派伊尔淋巴集结活化剂

摘要

本发明提供一种派伊尔淋巴集结活化剂，其作为有效成分含有从甘蔗中得到的多糖，该多糖以α-葡聚糖作为主要成分且峰值分子量在720000～1080000的范围内，在总构成糖组分中，葡萄糖占有的比率为80％以上，且非还原末端葡萄糖占有的比率为20～30％，以及α1-6键合的葡萄糖占有的比率为15～25％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种派伊尔淋巴集结活化剂。

背景技术

派伊尔淋巴集结是存在于上部肠道中的高度功能化的淋巴滤泡组织，其 是作为用于抗原特异性分泌型IgA的产生和免疫耐受性表达的重要出发点的 诱导组织之一。目前已知派伊尔淋巴集结在被称为肠道免疫的生物防御相关 的免疫机制中起着重要的作用。例如，派伊尔淋巴集结的淋巴细胞具有时常 通过归巢现象被补充至其它局部粘膜免疫系统和全身免疫系统的附属组织， 并传播免疫信息的功能。

作为派伊尔淋巴集结免疫功能调节活性之一，可以举出骨髓细胞增殖促 进因子(例如，细胞因子)在派伊尔淋巴集结中的产生。作为这种骨髓细胞 增殖促进因子，例如，已知有在派伊尔淋巴集结中产生的作为细胞因子的IL-6 (白细胞介素-6)(非专利文献1)。

另一方面，迄今为止，已有报道从菊花科茅苍术(Atractylodes lancea DC.) 的根茎中得到的多糖、以及从豆科内蒙黄耆(Astragalus mongholics Bunge.) 的地上部分得到的多糖具有调节派伊尔淋巴集结免疫功能的活性(非专利文 献2)。

另外，已知有以来自禾本科植物甘蔗的提取物作为有效成分的感染预防 治疗剂、疫苗佐剂以及针对由球虫引起的人或动物的疾病的预防治疗剂(例 如，专利文献1和2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-297046号公报

专利文献2：日本特开2003-63975号公报

非专利文献

非专利文献1：T.Hong，T.Matsumoto，H.Kiyohara and H.Yamada： Enhanced production of hematopoietic growth factors through T cell activation in  Peyer's patches by oral administration of Kampo(Japanese herbal)medicines， ‘Juzen-taiho-to’，Phytomedicine，5卷，353～360页(1998年)

非专利文献2：Hiroaki Kiyohara，Toshiake Matsuzaki，Tsukasa Matsumoto， Takayuki Nagai，Haruki Yamada：Yakugaku Zasshi，128卷，5号，709～719 页(2008年)

发明内容

发明要解决的课题

若可以人为地调节派伊尔淋巴集结的免疫功能，则可通过肠道免疫的方 式来调节与生物防御相关的免疫机制，因此是有益的。如非专利文献2中公 开的那样，迄今为止已知有几种具有派伊尔淋巴集结免疫功能调节活性的物 质。但是，尚谈不上有充分供应能力(repertory)以满足消费者的多样化需求。

另外，尽管已知有几种来自禾本科植物的功能性成分，但迄今为止尚不 知道具有派伊尔淋巴集结免疫功能调节活性的成分，例如尚不知道具有如下 作用的成分，所述作用是增强在派伊尔淋巴集结中产生具有骨髓细胞增殖促 进活性的细胞因子的作用(下面也将该作用称作“派伊尔淋巴集结活性作 用”)。

鉴于上述情况，本发明的目的在于，提供一种新型派伊尔淋巴集结活化 剂，其具有增强在派伊尔淋巴集结中产生具有骨髓细胞增殖促进活性的细胞 因子的作用。

解决课题的方法

本发明人等，发现从甘蔗(sugar cane)脱蔗糖提取物中提纯(精制)而 成的后述α-葡聚糖组分和杂聚糖组分具有增强在派伊尔淋巴集结中产生具有 骨髓细胞增殖促进活性的细胞因子的作用，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种作为有效成分含有从甘蔗得到的多糖的派伊尔淋巴 集结活化剂。

本发明的派伊尔淋巴集结活化剂，至少有增强在派伊尔淋巴集结中产生 具有骨髓细胞增殖促进活性的细胞因子(例如，IL-6)的作用。因此，至少 通过调节派伊尔淋巴集结中的上述细胞因子的产生，能够发挥派伊尔淋巴集 结免疫功能调节活性。另外，由于甘蔗是自古以来就用作食品的物质之一， 因此，可提供安全性更高的派伊尔淋巴集结活化剂。

上述多糖也可以是以α-葡聚糖作为主要成分，峰值分子量在720000～ 1080000的范围内，并在总构成糖组分中葡萄糖占有的比率为80％以上且非 还原末端葡萄糖占有的比率为20～30％以及α1-6键合的葡萄糖占有的比率为 15～25％的多糖(下面也称为“α-葡聚糖组分”)。由此，能够起到更优良的 派伊尔淋巴集结活性作用。此外，在本说明书中“α1-6键合的葡萄糖”是指 以1位和6位的羟基与其它结构单元进行键合的α-葡萄糖单元，也称作“α-6 键合的葡萄糖”。

本说明书中，所谓“分子量分布曲线”是指采用高速凝胶过滤色谱法 (HPSEC)分析被检测试样(α-葡聚糖组分和杂聚糖组分)的分子量时获得 的分布曲线。分子量例如是采用下述方法求出：通过标准多糖(pullulan P-800、 400、200、100、50、20、10和5，昭和电工株式会社制造)在HPSEC中的 保留时间，制作分子量相对于保留时间系数(Kav)的校准曲线，且根据被检 测试样的保留时间求出分子量。另外，HPSEC的条件例如可按如下方式进行 设定。

柱：Asahi-pak GS710和Asahi-pak GS620(各为0.76i.d.(内径)×60cm) (昭和电工株式会社制造)的联用柱

送液装置；JASCO PV-980(日本分光株式会社(JASCO Corporation)制 造)

检测器：Shodex RI SE-62(昭和电工株式会社制造)(灵敏度：×2)

洗脱液：0.2M NaCl(1.0mL/min)

本说明书中，所谓“峰值分子量”是指上述“分子量分布曲线”中的峰 顶对应的分子量。

另外，上述α-葡聚糖组分优选为如下组分：将选自甘蔗提取物或来自甘 蔗的糖蜜中的原料进行乙醇沉淀，经过透析或膜处理从所得到的沉淀中去除 低分子量的物质而获得的组分(也称作“乙醇沉淀组分”)。

乙醇沉淀组分也可以是直接使用甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜而获得的 组分。另外，优选使用如下组分获得：即，将甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜， 通液于作为载体填充了阳离子交换树脂的柱中，通过在以水作为洗脱液时的 上述阳离子交换树脂与各成分之间的亲和力之差进行分级，且在所得到的多 个组分中去除了蔗糖、葡萄糖和果糖的吸收420nm波长的光的组分(也称作 “来自甘蔗的提取物”)。通过采用来自甘蔗的提取物，可更有效地获得乙 醇沉淀组分。

上述α-葡聚糖组分优选为如下组分：即，将上述乙醇沉淀组分通液于作 为载体填充了阴离子交换树脂的柱中，用低离子强度的洗脱溶剂洗脱吸附于 上述阴离子交换树脂的成分而获得洗脱组分，进而对该洗脱组分进行凝胶过 滤而获得的组分。

上述α-葡聚糖组分优选为如下组分：即，将上述乙醇沉淀组分，通液于 作为载体填充了以水进行平衡化的阴离子交换树脂的柱中，用100mM的 NH₄HCO₃洗脱吸附于上述阴离子交换树脂的成分而得到洗脱组分，进而将所 述洗脱组分通液于截留分子量(MWCO)2×10³～4×10⁵Da的凝胶过滤柱， 最初流出的相当于空隙体积的量的组分。

上述多糖也可以是以杂聚糖作为主要成分，峰值分子量在38400～57600 的范围内以及664000～996000的范围内，并在总构成糖组分中葡萄糖占有的 比率为30％～50％、阿拉伯糖占有的比率为20～30％、且非还原末端阿拉伯 糖占有的比率为20～30％的多糖(下面也称为“杂聚糖组分”)。由此，能 够起到更优良的派伊尔淋巴集结活性作用。

上述杂聚糖组分，优选为从上述乙醇沉淀组分中获得的组分。此时，上 述乙醇沉淀组分，优选使用上述来自甘蔗的提取物而获得的组分。

上述杂聚糖组分优选为如下组分：即，将上述乙醇沉淀组分通液于作为 载体填充了阴离子交换树脂的柱中，用高离子强度的洗脱溶剂洗脱吸附于上 述阴离子交换树脂的成分而得到的组分。

上述杂聚糖组分，优选由如下组分组成：

将上述乙醇沉淀组分通液于作为载体填充了以水进行平衡化的阴离子交 换树脂的柱中，将吸附于上述阴离子交换树脂的成分用100mM的NH₄HCO₃进行洗脱后用300mM的NH₄HCO₃进行洗脱而得到洗脱组分，进而将所述洗 脱组分通液于截留分子量1×10⁴～1×10⁶Da的凝胶过滤柱，除了最初流出的 相当于空隙体积的量的组分以外的组分；以及，

将上述乙醇沉淀组分通液于作为载体填充了以水进行平衡化的阴离子交 换树脂的柱中，将吸附于上述阴离子交换树脂的成分用300mM的NH₄HCO₃进行洗脱后用1.8mM的NH₄HCO₃进行洗脱而得到洗脱组分，进而将所述洗 脱组分通液于截留分子量2×10³～4×10⁵Da的凝胶过滤柱，最初流出的相当 于空隙体积的量的组分。

另外，上述多糖也可以是将选自甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜中的原料 进行乙醇沉淀，经过透析或膜处理从所得到的沉淀中去除低分子量物质而获 得的多糖(相当于“乙醇沉淀组分”)。

由于本发明的派伊尔淋巴集结活化剂具有派伊尔淋巴集结活性作用，因 此也可以用作肠道免疫增强剂。另外，通过肠道免疫增强作用，也可以用作 例如疟原虫感染的预防治疗剂。

本发明的派伊尔淋巴集结活化剂，也可以包含在食品、食品添加物、饲 料、医药品、医药品添加物等中进行使用。

另外，本发明还提供一种疟原虫感染的预防或治疗用药物，其含有本发 明的派伊尔淋巴集结活化剂。

上述疟原虫感染的预防或治疗用药物，也可以与抗疟药联合使用，所述 抗疟药是选自于由奎宁、甲氟喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶、氯喹、伯氨喹、青 蒿琥酯、蒿甲醚和本芴醇所组成的组中的一种或两种以上。优选上述抗疟药 为青蒿琥酯。

本发明也可以提供上述多糖在活化派伊尔淋巴集结中的用途(应用)。 另外，本发明还可以提供派伊尔淋巴集结的活化方法，包括将上述多糖给药 于对象的步骤。

发明效果

基于本发明，能够提供一种新型的派伊尔淋巴集结活化剂。基于本发明， 通过将作为有效成分含有从甘蔗中得到的多糖的药剂给药于动物(例如，口 服)，从而起到例如增强在派伊尔淋巴集结中产生细胞因子(例如，作为骨 髓细胞增殖促进因子的IL-6)的作用。由此，例如，可以通过增强肠道免疫 而增强与生物防御相关的免疫机制。

另外，由于本发明的派伊尔淋巴集结活化剂是从自古以来就一直是人们 食用的甘蔗中得到的物质，因此，也不会损害人或作为人的食品的家畜或家 禽等的产业动物(industrial animal)的健康，因此是安全的。

附图说明

图1是表示试验例1中的派伊尔淋巴集结活性作用试验的结果的图表。

图2是表示制造例1中的多糖组分的分离工序的流程图。

图3是表示实施例1中的派伊尔淋巴集结活性作用试验的结果的图表。

图4是表示实施例2中的IL-6产生诱导试验的结果的图表。

图5是表示实施例3的鼠疟原虫(氯喹敏感株)感染模型中多糖组分的 口服试验结果的图表。

图6是表示制造例1施行的柱色谱中的洗脱的图表。

图7是表示试验例2中的α-葡聚糖组分的分子量分布的HPSEC图。

图8是表示试验例2中的杂聚糖组分的分子量分布的HPSEC图。

图9是表示实施例4的鼠疟原虫(氯喹抗性株)感染模型中多糖组分的 口服试验的结果的图表。

图10是表示实施例5的鼠疟原虫(氯喹抗性株)感染模型中多糖组分与 抗疟药的并用口服试验的结果的图。

具体实施方式

下面，进一步详细说明本发明的实施方式。

本发明的派伊尔淋巴集结活化剂，作为有效成分含有从甘蔗中得到的多 糖。

〔多糖〕

作为从甘蔗中得到的多糖，可以为：

(i)以α-葡聚糖作为主要成分且峰值分子量在720000～1080000的范围 内，在总构成糖组分中葡萄糖占有的比率为80％以上且非还原末端葡萄糖占 有的比率为20～30％以及α1-6键合的葡萄糖占有的比率为15～25％的多糖 (α-葡聚糖组分)；

(ⅱ)以杂聚糖作为主要成分且峰值分子量在38400～57600的范围内以 及664000～996000的范围内，在总构成糖组分中葡萄糖占有的比率为30％～ 50％，阿拉伯糖占有的比率为20～30％且非还原末端阿拉伯糖占有的比率为 20～30％的多糖(杂聚糖组分)；或者，

(ⅲ)将选自甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜中的原料进行乙醇沉淀，经 过透析或膜处理从所得到的沉淀中去除低分子量的物质而获得的多糖(乙醇 沉淀组分)。

更优选α-葡聚糖组分以Glc(葡萄糖)换算的糖含量为80质量％～90质 量％。另外，优选以GalA(半乳糖醛酸)换算的糖醛酸含量为5质量％以下。 优选以胎牛免疫球蛋白换算的蛋白质含量为10质量％以下。并且，优选在总 构成糖组分中α-葡聚糖组分的葡萄糖占有的比率为75％～90％。

对α-葡聚糖组分而言，其峰值分子量在720000～1080000的范围内即可， 但优选在810000～990000的范围内，更优选在855000～945000的范围内。 对α-葡聚糖组分而言，优选其分子量分布曲线中的分子量分布范围为16000～ (相当于空隙体积(Vo)的分子量)，更优选为16000～1660000。

更优选杂聚糖组分以Glc换算的糖含量为45质量％～55质量％。另外， 优选以GalA换算的糖醛酸含量为5质量％～10质量％。优选以胎牛免疫球蛋 白换算的蛋白质含量为7.5质量％以下。并且，优选总构成糖组分中杂聚糖组 分的葡萄糖占有的比率为30％～40％，优选阿拉伯糖占有的比率为22.5％～ 27.5％。

杂聚糖组分存在于峰值分子量在38400～57600的范围内和664000～ 996000的范围内的两个部位。优选分子量小的一方的峰值分子量在43200～ 52800的范围内，更优选在45600～50400的范围内。优选分子量大的一方的 峰值分子量在747000～913000的范围内，更优选在788500～871500的范围 内。杂聚糖组分在分子量分布曲线中至少具有两个峰。优选杂聚糖组分在分 子量分布曲线中的分子量分布范围为10000～(相当于空隙体积的分子量)， 更优选为10000～1660000。

〔多糖的制造方法〕

＜乙醇沉淀组分＞

乙醇沉淀组分，可以通过将选自甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜中的原料 进行乙醇沉淀，并经过透析或膜处理从所得到的沉淀中去除低分子量的物质 而获得。作为乙醇沉淀中使用的原料，可以直接使用甘蔗提取物或来自甘蔗 的糖蜜；为了有效获得乙醇沉淀组分，优选使用来自甘蔗的提取物。来自甘 蔗的提取物是，将从甘蔗提取物或来自甘蔗的糖蜜中选出的原料，通液于作 为载体填充了阳离子交换树脂的柱，且作为洗脱液使用水，通过阳离子交换 树脂与原料中所含的各成分之间的亲和力之差(通过洗脱速度之差)得到分 离的多组分中去除了蔗糖、葡萄糖和果糖等低分子糖类的、吸收波长420nm 的光的组分。在透析中，可以使用通常在脱盐中所用的透析膜。另外，在膜 处理中，可以使用在脱盐和单糖类去除等中所用的UF膜(超滤膜)。

对乙醇沉淀组分的收率而言，例如，当使用了提取物时，以提取物中所 含的固体成分作为基准，通常为约5质量％左右。乙醇沉淀组分中，除了多 糖以外还含有聚酚、盐类等成分。

＜提取物＞

下面，说明来自甘蔗的提取物的制造方法。

将甘蔗汁、甘蔗的溶剂抽取液等的提取物、或来自甘蔗的糖蜜(下面， 有时简称为“原料”)，通液于填充有固定载体的柱中。上述原料可以直接 使用或者用水调整为任意浓度后使用。此外，为了去除杂质，优选在用柱进 行处理之前过滤原料。对过滤而言，并没有特别的限定，可优选使用在食品 工业中广泛应用的网式过滤、硅藻土过滤、微滤、超滤等的手段。

作为固定载体使用离子交换树脂的方法的优选方式，为如下所示。

从离子交换性质的观点出发，离子交换树脂可分类为阳离子交换树脂和 阴离子交换树脂，在本发明中优选可使用阳离子交换树脂。更优选可使用强 酸型、钠离子型或钾离子型的阳离子交换树脂。另外，从树脂形态的观点出 发，离子交换树脂可分类为凝胶型树脂、以及多孔型、微多孔型、高多孔型 等多孔质性树脂，但在本发明中优选可使用凝胶型的离子交换树脂。更优选 可使用强酸型、钠离子型或钾离子型的凝胶型阳离子交换树脂。这种离子交 换树脂已在市售中，例如，可以举出：作为Diaion(ダイヤイオン：商标) 系的SK1B、SK104、SK110、SK112、SK116(均为商品名，三菱化学株式 会社制造)、UBK530、UBK550(色谱分离用，均为商品名，三菱化学株式 会社制造)、作为Amberlite(アンバーライト：商标)系的Amberlite IR120B、 IR120BN、IR124、XT1006、IR118、Amberlyst(アンバーリスト)31、色谱 用Amberlite CG120、CG6000(均为商品名，ORGANO(オルガノ)株式会 社)、作为Dowex(ダウエックス：商标)系的HCR-S、HCR-W2、HGR-W2、 Monosphere(モノスフィアー)650C、Marathon(マラソン)C600、50W×2、 50W×4、50W×8(均为商品名、Dow Chemical(ダウ·ケミカル)日本株式 会社制造)、Muromac(ムロマック)50WX(商品名，室町化学工业株式会 社制造)、作为Purolite(ピュロライト：商标)系的C-100E、C-100、C-100×10、 C-120E、PCR433、PCR563K、PCR822、PCR833、PCR866、PCR883、PCR892、 PCR945(均为商品名，AMP·Ionex Corporation(エイエムピー·アイオネ クス株式会社)制造)等。其中，特别优选为UBK系列。

固定载体的量，根据柱的大小、固定载体的种类等而发生变化。相对于 原料的固体成分，优选为2～10000倍，更优选为5～500倍湿润体积量。

将原料通入上述柱中，接着使用水作为洗脱液进行色谱处理，对得到的 多个组分中吸收波长420nm光的组分进行分离提取，从而可获得目的提取物。 有时将该方法称作“离子色谱分离”。在离子色谱分离中，利用因原料中所 含的各成分与离子交换树脂之间的亲和力之差引起的通过柱的速度的不同， 分离各成分。

通液条件根据原料的组成和固定载体的种类等不同而发生变化。作为洗 脱液使用经脱气处理后的水，并采用单塔式批量分离法时，优选流速为SV＝ 0.3～1.0hr^-1、试样的供给量为树脂的1～20％、温度为40～70℃。对采用该分 离法得到的各组分，分析420nm波长光的吸收、电导率(盐分量的尺度)、 蔗糖、葡萄糖和果糖的浓度，若以时间序列示于曲线图中，则示出的峰依次 是波长420nm光的吸收峰、电导率的峰、蔗糖和还原糖的峰。

＜α-葡聚糖组分＞

接着，说明α-葡聚糖组分的制造方法。

在α-葡聚糖组分的提纯(制造)中，优选使用上述乙醇沉淀组分。下面， 以使用乙醇沉淀组分时为例，说明α-葡聚糖组分的提纯方法。

首先，将乙醇沉淀组分通液于作为载体填充了阴离子交换树脂的柱，以 使成分得到吸附。作为阴离子交换树脂，优选为强离子交换树脂。例如，可 以使用具有Q(季铵)基、或QAE基的树脂。作为具有上述载体的柱的具体 例子，可以举出Q-Sepharose Fast Flow(FF)、QAE-Sepharose FF等。这些 树脂载体，优选预先用水进行平衡化。例如，当使用QAE-Sepharose FF时， 通过浸渍于2M的碳酸氢铵中，使QAE基活性化(使反离子的碳酸氢离子键 合于与Sepharose(琼脂糖(凝胶))存在共价键的季铵基上，即形成HCO₃^- 型)，接着用水进行洗涤以去除残留的碳酸氢铵后，调整为水中的悬浮状态 (用水进行平衡化)。

接着，以使离子强度阶段性地变高的方式通液洗脱溶剂，对上述载体上 所吸附的成分进行洗脱。作为洗脱溶剂，优选使用溶解了NH₄HCO₃、 HCOONH₄或NaCl等阴离子盐的水溶液。

α-葡聚糖组分可从用低离子强度的洗脱溶剂进行洗脱而得到的洗脱组分 (组分A)中获得。作为低离子强度的洗脱溶剂，例如，当作为阴离子使用 了HCO₃^-时，可以使用该阴离子浓度为50～150mM的洗脱溶剂，优选为75～ 125mM，更优选为90～110mM，特别优选为100mM。

可对所得到的洗脱组分(组分A)，使用透析膜(例如，Visking tube， MWCO12000～14000)进行透析后，对透析内液进行冷冻干燥后用于下一工 序中。

接着，采用凝胶过滤柱，对上述洗脱组分(组分A)按分子量进行分级。 对α-葡聚糖组分而言，例如，当使用截留分子量2×10³～4×10⁵Da的凝胶过 滤柱时，可以从最初流出的相当于空隙体积的量的组分(空隙组分、Vo组分) (组分A1)中获得。作为截留分子量大约为2×10³～4×10⁵Da左右的凝胶 过滤柱，例如，可以使用Sephacryl S-300、Superose 12等。对α-葡聚糖组分 而言，可以针对凝胶过滤时的洗脱组分，基于糖、糖醛酸和280nm下UV吸 收而制作洗脱曲线，并对相当于上述空隙组分(Vo组分)的组分(组分A1) 进行回收。所得到的组分(组分A1)可以进一步按照通常的方法加以透析后 进行冷冻干燥。

＜杂聚糖组分＞

接着，说明杂聚糖组分的制造方法。

在杂聚糖组分的提纯(制造)中，优选使用上述乙醇沉淀组分。下面， 以使用乙醇沉淀组分时为例，说明杂聚糖组分的提纯方法。

首先，将乙醇沉淀组分通液于作为载体填充了阴离子交换树脂的柱，以 使成分得到吸附。作为阴离子交换树脂，优选为强离子交换树脂。例如，可 以使用具有Q(季铵)基或QAE基的树脂。作为具有上述载体的柱的具体例 子，可以举出Q-Sepharose Fast Flow(FF)、QAE-Sepharose FF等。这些树 脂载体，优选预先用水进行平衡化。例如，当使用QAE-Sepharose FF时，通 过浸渍于2M的碳酸氢铵中，使QAE基活性化(使反离子的碳酸氢离子键合 于与Sepharose存在共价键的季铵基上，即形成HCO₃^-型)，接着用水进行洗 涤以去除残留的碳酸氢铵后，调整为水中的悬浮状态(用水进行平衡化)。

接着，以使离子强度阶段性地变高的方式，通液洗脱溶剂，对上述载体 上所吸附的成分进行洗脱。作为洗脱溶剂，优选使用溶解了NH₄HCO₃、 HCOONH₄或NaCl等阴离子盐的溶液。

杂聚糖组分可从用高离子强度的洗脱溶剂进行洗脱而得到的洗脱组分中 获得。作为高离子强度的洗脱溶剂，例如，当作为阴离子使用了HCO₃^-时， 可以使用该阴离子的浓度为200～2000mM的洗脱溶剂。优选杂聚糖组分是通 过将用250～350mM的洗脱溶剂进行洗脱而得到的洗脱组分(组分B)和用 1600～2000mM的洗脱溶剂进行洗脱而得到的洗脱组分(组分C)分开进行 提纯后再将它们进行组合。

所得到的洗脱组分(组分B和组分C)可以分别使用透析膜(例如，Visking  tube，MWCO12000～14000)进行透析后，对透析内液冷冻干燥后用于下一 工序中。

接着，采用凝胶过滤柱，对上述洗脱组分按分子量进行分级。对组分B 而言，例如，当使用截留分子量1×10⁴～1×10⁶Da的凝胶过滤柱时，对除了 从最初流出的相当于空隙体积的量的组分(空隙组分、Vo组分)以外的组分 (组分B2)进行回收。对组分C而言，例如，当使用截留分子量2×10³～ 4×10⁵Da的凝胶过滤柱时，对最初流出的相当于空隙体积的量的组分(空隙 组分)(组分C1)进行回收。对凝胶过滤时的洗脱组分而言，可以基于糖、 糖醛酸和280nm下UV吸收而制作洗脱曲线，并对上述组分B的除了空隙组 分以外的组分(组分B2)和上述组分C的相当于空隙组分的组分(组分C1) 进行回收。

作为截留分子量大约为1×10⁴～1×10⁶Da的凝胶过滤柱，例如，可以使 用Sepharose CL-6B、Superose 6等。另外，作为截留分子量大约为2×10³～ 4×10⁵Da的凝胶过滤柱，例如，可以使用Sephacryl S-300、Superose 12等。

通过组合分别从组分B和组分C中进行凝胶过滤所得到的组分(组分B2 和组分C1)，可获得杂聚糖组分。所得到的杂聚糖组分可以进一步按照通常 的方法加以透析后进行冷冻干燥。

〔派伊尔淋巴集结活化剂〕

对本发明的派伊尔淋巴集结活化剂的形状，并没有特别的限定，既可以 是液状也可以是粉末状，或者也可以使用通常所用的制剂用载体而制成固体 制剂或液体制剂。这些制剂化的方法是公知的。通过如此操作得到的派伊尔 淋巴集结活化剂，能够以液状或粉末状的方式进行保存。对保存而言，特别 是在液状的情况下，优选为冷藏保存。

当将本发明的派伊尔淋巴集结活化剂制成固体制剂时，例如，可以在作 为有效成分的上述多糖中混入糊精、玉米淀粉或脱脂米糠进行配制。这些制 剂化的方法是公知的。

对本发明的派伊尔淋巴集结活化剂的给药期间，没有特别限定。本发明 的派伊尔淋巴集结活化剂的给药量，根据制剂形态、给药对象的人或非人动 物的种类、健康状况、年龄或成长程度等而有所不同，因此，没有特别的限 定。例如，以换算成作为有效成分的上述多糖计，每1kg体重1天给药1～ 1000mg即可。

对本发明的派伊尔淋巴集结活化剂的给药方式，并没有特别的限定，例 如，可以采用经过口腔、经过肠道和经过鼻腔的方法进行给药。另外，也可 以采用易于储存在口腔内的形状(也包括口香糖等)的方式进行给药。

由于本发明的派伊尔淋巴集结活化剂具有派伊尔淋巴集结活性作用，因 此，也可以用作例如肠道免疫增强剂、肠道免疫调节剂、肠道感染症改善剂、 炎症改善剂、病毒感染症改善剂、细菌感染症改善剂等。特别是，通过肠道 免疫增强作用，也可以用作例如疟原虫感染的预防治疗剂。

〔疟原虫感染的预防或治疗用药物〕

本发明的派伊尔淋巴集结活化剂，可通过肠道免疫增强作用而预防或治 疗疟原虫感染。因此，本发明还可以提供一种作为有效成分含有上述派伊尔 淋巴集结活化剂的疟原虫感染的预防或治疗用药物。

上述疟原虫感染的预防或治疗用药物，通过与现有的抗疟药并用(联合 使用)来获得并用效果。因此，可以通过与现有的抗疟药并用的方式进行使 用。

作为抗疟药，例如，可以举出：奎宁(下式(1)表示的化合物)、甲氟 喹(下式(2)表示的化合物)、磺胺多辛(下式(3)表示的化合物)、乙 胺嘧啶(下式(4)表示的化合物)、氯喹(下式(5)表示的化合物)、伯 氨喹(下式(6)表示的化合物)、青蒿琥酯(下式(7)表示的化合物)、 蒿甲醚(下式(8)表示的化合物)和本芴醇(下式(9)表示的化合物)。 它们可以单独使用一种或组合两种以上使用。

作为抗疟药，从与本发明的疟原虫感染的预防或治疗用药物的并用效果 高的观点出发，优选含有青蒿琥酯。另外，本发明的疟原虫感染的预防或治 疗用医药，更优选以与青蒿琥酯并用的方式使用。

实施例

下面，基于实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明并不局限于这 些实施例。

〔试验例1：基于来自甘蔗的提取物的乙醇沉淀组分进行的派伊尔淋巴集 结活性作用的试验〕

＜来自甘蔗的提取物的制造＞

(基于使用离子交换树脂的单塔式批量分离进行的二级糖蜜(“2番 蜜”)的分级)

将从原糖工场得到的二级糖蜜处理液作为原料，采用离子交换柱色谱进 行分级分离，其中，该离子交换柱色谱是基于使用了FPLC系统(Pharmacia  K.K.(ファルマシア株式会社)制造)的单塔式批量分离法来进行。作为原 料使用的二级糖蜜处理液，是在稀释二级糖蜜之后，用碳酸钠进行清洁处理， 并进行硅藻土过滤而得到。该原料液的分析值是白利糖度(Bx)47.4、糖度 (Pol.)23.2、纯糖率(Purity)48.9、还原糖分3.2％。

在柱中填充了500mL凝胶型的强酸性阳离子交换树脂(商品名为 UBK530，钠离子型，三菱化学株式会社制造)。柱是内径26mm、高度1000mm 的带有流量适配器的柱。通液条件：作为洗脱液使用已脱气的蒸馏水，在流 速SV＝0.5hr^-1(4.17mL/分种)、温度60℃下进行。

将约25mL的原料供给于上述离子交换柱中。分级条件：从供给原料30 分钟后开始回收洗脱液，且每只试管回收3.6分钟(约15mL/只)，总共回收 了30只。

针对所得到的30个组分(组分1～30)，测定了波长420nm的吸光度、 电导率和糖(Sucrose(蔗糖)、Glc(葡萄糖)、Fru(果糖))含量(以各 组分的固体成分质量的合计作为基准的质量％)，并示于图6中。在此，对 吸光度的测定而言，将在2mL的0.5mM磷酸缓冲液(pH7.5)中加入0.1mL 各组分得到的液体作为测定试样。对电导率的测定而言，将用蒸馏水将各组 分稀释至0.5％得到的液体作为测定试样。糖含量是通过使用了HPLC的通常 的方法进行测定。

对所得到的30个组分，按如下方式进行汇集而得到试样1～8。

试样1：组分3和4。

试样2：组分5和6。

试样3：组分7和8。

试样4：组分9和10。

试样5：组分11和12。

试样6：组分13和14。

试样7：组分15和16。

试样8：组分17～30。

此外，组分1和2由于基本上没有被洗脱的成分，因此废弃掉。

将各试样冷冻干燥过夜而形成粉末。将所得到的0.25g冷冻干燥粉末溶 解于0.5mM磷酸缓冲液(pH7.5)并使其达到100mL，测定了波长420nm下 的吸光度，并示于下表1中。试样8的吸光度为0.86、比较高，其原因在于 其中集合了拖尾(tailing reducer)成分。相对于其它试样是各将两组分合并 而成的试样，试样8是合并14个组分而成的试样。因此，虽然420nm的吸 光度高，但回收该组分的效率差。

将各试样的分析结果示于下面的表1中。表1中的电导灰分是根据电导 率与已知的硫酸灰分之间关系的校准曲线求出系数且进行计算而得到的数 据。表1中，冷冻干燥固体成分的分配比率是各试样的固体成分质量相对于 全部试样的固体成分的合计质量之比(％)。电导灰分和各糖(Sucrose、Glc、 Fru)的含量，是相对于各试样的固体成分质量之比(质量％)。根据各糖 (Sucrose、Glc、Fru)的含量可知：试样1～3相当于非糖分组分，试样4～ 8相当于糖分组分。在此所述的糖分是指单糖和蔗糖。

表1

基于离子交换树脂进行的二级糖蜜分级试样的分析值

(基于使用了离子交换树脂的模拟移动床式柱色谱进行的分离)

在原糖工场中，通过结晶罐回收2次蔗糖结晶，通过离心分离去除结晶 获得“振蜜(母液)”即二级糖蜜，并将其作为原料，通过使用了填充有阳 离子交换树脂的分离塔的模拟移动床式连续分离法，进行了离子交换柱色谱 分离。

由于从原料的配制至离子交换色谱分离的工序是连续进行的，因此，各 工序的溶液中的固体成分浓度、组成会随着时间推移有一些变化，但下面的 浓度、组成是在稳定运行中的测定值。

二级糖蜜的白利糖度(Bx.)为约85。该浓度对实施柱光谱处理而言是高 的，因此稀释至白利糖度约50。在其中添加消石灰、碳酸钠以使杂质发生凝 集，并进行了硅藻土过滤。所得到的滤液的白利糖度47.3、糖度(Pol.)23.6、 纯糖率(Purity)49.9、还原糖分2.5％。将滤液用作离子交换色谱法中的原料。

实施了离子交换色谱法，该离子交换色谱法是基于作为阳离子交换树脂 使用了UBK530(三菱化学株式会社制造)的模拟移动床式连续分离法进行。 填充了树脂的分离塔被分割为8个部分，每个塔的树脂量为6.5m³。每过规定 时间切换原料液和洗脱液(水)的供给位置以及蔗糖组分和非蔗糖组分的抽 出位置，由此连续进行了供给、抽出。稳定时的既定值：供给流量3m³/小时、 洗脱水流量13.5m³/小时、非蔗糖组分抽出流量12.13m³/小时、蔗糖组分抽出 流量4.37m³/小时、切换时间267秒。通过该色谱处理，使蔗糖组分和非蔗糖 组分得到了分离。它们分别相当于图6中的组分10～17(蔗糖组分)、以及 组分1～9和组分18～30(非蔗糖组分)合并而成的组分。对蔗糖组分而言， 蔗糖固体成分含量为约87％(基于HPLC分析)且白利糖度为约35，该组分 与清净汁混合后被送回本工序中，再次进行回收蔗糖的操作。另外，对所得 到的非蔗糖组分而言，蔗糖含量为约0.3％(基于HPLC分析)且白利糖度为 约8。将该非蔗糖组分通过浓缩罐进行浓缩，使其达到白利糖度40.0、糖度 (Pol.)2.3、纯糖率(Purity)5.8、还原糖含量5.4％。将该非蔗糖组分作为 来自甘蔗的提取物。为了用于后面的试验，将来自甘蔗的提取物冷冻干燥处 理过夜。将所得到的0.25g冷冻干燥粉末，用0.5mM磷酸缓冲液(pH7.5)形 成100mL溶液，测定了波长420nm下的吸光度。吸光度是1.11。

＜乙醇沉淀组分的配制＞

在来自甘蔗的提取物(冷冻干重：418.57974g)中加入纯净水并使总量 达到500mL，在进行搅拌的同时加入4倍量的乙醇，在室温下搅拌过夜。施 行离心分离(6000rpm、4℃、30分钟)，将所得到的沉淀用流水和纯净水进 行透析(7天)，对非透析性组分进行冷冻干燥，由此得到乙醇沉淀组分(也 称为“SCE-4”)(收获量为20.11g，收率为4.8％)。

＜糖链分解SCE-4的配制＞

将乙醇沉淀组分(SCE-4)(50.45mg)溶解于50mM醋酸盐缓冲液 (pH4.5,30mL)中后，加入含有100mM的NaIO₄的50mM醋酸盐缓冲液 (10mL)，在4℃、暗处搅拌96小时进行高碘酸氧化。在反应溶液中加入乙 二醇(1mL)在室温下搅拌1小时，使过量的NaIO₄分解。接着，使用纯净 水对反应混合物透析2天，对透析内液进行了减压浓缩。并且，加入NaBH₄(180mg)在室温下搅拌12小时，通过滴加醋酸进行了中和。进一步，使用 纯净水对上述反应液透析3天后，通过冷冻干燥透析内液获得高碘酸氧化物 (糖链分解SCE-4)(收获量为31.99mg、收率为62.76％)。

＜脱木质化SCE-4的配制＞

将乙醇沉淀组分(SCE-4)(50.59mg)溶解于4％醋酸水溶液(50mL) 中，然后加入NaClO₂(250mg)，在70℃的水浴中搅拌了40分钟。将反应 液在冰冷条件下使用3M的NaOH进行了中和。将反应液通过流水透析过夜 后，使用纯净水透析4天，通过冷冻干燥透析内液获得了脱木质素多糖组分 (脱木质化SCE-4)(收获量：22.39mg、收率：44.14％)。

＜小鼠派伊尔淋巴集结细胞的配制和培养＞

使用异氟烷(Escain吸入麻醉剂，Mylan制药(マイラン製薬)株式会 社制造)对C3H/HeJ小鼠施行安乐死后，使用眼科用剪从小肠切出派伊尔淋 巴集结。将该派伊尔淋巴集结，置于冰冷过的、加入了含有5％胎牛血清(FBS) 的RPMI1640培养基(2mL)的灭菌培养皿中，且使用5mL的一次性注射器 的内筒的橡胶部在不锈钢筛网(200目)上进行压碎，以使派伊尔淋巴集结细 胞游离。将该细胞悬浮液移入50mL的Falcon tube(猎鹰牌试管)中，采用 涡流搅拌机进行了短时间的搅拌。将该细胞悬浮液通过不锈钢筛网(150目) 过滤后，进行离心分离(1500rpm、4℃、7分钟)，通过倾析培养基得到了 派伊尔淋巴集结细胞。对该细胞使用含FBS的RPMI1640培养基(10mL)重 复同样的操作共计4次，洗涤细胞后，通过不锈钢筛网(200mesh)进行了过 滤。使用该细胞悬浮液(20μL)通过细胞计数器进行细胞计数后，使用含FBS 的RPMI1640培养基配制了1～2×10⁶cells/mL的派伊尔淋巴集结细胞悬浮 液。

在96孔培养板(3072，FALCON(商标))中添加派伊尔淋巴集结细胞 悬浮液(180μL/well)和多糖试样溶液(20μL/well，多糖最终浓度为100μg/mL、 50μg/mL和10μg/mL)，在5％CO₂-95％空气、37℃下培养了2～6天。将培 养上清液移入其它96孔培养板中，在使用前保存于－20℃下。作为对照，采 用了以注射用水(20μL/well)代替多糖溶液加入而培养得到的培养上清液。

＜小鼠骨髓细胞的配制＞

对C3H/HeJ小鼠(7周龄、雌性)使用异氟烷施行安乐死后，摘出大腿 骨，使用安装了23G注射针的5mL注射器，借助于含FBS的RPMI1640培 养基(5mL)将骨髓细胞从大腿骨中推出从而进行了采集。采用涡流搅拌机 将该骨髓细胞进行分散后，通过不锈钢筛网(200目)进行过滤，接着离心分 离(1200rpm、4℃、7分钟)，回收了骨髓细胞。重复同样的操作3次并洗 涤细胞后，将骨髓细胞悬浮于含FBS的RPMI1640培养基(10mL)中，用细 胞计数器进行细胞计数后，使用含FBS的RPMI1640培养基配制成骨髓细胞 悬浮液(5×10⁵cells/mL)。

＜派伊尔淋巴集结活性作用试验＞

在96孔培养板中加入派伊尔淋巴集结细胞培养上清液(50μL/well)、骨 髓细胞悬浮液(5×10⁵cells/mL、100μL/well)和含FBS的RPMI1640培养基 (50μL/well)，在5％CO₂-95％空气、37℃下培养了6天。在已培养的骨髓细 胞培养悬浮液中，添加Alamer Blue(20μL/well，Biosource公司)，在 5％CO₂-95％空气、37℃下培养6～24小时后，将产生的荧光物质量通过荧光 读板机(Infinite M200，激发波长为544nm，测定波长为590nm，Tecan(帝 肯)公司制造)进行测定，将所得到的相对荧光强度即增殖骨髓细胞数，作 为骨髓细胞增殖促进因子量。

＜统计学检验＞

实施例中的所有结果均表示为平均值±S.D.。对照和被检测试样间的统计 学显著性是在ANOVA检验后通过Fisher的PLSD进行了检验。

<结果>

图1中示出了派伊尔淋巴集结活性作用试验的结果。将骨髓细胞增殖促 进因子量作为派伊尔淋巴集结活性作用进行示出。在乙醇沉淀组分(SCE-4) 中，已确认有派伊尔淋巴集结活性作用。另一方面，在分解SCE-4的糖链而 成的物质(糖链分解SCE-4)中，活性锐减至与对照相比没有显著性的水平。 另外，在将SCE-4进行脱木质化而成的物质(脱木质化SCE-4)中，已确认 有活性。该结果暗示了来自甘蔗的提取物中的乙醇沉淀组分(SCE-4)的含有 多糖的成分，包含显示派伊尔淋巴集结活性作用的物质。

〔制造例1：α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的配制〕

＜乙醇沉淀组分的配制＞

与试验例1同样地进行操作，获得了来自甘蔗的提取物。在来自甘蔗的 提取物(冷冻干重：418.57974g)中加入纯净水并使总量达到500mL，在进 行搅拌的同时加入4倍量的乙醇，在室温下搅拌过夜。施行离心分离 (6000rpm、4℃、30分钟)，将所得到的沉淀用流水和纯净水进行透析(7 天)，对非透析性组分进行冷冻干燥，由此得到了茶褐色乙醇沉淀组分(SCE-4) (收获量为20.11g，收率为4.8％)。

＜α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的配制＞

按照图2所示的流程图，从乙醇沉淀组分(SCE-4)配制了α-葡聚糖组 分(图2中“组分A1”)和杂聚糖组分(图2中“组分X”)。

将SCE-4(5.0g)添加于QAE-Sepharose FF(5.5i.d.×26cm)并进行通液 后，将已吸附的成分，依次使用100mM的NH₄HCO₃(6L)、300mM的NH₄HCO₃(10L)和1.8M的NH₄HCO₃(10L)阶段性地进行了洗脱。将分级组分使用 透析膜(Visking tube，MWCO12000～14000)进行透析后，对透析内液进行 冷冻干燥，获得了分级组分(组分A、组分B和组分C)。

组分A(100mM的NH₄HCO₃洗脱组分)：0.86g，17.2％。

组分B(300mM的NH₄HCO₃洗脱组分)：0.66g，13.2％。

组分C(1.8M的NH₄HCO₃洗脱组分)：1.04g，20.8％。

(α-葡聚糖组分)

将组分A添加于用0.2M的NaCl溶液进行了平衡化的Sephacryl S-300 (2.6i.d.×90cm)后，使用0.2M NaCl进行了洗脱。按照基于采用通常方法测 定的相对糖含量、相对糖醛酸含量、280nm的UV吸收而制成的洗脱曲线， 对洗脱组分回收了分级组分。将空隙(Vo)洗脱组分作为α-葡聚糖组分(图 2中“组分A1”)，获得了白色冷冻干燥粉末(收获量为0.2166g、收率为 4.3％)。

(杂聚糖组分)

将组分B通过用0.2M的NaCl溶液进行了平衡化的Sepharose CL-6B (2.6i.d.×90cm)进行分级，获得了中间产物(intermediate)组分(图2中“组 分B2”)(收获量为0.02141g、收率为0.41％)。

另一方面，将组分C通过用0.2M的NaCl进行了平衡化的Sephacryl S-300 (2.6i.d.×90cm)进行分级，获得了空隙(Vo)洗脱组分(图2中“组分C1”) (收获量为0.16395g、收率为3.28％)。

将组分B2和组分C1合并作为杂聚糖组分，获得了白色冷冻干燥粉末(图 2中“组分X”)(收获量为0.1842g、收率为3.68％)。

〔试验例2：α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的分析〕

＜分子量分布的测定＞

将被检测试样(α-葡聚糖组分和杂聚糖组分)的分子量分布，通过使用 了Asahipak GS710和Asahi-pak GS620(各0.76i.d.×60cm)(昭和电工)的 联用柱的高速凝胶过滤色谱法(HPSEC)进行了分析。分子量是采用下述方 法求出：根据标准多糖(pullulan P-800、400、200、100、50、20、10和5， 昭和电工株式会社制造)在HPSEC中的保留时间，制作分子量相对于保留时 间系数(Kav)的校准曲线，且根据被检测试样的保留时间求出分子量。

HPSEC的条件如下所述。

送液装置；JASCO PV-980(日本分光株式会社(JASCO Corporation)制 造)

检测器：Shodex RI SE-62(昭和电工株式会社制造)(灵敏度：×2)

洗脱液：0.2M NaCl(1.0mL/min)

＜比色定量＞

总糖量采用苯酚-硫酸(H₂SO₄)法进行测定，糖醛酸量采用间羟基联苯 法进行测定，蛋白质量采用考马斯亮蓝法(Bradford法)进行测定。作为样 本，苯酚-硫酸法中采用了Glc(葡萄糖)，间羟基联苯法中采用了GalA，考 马斯亮蓝法(Bradford法)中采用了牛丙种球蛋白(Bio-Rad公司制造)。

＜糖的构成分析＞

采用TMS甲基糖苷法进行糖的构成分析。

将单糖的标准品混合物(Glc、Gal(半乳糖)、GlcA(葡萄糖醛酸)、 GalA、Ara(阿拉伯糖)、Fuc(岩藻糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、 Rha(鼠李糖)，各5μg)和被检测试样(各50～100μg)分取于13mm螺口 试管中，进而加入肌醇(myo-inositol)溶液(内标：20μL，1mg/mL)后，对 溶剂进行完全的减压蒸除。各试管中加入1M的盐酸-甲醇溶液(HCl-MeOH 溶液)(100～300μL，和光纯药工业株式会社制造)，在密封条件下进行甲 醇分解(80℃、15小时)。在反应溶液中加入叔丁醇(ter-BuOH)(5μL)， 在氮气气流下(40℃)蒸除溶剂后，加入Tri-Sil试剂(100μL，Pierce(商标： 皮尔斯))，在密封条件下进行了反应(80℃、20分钟)。在氮气气流下(40℃) 将试剂蒸除后，在反应生成物中加入己烷(2mL)且进行几秒超声波处理， 由此提取了TMS衍生物。通过离心分离(2000rpm、4℃、5分钟)去除提取 物中的不溶解物后，在氮气气流下(40℃)蒸除溶剂，且采用气相色谱法(GLC) 分析了所得到的TMS衍生物的己烷溶液。各单糖衍生物的鉴定，是从与标准 品衍生物的保留时间的比较开始实施，且含量比(mol.％)是根据峰面积和每 个实验中各获得的各单糖衍生物对FID检测器的响应系数求出。

GLC的条件如下所述。

设备：HP5890系列II气相色谱仪(gas chromatograph)(惠普(Hewlett  Packard)公司)

柱；DB-1毛细管柱(capillary column)(0.25mm i.d.×30m，液膜厚度 0.25μm，J&W Scientific Inc.)

载气：He(总流量为80mL/min、柱入口压为21psi、气体纯度为99.9999％)

注入口温度：250℃

检测器温度：280℃

烘炉温度程序：60℃(1分钟)，60℃→170℃(30℃/min)，170℃→190℃ (1℃/min)，190℃→300℃(30℃/min)，300℃(5分钟)

＜甲基化分析＞

如下所示地，用于分析糖键合方式的甲基化分析，是按照对箱守法 (Hakomori's method)和Waeghe等方法加以改变的方法来施行。

(使用甲基亚磺酰负碳离子钠的多糖的甲基化)

取被检测试样(500μg)置于螺口试管(15i.d.×100mm)中，在干燥器 中减压干燥过夜之后，加入无水二甲亚砜(dry DMSO，西格玛(Sigma)公 司)，在氮气气流的密封条件下进行超声波处理15分钟，以50～60℃温度 进行加温直至试样完全溶解(几小时～一昼夜)。在试样溶液中加入甲基亚 磺酰负碳离子钠(500μL)，在氮气气流下超声波处理1小时之后，在室温下 反应3小时。反应后，采用少量的反应液(5～10μL)，通过三苯甲烷试剂(和 光纯药工业株式会社)，确认了过量甲基亚磺酰负碳离子钠的残留。当甲基 亚磺酰负碳离子钠不足时，进一步添加甲基亚磺酰负碳离子钠，并重复上述 操作直至甲基亚磺酰负碳离子钠过量残留为止。在冷冻反应混合液后，添加 CH₃I(碘甲烷，特级，1mL，柳岛制药株式会社)，在氮气气流的密封条件 下超声波处理15分钟，在室温下反应4小时以上。反应结束后，对反应液中 的CH₃I进行减压蒸除，并在冰冷条件下进行冷冻，添加与使用的DMSO和 甲基亚磺酰负碳离子的总量相同量的纯净水，使残留的甲基亚磺酰负碳离子 进行分解，并使反应停止。并且，在反应液中加入饱和Na₂S₂O₃(约250μL～) 直至反应液黄色消失。

(完全甲基化多糖的回收)

将C18胶柱(Sep-Pak C18 Cartridge)(1mL，Waters Associate Inc.)使 用蒸馏乙醇(10mL×4)、接着使用水(2mL×3)进行洗涤后，使上述甲基 化反应混合液通过上述胶柱体(Cartridge)以使甲基化多糖吸附于柱体中。 使用50％DMSO(2mL×5)、接着使用水(2mL×5)洗涤柱体后，使用蒸馏 乙醇(2mL×3)洗脱甲基化多糖，然后，通过减压干燥固化获得了完全甲基 化的多糖。

(甲基化多糖中的糖醛酸的羧基的还原)

通过如下所示的方法，将完全甲基化多糖中的糖醛酸残基的羧基还原成 氘化伯醇。即，将完全甲基化多糖试样用95％乙醇(0.21mL)和四氢呋喃(THF， 0.51mL)进行溶解后，加入重硼氢化钠(NaBD₄，1.8mg)进行混和，然后在 室温下反应18小时以上，进而在70℃下加温1小时，由此还原了羧甲基。 使用醋酸对反应液进行中和，进而加入7～8滴醋酸使反应停止。将反应溶液 进行减压干燥固化后，为了去除所生成的硼酸，至少重复4次在反应生成物 中加入蒸馏甲醇(1mL)进行减压干燥固化的操作。针对该反应混合物的 50％DMSO溶液，与“(完全甲基化多糖的回收)”一栏部分所述的方法同 样地进行操作，回收了羧基还原完全甲基化多糖。

(从完全甲基化多糖向部分甲基化糖醇醋酸酯体的衍生化和分析)

将所得到的羧基还原完全甲基化多糖，通过在螺口试管(15i.d.×100mm) 中使用2M的三氟乙酸(TFA，1mL)在密封且121℃条件下加热1小时，从 而进行水解。反应结束后，将冷却至室温的反应溶液进行减压干燥固化，进 而在干燥器中减压干燥30分钟，由此去除了残留的TFA。将所得到的水解物 溶解于95％乙醇(蒸馏乙醇、1mL)中，添加7～8滴25％的氨水使其达到氨 碱性后，加入过量的硼氢化钠(NaBH₄)，在室温下反应4小时以上。在反 应液中滴加醋酸溶液，对残留的NaBH₄进行分解后，进一步加入7～8滴， 通过减压干燥固化来蒸除溶剂。通过重复4次在反应生成物中加入甲醇(1mL) 并减压干燥固化的操作，去除了所生成的硼酸。将反应生成物置于干燥器中 而减压干燥1小时后，加入醋酸酐，在密封且121℃条件下加热反应3小时， 由此进行了乙酰化。将反应溶液放置至室温后，加入甲苯(1mL)进行混和， 在40℃、空气气流条件下去除了醋酸酐。在反应生成物中加入水(1mL)和 CHCl₃(2mL)进行液－液分配，并进行离心分离(4℃、2500rpm、5分钟) 后，抽吸去除了上层的水层。进而，使用水(1mL)对CHCl₃层洗涤4～5次 左右后，减压蒸除CHCl₃，获得了部分甲基化糖醇醋酸酯衍生物。在如下所 示的条件下使用气相色谱法(GLC)和气相色谱法/质量分析(GLC-MS)， 对该衍生物进行了分析。甲基化糖醇醋酸酯的鉴定，是通过与样本的碎片离 子的比较和与相对于四甲氧基二醋酸半乳糖醇酯 (2,3,4,6-tetra-OMe-1,5-di-OAc-galactitol)的相对保留时间的比较来进行。甲 基化糖的构成摩尔比(mol.％)是根据峰面积和相对于FID的响应系数来求出。

GLC：

装置：HP5890系列II气相色谱仪(gas chromatogragh)(惠普(Hewlett  Packard)公司)

毛细管柱：SP-2380 capillary column(0.25mmi.d.×30m，液膜厚度0.25μm， SPELCO/ALDRICH公司)

载气：He(总流量为80mL/min、柱入口压为10psi、气体纯度为99.9999％)

注入口温度：250℃

检测器：250℃

烘炉温度：60℃(1分钟)，60℃→150℃(30℃/min)，150℃→250℃ (1.5℃/min)，250℃(1分钟)

MS：

质谱仪(Mass spectrometer)：HP5970B质量选择检测器(mass selective  detector)(70eV，280℃)

<结果>

将α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的分析结果示于表2和表3中。另外，将 α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的分子量分布的测定结果示于图7和图8中。

表2

表3

α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的糖键合方式

如表2和图7所示，α-葡聚糖组分的峰值分子量为90万，分子量分布于 16000～相当于空隙(Vo)体积的分子量(约1660000)的范围。对α-葡聚糖 组分而言，构成糖中葡萄糖占有的比率为约84％。如表2和图8所示，杂聚 糖组分的峰值分子量有两个，分别为4.8万和83万。分子量分布于10000～ 相当于空隙体积的分子量(约1660000)的范围。对杂聚糖组分而言，构成 糖中葡萄糖占有的比率为约32％、阿拉伯糖占有的比率为约25％。α-葡聚糖 组分和杂聚糖组分均是作为主要成分含有糖的多糖组分。

如表3所示，α-葡聚糖组分的特征在于，含有非还原末端的葡萄糖约25％、 α-6键合的葡萄糖(6键合)约20％的高含量。杂聚糖组分的特征在于，含有 非还原末端的阿拉伯糖约22％。

〔实施例1：派伊尔淋巴集结活性作用试验〕

使用试验例2中配制的α-葡聚糖组分(组分A1)和杂聚糖组分(组分X) 以及试验例1中配制的脱木质化SCE-4和乙醇沉淀组分(SCE-4)，与试验 例1同样地进行了派伊尔淋巴集结活性作用试验。

图3中示出了派伊尔淋巴集结活性作用试验的结果。将骨髓细胞增殖促 进因子量作为派伊尔淋巴集结活性作用来示出。α-葡聚糖组分(组分A1)和 杂聚糖组分(组分X)在所有的添加量(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)中， 其派伊尔淋巴集结活性作用的显著性都高于脱木质化SCE-4，示出了与乙醇 沉淀组分(SCE-4)匹敌的派伊尔淋巴集结活性作用。

作为原料的来自甘蔗的提取物，含有大量盐类，乙醇沉淀组分(SCE-4) 的收率为约5％。另外，乙醇沉淀组分(SCE-4)是混合有各种多糖的组分， 也含有木质素成分。因而呈现茶褐色，由于难以粉末化，所以加工特性差， 有涩味。另一方面，由本实施例所得到的α-葡聚糖组分和杂聚糖组分是白色 无味的粉末，因此易于加工。

〔实施例2：α-D-(1→6)-葡聚糖结构对派伊尔淋巴集结活性作用的参 与〕

＜α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的酶消化＞

在α-葡聚糖组分(1.5mg)或杂聚糖组分(1.5mg)的25mM的醋酸盐缓 冲液(pH4.5,1mg/mL)溶液中，加入exo-α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (arabinofuranosidase)(20μL)、exo-β-D-(1→3)-半乳聚糖酶(galactanase) (20μL)和endo-β-D-(1→4)-半乳聚糖酶(5μL)，在37℃、2天的条件下 进行了酶反应。将所得到的消化物在沸水浴中加热处理了30秒以使酶失活。 对该酶反应液(图4中表示为“1,3/1,4-半乳聚糖酶”)的一半量，再加入葡 聚糖酶(dextranase)(0.25单位(unit))在2天37℃下培养后，在与上述 同样的条件下使酶失活，获得了酶反应液(图4中表示为“葡聚糖酶”)。 将这些反应液在使用之前保存于-20℃。

＜IL-6产量的测定＞

与试验例1同样地进行了小鼠派伊尔淋巴集结细胞的配制和培养。

(酶免疫测定法(ELISA))

在ELISA用板(Immuno-Maxisorp，Nunc)中，分注用50mM的碳酸盐- 碳酸氢盐缓冲液(carbonate-bicarbonate buffer)(pH9.6)稀释至1μg/mL的抗 小鼠IL-6一抗(原发抗体)(100μL/well(加样孔))，在4℃下培养了一昼 夜。将该板用含0.05％的Tween20的磷酸缓冲化生理盐水(PBST) (300μL/well)洗涤3次后，使用含1％脱脂乳(SM)的PBST(SM-PBST) (100μL/well)在37℃下培养了1小时。将板用PBST(300μL/well)洗涤4 次后，加入1％SM-PBST(50μL/well)在室温下预培养10分钟，接着加入派 伊尔淋巴集结培养上清液(50μL/well)，在4℃下培养过夜。将板用PBST (300μL/well)洗涤3次，使用1％SM-PBST(100μL/well)在室温下预培养 了10分钟。进而在板中加入用1％SM-PBST稀释的生物素(biotin)标记抗 IL-6二抗(二级抗体)(1：100050μL/well)，在37℃下培养1小时后，用 PBST(300μL/well)洗涤了3次。将板用1％SM-PBST(100μL/well)在室温 下进行预培养10分钟后，加入用1％SM-PBST稀释的碱性磷酸酶(alkaline  phosphatase)标记链霉抗生物素蛋白(streptavidin)(1：1000100μL/well) 在37℃下培养了1小时。将板用PBST(300μL/well)洗涤5次后，加入基质 溶液(substrate solution)[对硝基苯磷酸二钠(disodium p-nitrophenyl phosphate) 的10％二乙醇胺缓冲液(diethanolamine buffer)(pH9.8)溶液(1mg/mL， 150μL/well)，在室温下进行了培养。采用微量板阅读仪(Multiskan JX，Thermo  Electron Corp.)，测定了显色的黄色(测定波长为405nm、空白波长为492nm)。

<结果>

已经明确了作为派伊尔淋巴集结活性作用的骨髓细胞增殖促进因子之 一，与IL-6有关系。图4中示出了IL-6产生诱导试验的结果。对脱木质化 SCE-4而言，与对照相比，显著增加了IL-6的产量(图4中“脱木质化 SCE-4”)。确认了在α-葡聚糖组分(图4中的组分A1)和杂聚糖组分(图 4中的组分X)也有增强IL-6产生的功能(图4中的α-葡聚糖组分和杂聚糖 组分的“未处理”)。另外，即使经过1,3/1,4半乳聚糖酶处理，也未降低α- 葡聚糖组分和杂聚糖组分的增强IL-6产生活性。这表明，活性表达所需的结 构并不是它们的半乳聚糖。另一方面，施行半乳聚糖酶处理后进行葡聚糖酶 处理后，在α-葡聚糖组分中活性降低至与对照相同水平。另外，杂聚糖组分 中，活性也在浓度50μg/mL的情况下降低。葡聚糖酶具有对α-1,6-键合的三 糖以上的葡聚糖结构进行识别并切断的活性。因此，带有这种糖链结构的多 糖，被包含于α-葡聚糖组分和杂聚糖组分中，并暗示有助于增强IL-6产生的 活性。此外，当单独添加右旋糖酐(葡聚糖)进行试验时，在IL-6产量上未 确认到有变化(未示出数据)。

〔实施例3：鼠疟原虫(氯喹敏感株)感染模型中多糖组分的口服试验〕

将制造例1中配制的α-葡聚糖组分和杂聚糖组分以及乙醇沉淀组分 (SCE-4)用作多糖组分，进行了鼠疟原虫感染模型中多糖组分的口服试验。

＜伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)N(氯喹敏感株)感染模型＞

基于鼠疟原虫的感染实验，是通过日本北里大学·北里生命科学研究所· 热带病评价中心·实验动物中心分室实施。动物实验是依照有关法律以及来自 相关政府部门的通告等所规定的、(学)北里研究所制定的实验动物使用安 全卫生管理规定来执行。

ICR小鼠(20g前半)，从日本查尔斯河试验室株式会社(Charles River  Laboratories Japan,Inc.)购入，在室温23±2℃、湿度55±10％、照明时间9小 时/天的规定条件下预备饲育1周后提供给实验。

鼠疟原虫的保持是通过反复进行如下操作来实施，即，将冷冻鼠疟原虫 Plasmodium berghei N(伯氏疟原虫N)(氯喹敏感株)对ICR小鼠进行腹腔 内给药(200μL/小鼠)从而使其感染，在感染几天后进行心脏采血，对其它 小鼠(4～5只)进行尾静脉给药(200μL/小鼠)感染。

原虫感染红细胞按如下方式进行配制。即，选择感染效率好的小鼠，在 戊巴比妥麻醉下进行心脏采血，制作了血液涂抹标本。通过使用了QuickIII 染色试剂盒(astradiagnosics)或Hemacolor(商标)(Merck公司)的简易吉 姆萨氏染色法，对涂抹标本进行染色，求出了感染率(寄生虫血症(Parasitemia) ％)。采集的血液，以注射用生理盐水进行稀释，通过血细胞计数器对红细 胞数进行计数，乘以感染率求出了感染红细胞数。作为感染红细胞悬浮液， 以达到1×10⁵或1×10⁷cells/mL的方式用生理盐水进行稀释后，以200μL/只 小鼠(mouse)进行了尾静脉给药。

小鼠感染鼠疟原虫的实验是通过如下方式来进行：对雄性ICR小鼠，从 尾静脉进行静脉注射2×10⁴个细胞(cells)的P.berghei N感染红细胞(0.2mL/ 只小鼠)。

＜对感染模型小鼠进行多糖的口服＞

对ICR小鼠连续几天口服α-葡聚糖组分(图5中的组分A1)和杂聚糖组 分(图5中的组分X)以及SCE-4，是使用经口探针以500μL/只小鼠的用量 来实施。乙醇沉淀组分(SCE-4)的给药量设定为600mg/kg/天(day)，另外， α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的给药量各设定为28mg/kg/天和22mg/kg/天。α- 葡聚糖组分和杂聚糖组分的给药量是，根据收率计算分别相当于SCE-4的 600mg/kg/天的量。另外，作为对照只用水进行了口服给药。给药是从原虫感 染7天前开始，且在疟原虫感染后也继续给药。

＜鼠疟原虫的感染率的计算＞

从感染3天后开始从小鼠的尾采集血液，制作了血液涂抹标本。涂抹标 本的染色是通过使用了QuickIII染色试剂盒(astradiagnosics)或Hemacolor (商标)(Merck公司)的简易吉姆萨氏染色法来进行染色。对涂抹标本滴 加油浸用油，按表4所示的标准，在显微镜(ORIMPUS BX40)下进行了观 察。

表4

感染率 计数的视场直径(field number) 超过20％ 3视场 超过10％且20％以下 5视场 超过2％且10％以下 10视场 超过0.05％且2％以下 20视场 0.05％以下 50视场

另外，红细胞的感染率(寄生虫血症)根据下式求出。

数学式1：

<结果>

图5中示出了鼠疟原虫感染模型中的多糖组分的口服试验结果。以乙醇 沉淀组分(SCE-4)进行给药的小鼠中，在第4天和第5天，与对照相比感染 率明显降低了。另外，尽管给药量与SCE-4相比约为1/20、即明显少，但在 以α-葡聚糖组分(图5中的组分A1)和杂聚糖组分(图5中的组分X)进行 给药的小鼠中，与对照相比，在第4天和第5天的感染率也明显降低了(图5 中显示有Fisher的LSD检验中的p值)。进而，以α-葡聚糖组分进行给药的 8只小鼠中有5只在第6天也继续有作用效果。根据以上试验，确认了乙醇沉 淀组分(SCE-4)示出的相对于疟原虫感染的防御作用是通过所含的α-葡聚 糖和杂聚糖来予以表达的。另外，本实施例中的结果表明：对α-葡聚糖组分 和杂聚糖组分而言，尽管给药量比SCE-4少(约为1/20)，但具有与SCE-4 基本相同程度或稍微超过SCE-4程度的对疟原虫感染的防御作用。因此，通 过增加α-葡聚糖组分和杂聚糖组分的给药量，能够表达出明显高于SCE-4的 防御作用。

〔实施例4：鼠疟原虫(氯喹耐药株)感染模型中多糖组分的口服试验2〕

将制造例1中配制的乙醇沉淀组分(SCE-4)用作多糖组分，进行了鼠疟 原虫感染模型中多糖组分的口服试验。

＜约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)NS感染模型＞

作为鼠疟原虫采用了Plasmodium yoelii NS(氯喹耐药株)，在通过尾静 脉给药进行原虫感染后，立刻将氯喹(氯喹二磷酸盐(Chloroquine diphosphate  salt)水溶液)以60mg/kg/只小鼠的用量，对小鼠进行了皮下给药以保持耐受 性原虫。从尾静脉进行静脉注射的感染红细胞数为2×10⁶cells。其它与实施 例3的＜Plasmodium berghei N感染模型＞同样地进行了操作。

＜对感染模型小鼠进行多糖的口服＞

对ICR小鼠连续几天口服SCE-4，是使用经口探针以500μL/只小鼠的用 量来实施。设定SCE-4的给药量为600mg/kg/天。作为对照只用水进行了口 服给药。给药是从原虫感染7天前开始，且在疟原虫感染后也继续给药。

＜鼠疟原虫的感染率的计算＞

与实施例3同样地进行了操作。

<结果>

图9中示出了口服试验的结果。以乙醇沉淀组分(SCE-4)进行给药的小 鼠中，在第4天和第7天，与对照相比，感染率明显降低了(Fisher的LSD 检验中的p值均为p＜0.001)。

〔实施例5：鼠疟原虫(氯喹耐药株)感染模型中多糖组分与抗疟药的并 用口服试验〕

通过鼠疟原虫感染模型中的口服试验，试验了将制造例1中配制的乙醇 沉淀组分(SCE-4)用作多糖组分且与抗疟药青蒿琥酯(Artesnate，简写为 AN)并用的效果。

＜约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)NS感染模型＞

除了从尾静脉进行静脉注射的P.yoelii NS感染红细胞数设为2×10⁶个细 胞来代替2×10⁴个细胞以外，与实施例4同样地进行了操作。

＜对感染模型小鼠进行多糖和AN的口服＞

对ICR小鼠连续几天口服SCE-4和AN，是使用经口探针以500μL/只小 鼠的用量来实施。SCE-4的给药量设为600mg/kg/天；AN以含0.5％Tween(吐 温)80的10％的二甲亚砜(dimethyl sulfoxide(DMSO))水溶液进行溶解、 给药，其给药量设为3mg/kg/天。SCE-4的给药是从原虫感染7天前开始，且 在疟原虫感染后也继续给药。AN的给药是从原虫感染2小时后开始，且继续 给药至疟原虫感染后第3天(计4次)。另外，SCE-4是在AN给药后至少 间隔3小时以上的时间进行给药。

针对对照群进行了水和含0.5％Tween80的10％DMSO水溶液的口服；针 对AN3群进行了水和AN的含0.5％Tween80的10％DMSO水溶液的口服； 针对SCE-4+AN3群进行了SCE-4水溶液的口服和AN的含0.5％Tween80的 10％DMSO水溶液的口服。

＜鼠疟原虫的感染率的计算＞

与实施例3同样地进行了操作。

<结果>

图10中示出了口服试验的结果。以AN进行给药的AN3群中，在第4 天和第5天，与对照群相比感染率明显降低(Dunnett检验中的p值分别为p ＜0.001和p＝0.0024)。以SCE-4和AN并用的SCE-4+AN3群中，在第4 天和第5天，与对照群相比感染率明显降低(Dunnett检验中的p值分别为p ＜0.001和p＝0.0002)；另外，其作用效果在第6天时还在持续(Dunnett检 验中的p值，p＝0.0047)。根据该结果明确可知，通过并用SCE-4和AN， 增强了对疟原虫感染的防御作用。上述情况表明：SCE-4的作用与以往的抗 疟药(AN)作用之间没有冲突(没有竞争)。因此，SCE-4可以用作出现了 耐药株的抗疟药的替代药或者与现有的抗疟药并用。