混合仪上振荡30秒；

(3)12000g 4℃离心10分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物；

(4)95℃加热5分钟，然后迅速冰浴5分钟，12000g 4℃离心10分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物。

3.Western Blot检测细胞中OVA的表达

SDS-PAGE分离细胞蛋白提取物(空细胞与转染pRS426-CMV-OVA的细胞)，SDS-PAGE上层浓缩胶浓度为5％，下层分离胶浓度为12％，蛋白上样量为30uL，先用80V跑30min后用100V跑60min，之后转到PVDF膜(先用甲醇浸泡20min)上。转膜后用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；加入一抗(HA标签抗体1:2000)室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min；加入二抗(羊抗鼠IgG 1:5000)室温孵育1h，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；然后加入化学发光底物显像。

转化了pRS426-CMV-OVA质粒的细胞表达的OVA大约36KD，如图4所示。其中，泳道1为western blot用Easy See蛋白marker(购自全式金公司)，泳道2为空细胞裂解的蛋白，泳道3为转染了pRS426-CMV-OVA的细胞蛋白。

实施例3、将pRS426-CMV-OVA质粒转化酵母

将测序正确的酵母表达载体pRS426-CMV-OVA通过LiAc的方法分别转化酵母菌株JMY1(MATα,his3-Δ1trp1-289rad1-Δura3-52)中：

将JMY1单克隆接种于3mLYPD培养基中30℃250rpm/min过夜摇菌；第二天1:50接种30℃250rpm/min摇至OD＝0.5左右；3000rpm/min离心收集菌体用灭菌水重悬洗两次后，加入900μL水和100μL1M LiAC(Sigma公司购买)颠倒混匀后30℃放置5min后离心收集菌体；用50μL体积的待转染的质粒溶液(质量约为1μg)轻轻重悬菌体后加入36uL1M LiAC和25μL 94℃变性处理10min冰上放置的ssDNA(Salmon Sperm DNA sigma公司，货号：31149-10G-F)，混匀后加入240μL 50％的PEG600，适当涡旋混匀；42℃热击45min离心收集菌体用1mL YPD30℃200rpm/min孵育1-2h；离心收集菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基(Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements,Sigma公司,货号Y2001-20G；葡萄糖,西陇化工股份有限公司,货号14527；YNB(Yeast NitrogenBase W/O Amino acids),Solarbio公司,货号Y8040-100；琼脂,Solarbio公司,货号A8190)上进行筛选。将筛选到的阳性克隆接种到液体SD培养基中。提取酵母质粒，对筛选的克隆进行酶切验证。

实施例4、重组酵母添加到水产饲料中免疫鱼

将空酵母JMY1菌种接种在YPD培养基摇菌大约一两天左右至OD值约为1.7左右，将验证正确的转化了pRS426-CMV-OVA的酵母接种在缺URA的SD培养基中摇菌大约三四天左右至OD值约为1.7左右(1OD≈1～2×10⁷cells)，6000rpm/min离心5分钟收集酵母细胞，并用PBS重悬菌体。将买好的成品饲料粉碎后用PBS或者PBS重悬的酵母菌加入其中，搅拌均匀，制粒后风干，于-20℃冰柜储存，饲喂前手工制成直径约2mm，长约3mm的颗粒。其中，将试验组饲料按酵母细胞数在饲料中所占的比例分为低(①)、中(②)、高(③)三组，低试验组中酵母数约为1.0×10⁸cells/g饲料，中试验组中酵母数在饲料中约为1.5×10⁸cells/g饲料，高试验组酵母数在饲料中约为2.0×10⁸cells/g饲料。每条鱼(25g左右)每天的投喂量为体重的3％左右，因此，三个试验组酵母饲喂鱼的比例分别约为0.7×10⁸、1.1×10⁸、1.5×10⁸cells/25g鱼体重。

试验用红鲫购于西安水族市场。选择体重约25g左右的健康红鲫随机分配在5个鱼缸里，每个缸里5条鱼。每个分组分别命名为PBS组，JMY1组，OVA①组，OVA②组，OVA③组。初次分鱼后先在养殖系统内进行为期一周的训食，使鱼完全适应试验养殖环境并对投喂形成条件反射，正式饲喂试验饲料前24h试验鱼禁食、消毒。次日正式投喂。每天09：00和16：30分别饱食投喂2次，投喂时间约40分钟。每天光照时间为12h(08：00-20：00)，每隔一天换一次水，水温26-29℃。

实施例5、采血

正式饲喂2周后开始每隔一周采一次血，采用一次性真空采血管(普通管)从鱼尾椎静脉采血约1ml，立即水浴30min，3000rpm/min 4℃离心20min，取血清分装，置-20℃保存备用。采取的血清样分别为免疫了2周、3周、4周、5周、6周、8周、10周的血清。

实施例6、Western Blot检测鱼血清中OVA抗体的产生

OVA蛋白购于sigma公司(货号：A5503)，用PBS溶解至1μg/μL，加上样缓冲液水浴煮沸5min，立即置冰上5min。SDS-PAGE跑胶，跑胶结果如图5。其中，泳道1为Blue Plus II蛋白预染marker(购自全式金公司)，泳道2为OVA上样量20μL，泳道3为OVA上样量30μL。

SDS-PAGE跑OVA蛋白30μL，SDS-PAGE上层浓缩胶浓度为5％，下层分离胶浓度为12％。先用80V跑30min后用100V跑60min，之后用半干转膜仪转到PVDF膜(先用甲醇浸泡20min)上，转膜条件0.8mA/cm²。转膜后用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；加入免疫后35天的的鲫鱼血清(1:50)4℃孵育过夜。次日TBST洗涤3次，每次10min；加入二抗鲫鱼单克隆抗体(Aquatic DiagnosticsLtd.(ADL)公司，F14)，室温孵育2h；TBST洗涤3次，每次10min；加入三抗(羊抗鼠IgG 1:5000)室温孵育1h，用TBST洗涤3次，每次10min。加入化学发光底物显像。试验结果如图6，其中泳道1为Easy See蛋白marker，2为PBS对照组，泳道3为JMY1空酵母对照组，泳道4为免疫了含有pRS426-CMV-OVA酵母的试验组。

实施例7、ELISA检测血清中抗体的滴度

1、检测免疫后不同时间抗体的滴度

购买的OVA蛋白用配制好的包被缓冲液稀释其至20μg/ml，加到酶标板的小孔中，每孔加入100μL，置于4℃过夜。次日倒掉反应孔中的包被液后用PBS洗涤缓冲液洗涤三次。然后待检红鲫血清(稀释比例为1:10)100μL于上面已包被的反应孔中，放置室温孵育2h。之后用PBS洗涤四次，在所有反应孔里加入鲫鱼单克隆抗体100μL，室温孵育2h。之后再次用PBS洗涤四次，在所有的反应孔中加入新鲜稀释(1:5000)的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗100μL，室温下孵育1个小时后再次用PBS缓冲液洗涤四次。于各反应孔中加入TMB底物溶液(TIANGEN，目录号为PA107)100μL，室温下温育15min。15min后立刻在各孔中加入2M硫酸50μL终止反应。各个反应孔中加入终止液终止反应后，应立即把酶标板置于ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔作为对照调零后测得各个反应孔的OD值。比较分析各个反应孔的OD值得到结果如图7。可以看出OVA①试验组鱼产生的免疫反应较强烈，并且在21天达到峰值。

2、检测OVA①组21天所产生抗体的效价

ELISA检测方法同上，其中一抗为倍比稀释的OVA①组21天的血清(初始比例为1:10，倍比稀释至1:1280)。各个反应孔的OD450值如图8。由图可以看出OVA①组21天产生抗体的效价大于1:1280。