一种土著氮转化微生物富集培养的方法及其在水体氨氮污染治理中的应用

摘要

本发明公开了一种土著氮转化微生物富集培养的方法及其在水体氨氮污染治理中的应用，属于环境微生物学和环境保护领域。从需要治理的水体中采集环境样品，用特定的富集培养基进行培养得到土著氮转化微生物富集培养物种子；将富集培养物种子、富集培养基加入到原位水样中进行扩大培养，再将扩大培养的富集培养物种子施用到水体，以治理水体氨氮污染。本发明通过对原位样品进行富集放大的方法获得高效土著氮转化微生物，比一般商品菌剂更具有针对性，也避免了外来菌剂对该水体的适应性及生态安全隐患。本发明通过人工可控的条件进行富集，保证了高效土著氮转化微生物的快速生长，比直接向水体添加促生剂效果更为稳定，也没有二次污染的风险。

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物学和环境保护领域，涉及一种土著氮转化微生物富集培养的方法及其在水体氨氮污染治理中的应用。

背景技术

工农业生产和生活向水体排放大量的营养盐（如氮、磷），从而导致水体富营养化。这是我国水环境面临的最严峻问题之一。

在监测和治理富营养化问题时，氨氮是一个重要的监测和治理指标。目前我国城镇污水处理厂最严厉的标准-一级A的排放标准中对氨氮的排放要求是5mg/L，而我国地表水IV水中氨氮的标准为1.5mg/L。这意味着在没有后续深度处理措施下，经污水处理厂处理过的废水如果直排环境，仍将造成水体氨氮超标。自然水体氨氮污染的修复主要通过生物修复。生物修复中首推微生物：氮素脱离水体环境的主要途径是通过微生物的硝化反硝化途径，其中最关键的限速步骤是氨氮的硝化过程。我国目前常用的微生物修复技术有两类。一类是直接向污染河道水体中投放商品化微生物菌剂。应用的微生物制剂主要包括美国的Clear-Flo系列菌剂、LLMO生物活性液、日本的有效微生物菌群、中国的光合细菌、硝化细菌等，并取得了一定的治理效果。上海市水务部门采用水底曝气和投加微生物相结合的方法治理西双泾河道，实现了脱除黑臭和降低氨氮的目的。上海玉垒环境生物技术有限公司使用“东江放线菌”对苏州河底泥进行修复，对皂河富营养化水体也有显著的处理效果。这些菌剂的应用虽然有成功的案例，但也存在难以克服的问题：这些菌剂都是环境外来微生物，存在水土不服的问题，其使用效果也并不十分稳定；甚至这些微生物还生物入侵的生态安全风险。

为克服微生物菌剂的不足，研究者开发了另一类技术：向污染河道水体投加微生物促生剂（营养物质），促进“土著”微生物的生长和对污染物的代谢作用，达到净化水质的目的。普罗生物技术（上海）有限公司、华东师范大学环境科学与技术系与上海市徐汇区环保局应用美国Probidic Solution公司的Bioenergizer水体净化促生剂在徐汇区上澳塘的一段河道内进行了试验。结果表明，投加促生剂对于消除水体黑臭、增加水体溶解氧（DO）作用明显且迅速，硝化速率也显著提高。这一技术与菌剂技术相比，生态安全风险大大降低，但也存在不足：微生物促生剂容易造成环境的二次污染，而且其促生效果对环境条件要求苛刻，很难大范围推广，因此限制了其应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种土著氮转化微生物富集培养的方法以及该方法在水体氨氮污染治理中的应用。本发明利用富集培养基，通过室内富集需要治理的河道或湖泊环境样品，获得高效的土著氮转化微生物富集培养物种子，然后通过放大培养获得可以应用的培养物，用于加速水体氮转化过程，以治理水体氨氮污染。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种土著氮转化微生物富集培养的方法，包括如下步骤：从需要治理的水体中采集表层底泥，将其转接到富集培养基中，振荡培养后，将培养物转接到新鲜的富集培养基中，继续振荡培养；经过连续多次转接培养后获得土著氮转化微生物富集培养物种子。所述的富集培养基的配方如下：

    营养盐用量（每升）(NH₄)₂SO₄0.035-0.06gK₂HPO₄0.16-0.32gMgSO₄·7H₂O0.0225-0.0492gNaCl0.275-0.35gCaCl₂·2H₂O0.06-0.083g微量元素0.5-2mL

上述富集培养基用5% Na₂CO₃溶液调节pH，使得pH值为7.3-7.8；其中，微量元素的组成为（g/L）：

FeCl₂·4H₂O2.75CuSO₄·5H₂O0.045ZnSO₄·7H₂O0.3CoCl₂·6H₂O0.35MnCl₂·2H₂O0.3EDTA0.5NaMoO₄·2H₂O0.22NaSeO₄·10H₂O0.01NiCl₂·6H₂O0.1H₃BO₄0.014Na₃C₆H₅O₇0.64Vitamin C0.15

所述的表层底泥转接到富集培养基的比例优选为20-50g/200-300mL。

所述的振荡培养的条件优选为：室温下100-160rpm振荡培养2-3天。

所述的培养物转接到新鲜富集培养基的比例优选为1:5-100（体积比）。

所述的培养物转接次数优选为3-5次。

一种土著氮转化微生物富集物扩大培养的方法，包括如下步骤：采集上述方法中的表层底泥来源地水体上覆水30-50L，加入0.1-1L上述富集培养基，接种上述富集培养物种子100-400mL，曝气培养。曝气采用小型空气压缩机经气泡石从桶底通入空气，控制溶氧水平在2-4mg/L。培养可以采用专业发酵罐，也可采用普通塑料桶和水泥池，但单个培养体系控制在30-60L范围内，治理较大水体可以采用多个培养体系大批量培养。

所述的曝气培养的条件优选为室温下曝气培养2-5天。

上述土著氮转化微生物富集培养的方法或土著氮转化微生物富集物扩大培养的方法在水体氨氮污染治理中的应用。

一种治理氨氮污染水体的方法，包括如下步骤：将通过上述方法扩大培养的富集培养物种子按体积比1:10000-100000泼洒到需要治理的水体中。治理过程中保持水体溶氧水平2mg/L以上，溶氧不足时需要人工曝气。

所述的扩大培养的富集培养物种子泼洒的时间优选为晴好天气的早晨。

本发明相对于现有技术的主要优点是：

1、本发明通过对原位样品进行富集放大的方法获得高效土著氮转化微生物，比一般商品菌剂更具有针对性，也避免了外来菌剂对该水体的适应性及生态安全隐患；

2、本发明通过人工可控的条件进行富集，保证了高效土著氮转化微生物的快速生长，比直接向水体添加促生剂效果更为稳定，也没有二次污染的风险，具有高效和广谱性。

附图说明

图1是巡司河土著氮转化微生物富集及扩大培养效果检测图，图中纵坐标单位为×10⁴copy/mL。

图2是巡司河围隔实验水样中氨氮浓度变化结果图。

图3是巡司河围隔实验水样中亚硝氮浓度变化结果图。

图4是巡司河围隔实验水样中硝氮浓度变化结果图。

图5是南湖土著氮转化微生物富集及扩大培养效果检测图，图中纵坐标单位为×10⁵copy/mL。

图6是南湖围隔实验水样中氨氮浓度变化结果图。

图7是南湖围隔实验水样中亚硝氮浓度变化结果图。

图8是南湖河围隔实验水样中硝氮浓度变化结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明做进一步的详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1  武汉市巡司河围隔水质改善

用彼得森采泥器采集武汉市巡司河（经度：114°18’0”，纬度：30°29’21”）表层底泥样品100g，装入自封袋，并迅速运回室内进行的氮转化微生物富集培养。

所用富集培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.035g，K₂HPO₄ 0.16g，MgSO₄·7H₂O 0.0225g，NaCl 0.275g，CaCl₂·2H₂O 0.083g，微量元素0.5mL，蒸馏水1L，5% Na₂CO₃溶液调节pH，使得pH值为7.3。其中，微量元素配方为：FeCl₂·4H₂O 2.75g，CuSO₄·5H₂O 0.045g，ZnSO₄·7H₂O 0.3g，CoCl₂·6H₂O 0.35g，MnCl₂·2H₂O 0.3g，EDTA 0.5g，NaMoO₄·2H₂O 0.22g，NaSeO₄·10H₂O 0.01g，NiCl₂·6H₂O 0.1g，H₃BO₄ 0.014g，Na₃C₆H₅O₇ 0.64g，Vitamin C 0.15g，蒸馏水1L。

将新鲜采集的底泥50g接种到250mL富集培养基中，摇床转速120rpm情况下室温振荡培养，3天后转接50mL培养物到250mL新鲜富集培养基中继续培养3天再进行下一轮富集转接。经过3轮富集转接培养，得到土著氮转化微生物富集培养物种子。氨氧化细菌在氨氮硝化过程中扮演重要作用，因此富集过程中通过荧光定量PCR检测其中氨氧化细菌数量的变化，以指示土著氮转化微生物富集培养效果。

荧光定量PCR所用引物为针对氨氧化细菌amoA基因的引物对（amoA-1F：5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’，amoA-2R：5’-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’），并将氨氧化细菌amoA基因克隆（克隆引物与荧光定量PCR引物相同）到pMD18-T载体上构建人工质粒作为标样制作定量标准曲线。荧光定量PCR结果见图1，表明富集效果非常明显，经过3轮富集，培养物中氨氧化细菌的丰度从初始的0.13×10⁴copy/mL增加到6.73×10⁹copy/mL。

取30L巡司河上覆水水样装到50L的塑料桶中，并同时加入0.2L上述富集培养基。向桶中接种100mL上述富集培养物种子，室温下曝气培养。曝气采用小型空气压缩机通过气泡石从桶底充入空气，维持桶中溶氧3mg/L左右。曝气培养3天后得到扩大培养的富集产物，并通过荧光定量PCR检测其中氨氧化细菌数量变化，以指示扩大培养效果。荧光定量PCR结果见图1，表明扩大培养效果非常明显，扩大培养产物中氨氧化细菌的丰度从2.17×10⁷copy/mL增加到2.31×10⁹copy/mL。

在巡司河建立4个2m×2m的围隔，围隔内平均水深0.7m。实验设置4个处理组：A组静置（对照组）；B组曝气；C组接种扩大培养的富集产物但不曝气；D组曝气并接种扩大培养的富集产物；C、D组接种量都为1:10000（体积比）。扩大培养的富集产物选择晴好天气的早晨投加；曝气采用小型空气压缩机通过气泡石从水底充入空气，进行不间断曝气，维持围隔中溶氧2mg/L。每天检测围隔中NH₄⁺-N（氨氮）、NO₂^--N（亚硝氮）、NO₃^--N（硝氮）的变化，检测结果见图2-4。结果表明在不间断曝气的情况下，D组围隔中氨氮的转化率显著高于其它组；C组和D组围隔中硝氮和亚硝氮积累量都显著要高于其它组；B组与C组相比，虽然在氨氮转化率上比较接近，但硝氮和亚硝氮积累量则明显要低，预示曝气对硝化过程刺激有限，氨氮可能被其它好氧微生物同化。

实施例2  武汉南湖围隔实验

武汉市南湖周边小区、高校密布，人口密集，点、面源污染源众多；龙王嘴污水处理厂的尾水亦直排南湖；因此南湖水体总氮和氨氮水平长期居高不下，水体为劣V类水质。

用彼得森采泥器采集南湖（经度：114°21’56.83”，纬度：30°28’43.45”）表层底泥样品200g，装入自封袋，冷藏运回室内进行的氮转化微生物富集培养。

所用富集培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 0.06g，K₂HPO₄ 0.32g，MgSO₄·7H₂O 0.0492g，NaCl 0.35g，CaCl₂·2H₂O 0.06g，微量元素2mL，蒸馏水1L，5% Na₂CO₃溶液调节pH，使得pH值为7.8。其中，微量元素配方为：FeCl₂·4H₂O  2.75g，CuSO₄·5H₂O 0.045g，ZnSO₄·7H₂O 0.3g，CoCl₂·6H₂O 0.35g，MnCl₂·2H₂O 0.3g，EDTA 0.5g，NaMoO₄·2H₂O 0.22g，NaSeO₄·10H₂O 0.01g，NiCl₂·6H₂O 0.1g， H₃BO₄ 0.014g，Na₃C₆H₅O₇ 0.64g，Vitamin C 0.15g，蒸馏水1L。

将新鲜采集的底泥30g接种到250mL富集培养基中，摇床转速120rpm情况下室温振荡培养，2天后转接20mL培养物到250mL新鲜富集培养基中继续培养2天再进行下一轮富集转接。经过3轮富集转接培养，得到土著氮转化微生物富集培养物种子。氨氧化细菌在氨氮硝化过程中扮演重要作用，因此富集过程中通过荧光定量PCR（同实施例1）检测其中氨氧化细菌数量的变化，以指示土著氮转化微生物富集培养效果。荧光定量PCR结果见图5，表明富集效果非常明显，经过3轮富集，培养物中氨氧化细菌的丰度从初始的0.95×10⁴copy/mL增加到7.60×10¹⁰copy/mL。

取30L南湖上覆水水样装到50L的塑料桶中，并同时加入0.1L上述富集培养基。向桶中接种200mL富集培养物种子，室温下曝气培养。曝气采用小型空气压缩机通过气泡石从桶底充入空气，维持桶中溶氧4mg/L左右。曝气培养3天后得到扩大培养的富集产物。并通过荧光定量PCR检测其中氨氧化细菌数量变化，以指示扩大培养效果。荧光定量PCR结果见图5，表明扩大培养效果非常明显，扩大培养产物中氨氧化细菌的丰度从4.67×10⁸copy/mL增加到4.43×10¹⁰copy/mL。

本实验在南湖建立4个3m×3m的围隔，围隔平均水深1.6m。实验设置4个处理组：A组静置（对照组）；B组曝气；C组接种扩大培养的富集产物但不曝气；D组曝气并接种扩大培养的富集产物；C、D组接种量都为1:100000（体积比）。扩大培养的富集产物选择晴好天气的早晨投加；曝气采用小型空气压缩机通过气泡石从水底充入空气，进行不间断曝气，维持围隔中溶氧4mg/L。每天检测围隔中NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N的变化，检测结果见图6-8。结果表明在不间断曝气的情况下，C组和D组围隔中氨氮的转化率、亚硝氮积累量比较接近，但二者都显著高于A、B组围隔；所有处理组硝氮积累量显著要高于对照组，但以D组围隔最高。这表明富集培产物的添加有效促进了围隔中氨氮的硝化过程，且添加富集培产物并结合曝气能更有效提高转化效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北工业大学

 

<120>  一种土著氮转化微生物富集培养的方法及其在水体氨氮污染治理中的应用

 

<130>  1

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  amoA-1F

 

<400>  1

ggggtttcta ctggtggt                                                     18

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  amoA-2R

 

<400>  2

cccctckgsa aagccttctt c                                                 21