作为TARP-γ8依赖性AMPA受体拮抗剂的6-((S)-1-{1-5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮

摘要

描述了下式(I)的TARP-γ8依赖性AMPA受体拮抗剂：

说明书

癫痫困扰全球超过五千万人，30-40%的接受治疗的患者对现有药物疗法耐药，只有大约8%的接受治疗的患者保持无癫痫发作。癫痫通常在患者具有两次或更多次无端癫痫发作时确诊。国际抗癫痫联盟（ILAE）将癫痫发作定义为“由大脑中的异常过度或同步神经元活动引起的征兆和/或症状的瞬时出现”。癫痫发作被认为具有许多潜在因果关系，这增加了治疗癫痫的难度。癫痫发作已根据它们的临床表现划分，包括全身癫痫发作（失神发作、失张力性发作、强直阵挛性发作（大发作）和肌阵挛发作）、简单和复杂部分发作型癫痫发作、痴笑癫痫发作、流泪性癫痫发作（dacrystic seizures）和癫痫持续状态。现有疗法以各种机制为靶，包括GABA（γ-氨基丁酸）受体激动、T-型钙通道阻滞剂、钠通道调节剂、突触囊泡蛋白SV2A调节和GABA转氨酶的抑制剂。更最近，AMPA受体拮抗剂也已被研究用于治疗癫痫发作。

AMPA（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑-丙酸）受体是中枢神经系统中的兴奋性突触的突触后膜上的谷氨酸敏感离子通道并在很大程度上负责介导跨过突触间隙的快速神经传递。AMPA受体拮抗剂是已知的抗惊厥剂，它们的下调兴奋性神经传递的能力对它们的抗癫痫治疗潜力是关键的。但是，由于AMPA受体活性在CNS中如此普遍，全身拮抗影响CNS的大部分区域，以造成不合意的作用，如共济失调、镇静和/或眩晕，这是所有已知的全身AMPA受体拮抗剂共有的特点。这些全身拮抗剂通常具有极窄的治疗剂量范围，意味着获得抗惊厥活性所需的剂量与观察到不合意作用的剂量接近或重叠（Michael A. Rogawski. "Revisiting AMPA Receptors as an Antiepileptic Drug Target" Epilepsy Currents 11.2 (2011).）。

透膜AMPA受体调节蛋白（TARPs）是相当最近发现的蛋白质家族，其已被发现与AMPA受体的活性相关联并调节AMPA受体的活性。几种TARPs在大脑中相当区域专一，以造成AMPA受体活性的生理分化。例如，TARP γ2（stargazin）依赖性AMPA受体主要位于小脑和大脑皮层中，TARP γ8依赖性AMPA受体主要位于海马体中，这一区域与癫痫发作开始和/或扩散尤其相关。已经理论推定，靶向独立的TARPs能够选择性调节特定的大脑回路而不全面影响突触传递。（Gill, Martin B.和Bredt, David S., Neuropsychopharmacology 36(1): 362-363 (2011).）。

左乙拉西坦（(S)-2-(2-氧代吡咯烷-1-基)丁酰胺）、加巴喷丁（2-[1-(氨基甲基)环己基]乙酸）、托吡酯（2,3:4,5-双-O-(1-甲基亚乙基)-β-D-吡喃果糖氨基磺酸酯）和卡马西平（5H-二苯并[b,f]氮杂?-5-甲酰胺）是目前主要的癫痫发作治疗药物。目前批准的药物无一看起来完全通过AMPA受体的调节发挥作用。

他仑帕奈（talampanel）（(8R)-7-乙酰基-5-(4-氨基苯基)-8,9-二氢-8-甲基-7H-1,3-间二氧杂环戊烯并[4,5-h][2,3]苯二氮?）、selurampanel（BGG492）（N-[7-异丙基-6-(2-甲基-2H-吡唑-3-基)-2,4-二氧代-1,4-二氢-2H-喹唑啉-3-基]甲磺酰胺）和parampanel（5'-(2-氰基苯基)-1'-苯基-2,3'-联吡啶-6'(1'H)-酮）是作为抗癫痫药测试的全身（非TARP依赖性/非选择性）AMPA受体拮抗剂。

在此表明，选择性的非竞争性TARP γ8依赖性AMPA受体拮抗剂是有效的抗癫痫发作/抗癫痫治疗剂，而没有全身（非TARP依赖性/非选择性）AMPA拮抗剂或与小脑中的AMPA受体拮抗更有关的TARP γ2依赖性AMPA拮抗剂的副作用（例如镇静、共济失调和/或眩晕）。

本发明提供表现出强力和选择性的体外TARP γ8-依赖性AMPA受体拮抗活性以及在癫痫发作和疼痛的动物模型中的效力的化合物。因此，本发明提供据信可用于治疗癫痫患者的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的化合物。此外，本发明的化合物也可用于治疗疼痛。更特别地，本发明提供式I的化合物

I

（即6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮）或其可药用盐。

在本发明的另一方面中，提供包含式I的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。此外，本发明的这一方面提供用于治疗癫痫患者的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的药物组合物，其包含式I的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂、载体或稀释剂。此外，本发明的这一方面提供包含式I的化合物或其可药用盐、作为抗癫痫药的第二治疗剂，例如左乙拉西坦、加巴喷丁、托吡酯或卡马西平，和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

本发明还提供治疗患有癫痫的哺乳动物的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的方法，其包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的式I的化合物或其可药用盐。在本发明的这一方面的另一实施方案中，该方法进一步包括在同时、分开或相继组合中给予作为抗癫痫药的第二治疗剂，例如左乙拉西坦、加巴喷丁、托吡酯或卡马西平。在这些治疗方法的一个特定实施方案中，该哺乳动物是人类。

本发明还提供用于治疗的式I的化合物或其可药用盐。在这一方面内，本发明提供用于治疗患有癫痫的哺乳动物，特别是人类的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的式I的化合物或其可药用盐。此外，本发明的这一方面提供与抗癫痫药，例如左乙拉西坦、加巴喷丁、托吡酯或卡马西平同时、分开或相继组合用于治疗患有癫痫的哺乳动物，特别是人类的癫痫发作的式I的化合物或其可药用盐。

本发明的另一方面提供式I的化合物或其可药用盐在用于制备用于治疗患有癫痫的哺乳动物，特别是人类的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的药物中的用途。此外，本发明提供式I的化合物或其可药用盐在用于制备用于治疗患有癫痫的哺乳动物，特别是人类的癫痫发作，例如简单和/或复杂部分发作型癫痫发作和/或原发和/或继发性全身癫痫发作的药物中的用途，其中所述药物与作为抗癫痫药的第二治疗剂，例如左乙拉西坦、加巴喷丁、托吡酯或卡马西平同时、分开或相继组合给药。

本发明的再一方面提供用于治疗疼痛的药物组合物，其包含式I的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明的另一方面提供治疗哺乳动物的疼痛的方法，其包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的式I的化合物或其可药用盐。在这种治疗方法的一个特定实施方案中，该哺乳动物是人类。

本发明的另一方面提供用于治疗疼痛，特别是人类的疼痛的式I的化合物或其可药用盐。

本发明的另一方面提供式I的化合物或其可药用盐在用于制备用于治疗疼痛的药物中的用途。

本发明的化合物具有碱性和酸性部分并相应地与许多有机和无机酸和碱反应以形成可药用盐。本发明的化合物的可药用盐被认为在本申请的范围内。本文所用的术语“可药用盐”是指对活生物体基本无毒的本发明的化合物的任何盐。此类可药用盐和它们的常用制备方法是本领域中公知的。参见例如P. Stahl等人, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS:  PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008)；和S.M. Berge等人, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, 1977年1月。

本文所用的缩写如下定义：

“AMPA”是指α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑-丙酸。

“Brine”是指饱和NaCl。

“CHO”是指中国仓鼠卵巢。

“CTZ”是指环噻嗪。

“DCM”是指二氯甲烷。

“DMEM是指Dulbecco’s Minimum Eagle’s培养基。

“DMSO”是指二甲亚砜（如果用于NMR，全氘化 [d6]）。

“ED₅₀”是指产生观察到的最大效应的50%的剂量。

“Eq”是指摩尔当量。

“EtOAc”是指乙酸乙酯。

“EtOH”是指乙醇。

“FLIPR”是指荧光成像读板仪。

“HBSS”是指Hank’s缓冲盐溶液。

“HEPES”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。

“HPLC”是指高压液相色谱法。

“hr.”或“h”是指一或多个小时。

“IC₅₀”是指实现最大抑制的50%的浓度。

“LCMS”是指液相色谱质谱联用。

“MeOH”是指甲醇。

“min.”或“m”是指分钟。

“MS”是指质谱法或质谱。

“p.o.”是指口服，经口。

“PTZ”是指戊四唑。

“RT”是指保留时间。

“S.C.”是指皮下。

“SEM”是指平均值的标准误差。

“TARP”是指透膜AMPA受体调节蛋白。

“THF”是指四氢呋喃。

“VCD”是指振动圆二色谱。

“XRPD”是指x-射线粉末衍射。

一般化学

本发明的化合物可通过本领域中公知的和理解的一般方法制备。这些方案的步骤的合适反应条件是本领域中公知的，且溶剂和共试剂的适当替代在本领域技术范围内。同样地，本领域技术人员会认识到，可以视需要或要求通过各种公知技术分离和/或提纯合成中间体，并且各种中间体通常可以在几乎或完全不提纯的情况下直接用于后续合成步骤。此外，技术人员会认识到，在一些情况中，基团的引入顺序不重要。

在下列示例性制备和实施例中，通常在减压下除去溶剂（蒸发）。在一些程序中，所示收率是通过蒸发或过滤分离并且不经进一步提纯就直接使用的产物的代表性粗收率。

制备1: 6-乙酰基-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮

将碳酸铯（1.5 Eq；310.5毫摩尔；101.1克）添加到6-乙酰基-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（40.0克，207毫摩尔）在二甲基甲酰胺（690毫升）中的溶液中。逐滴加入氯甲基甲基醚（1.3 Eq，269毫摩尔，20.4毫升）并在室温下搅拌18小时。转移到分液漏斗中，加入EtOAc（1升），用水（2x200毫升）、然后盐水（200毫升）洗涤。用DCM（300毫升）反萃。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。该浓缩物在200毫升己烷/EtOAc（75:25）中制浆，并过滤产生白色固体形式的6-乙酰基-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（37.0克，156毫摩尔，75%收率）。LCMS(低) rt=1.68 min.,  M+1=238。

制备2: 6-[1-羟基-1-(1-四氢吡喃-2-基-1H-吡唑-5-基)乙基]-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（非对映体的外消旋混合物）

将1-四氢吡喃-2-基-吡唑（1.5 Eq，202毫摩尔，30.8克）（Aldrich）和THF（900毫升）添加到火焰干燥的2升三颈圆底烧瓶中并冷却到-78℃（干冰/丙酮浴）。逐滴加入叔丁基锂（2.5 M在THF中）（1.5 Eq，202毫摩尔；81.0毫升），保持至少-68℃，并在-78℃下搅拌60分钟。经45分钟逐滴加入6-乙酰基-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（32.0克，134毫摩尔）在THF（450毫升）中的溶液并在-78℃下搅拌30分钟。移除干冰浴，使其升温到-50℃并搅拌1小时。（不让温度升到-45℃以上）。用MeOH（80毫升）淬灭该反应。转移到分液漏斗中，加入EtOAc（2000毫升）并用水（500毫升）、然后盐水（500毫升）洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩以产生粗制黄色油。通过HPLC提纯该材料，用己烷/EtOAc（6:4）洗脱以产生白色泡沫形式的6-[1-羟基-1-(1-四氢吡喃-2-基-1H-吡唑-5-基)乙基]-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（44克，113毫摩尔，84%收率）（非对映体的外消旋混合物）。LCMS(低) rt=1.76 min., M+1= 288和rt=1.86 min., M+1= 288。

制备3: 3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙烯基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮

将三氟乙酸（20 Eq（摩尔），2.26摩尔，170毫升）添加到6-[1-羟基-1-(1-四氢吡喃-2-基-1H-吡唑-5-基)乙基]-3-(甲氧基甲基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（44克，113毫摩尔）在DCM（0.2 M，8.81摩尔，565毫升）中的溶液中并在室温下搅拌整夜（~16小时）。浓缩所得深紫色反应混合物，将其溶解在EtOAc（2升）中并通过缓慢添加饱和碳酸氢钠水溶液来中和该溶液。转移到分液漏斗中并萃取到EtOAc中，用水（300毫升）、然后盐水（300毫升）洗涤。经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过HPLC提纯该材料，用EtOAc/己烷（1:1）洗脱以产生黄色稠油形式的3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙烯基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（30克，104毫摩尔，92%收率）。LCMS (低) 所需产物峰在rt=1.82 min., M+1= 288。

制备4: 3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮

将5%钯/碳（15克；7.0毫摩尔）添加到N₂吹扫的烧瓶中并加入EtOAc（250毫升）。以在EtOAc（250毫升）中的溶液形式加入3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙烯基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（29克，101毫摩尔）。在真空下脱气并经气囊装入氢气。搅拌整夜，在压力下排空过量氢气并用N₂吹扫。经硅藻土过滤并浓缩产生黄色稠油形式的3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（27克，93毫摩尔；92%收率）。材料可以不经进一步提纯就进入下一步骤。LCMS(低) rt=1.73 min., M+1=290。

制备5: 2-氟-5-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基]吡啶

将碳酸铯（3 Eq，53.05毫摩尔；17.2克）添加到2-氟-5-羟基吡啶（2.0克，1.00 Eq，17.68毫摩尔）在二甲基甲酰胺（0.3 M；762.37毫摩尔；59.0毫升）中的溶液中，接着加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃（17.7毫摩尔，3.7克）并在室温下搅拌整夜。转移到分液漏斗中并加入EtOAc（500毫升）。洗涤有机层，用水（300毫升）、接着盐水（200毫升）洗涤。经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过HPLC提纯粗制混合物，用己烷/EtOAc 7/3洗脱以产生浅黄色油形式的2-氟-5-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基]吡啶（3.9克，16.2毫摩尔；91%收率）。LCMS(低) rt= 1.8 min., M+1=242。

制备6: 3-(甲氧基甲基)-6-{1-[1-(5-{2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基}吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]乙基}-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（非对映体的外消旋混合物）

将3-(甲氧基甲基)-6-[1-(1H-吡唑-5-基)乙基]-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（7.7克，26.6毫摩尔）溶解在二甲基甲酰胺（0.2 M；133毫升）中。加入叔丁醇锂（（1.5 Eq在THF中的1.00摩尔溶液），39.9毫摩尔；39.9毫升））并搅拌15分钟。加入2-氟-5-[2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基]吡啶（2.00 Eq；53.2毫摩尔；12.8克）。将该反应在油浴中加热到140℃并用N₂吹扫以除去THF。将该混合物在回流下加热5小时。将该混合物冷却到室温并用饱和氯化铵淬灭。萃取到EtOAc（2x200毫升）中，用水（2x100毫升）、接着盐水（200毫升）洗涤。经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过HPLC（二氧化硅）提纯，用40% EtOAc/己烷洗脱以产生浅黄色油形式的3-(甲氧基甲基)-6-{1-[1-(5-{2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基}吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]乙基}-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（10克；19.6毫摩尔，74%收率）。LCMS (低) rt= 2.6, M+1= 511。

实施例1: 6-(1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮，外消旋物

将3-(甲氧基甲基)-6-{1-[1-(5-{2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基}吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]乙基}-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（140毫克，274.18微摩尔）溶解在三氟乙酸（0.05 M；73毫摩尔；5.5毫升）中并在回流下（~72℃）在N₂下加热2小时。（在大约10分钟后和在70℃下观察到橙色）。将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。将残留物溶解在THF（0.05 M；67毫摩尔，5.5毫升）中，加入28%氢氧化铵（0.2 M；9.9毫摩尔；1.4毫升)并在室温下搅拌~1小时。用EtOAc（100毫升）稀释，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过在25g硅胶柱上的液相色谱法提纯，用60-80%EtOAc/己烷梯度洗脱以产生白色泡沫形式的6-(1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（80毫克；209微摩尔；76%收率）。LCMS(低) rt 1.8 min., M+1 =383。

实施例2: 6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（异构体1）

将6-(1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（330毫克）溶解在MeOH（3.0毫升）和DCM（2.5毫升）中并通过手性色谱法（使用Chiralcel? OJ-H（2.1x15 cm, 5 μm柱, Chiral Technologies Europe）、用40% MeOH/液体CO₂, 70 mL/min.洗脱，在225 nm下检测，每个流程注入300微升等分试样）拆分成对映体。合并含有分离的对映体的级分并在真空下浓缩以提供非晶白色固体形式的异构体1（150毫克）和异构体2（169毫克）。分析手性色谱法（使用Chiracel? OJ-H（4.6 x 150 mm, 5 μm柱, Chiral Technologies Europe），用40% MeOH/液体CO₂, 5 mL/min.洗脱，在225 nm下检测）表征rt = 2.03分钟的异构体1和rt = 2.66分钟的异构体2。LCMS (低): 异构体1 rt 1.8 min., M+1 = 383；异构体2, rt 1.8 min., M+1 = 383。

结晶:形式I:

将6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（异构体1）（56.9毫克）溶解在1:1 EtOH:庚烷（3.0毫升）中，在70℃下搅拌20分钟。该溶液在热的同时过滤并分成二等份；将其中之一在环境温度下转移到管瓶中，加盖并在5℃下搅拌整夜。通过过滤回收固体并在氮气下干燥产生晶型I（23.9毫克，84%收率）。

通过单晶x-射线晶体学确认异构体I的绝对立体化学是6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮。

X-射线粉末衍射

在配有CuKa源（λ=1.54056 ?）和Vantec检测器并在35 kV和50 mA下运行的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRPD图。在4°至40° 2θ之间以0.0087° 2θ的步长和0.5秒/步的扫描速率并以0.6 mm发散狭缝、5.28mm固定防散射狭缝和9.5 mm检测器狭缝扫描样品。将干粉装在石英样品支架上并使用载玻片获得光滑表面。结晶学领域中公知的是，对于任何给定晶型，衍射峰的相对强度可能由于由晶体形态和习性之类的因素造成的择优取向而变。如果存在择优取向效应，峰强度改变但多晶型物的特征峰位置不变。参见例如The U. S. Pharmacopeia 33 - National Formulary 28 Chapter <941> Characterization of Crystalline Solids by X-ray Powder Diffraction (XRPD) Official，2010年10月1日- 2011年2月1日。此外，结晶学领域中还公知的是，对于任何给定晶型，角峰位置可能轻微改变。例如，峰位置可由于分析样品时的温度或湿度、样品位移或内标的存在与否而移动。在本情况下，2θ的± 0.2的峰位置变化性考虑到这些可能的变化，而不阻碍所示晶型的明确识别。可基于特征峰（以°2θ为单位），通常更突出峰的任何独特组合确认晶型。基于在8.85°和26.77 °2θ的NIST 675标准峰调节在环境温度和相对湿度下采集的晶型衍射图。

6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（异构体1）的特征在于使用CuKa辐射的XRPD图具有如下表1中所述的衍射峰（2θ值）。具体而言，该图含有在15.81的峰以及选自16.62、14.39、14.05、11.54和10.99的一个或多个峰，衍射角公差为0.2度。

表1: 6-((S)-1-{1-[5-(2-羟基-乙氧基)-吡啶-2-基]-1H-吡唑-3-基}-乙基)-3H-1,3-苯并噻唑-2-酮（异构体1）形式1的X-射线粉末衍射峰

峰角度 (2-θ°)强度(%)15.44827.8521310.9944411.5434514.0575614.3926715.81100816.6227920.2281021.61161122.6981223.41141325.05151426.2491528.4081635.0811

在体外和在动物研究中生成的数据证实TARP γ8依赖性AMPA受体拮抗剂，特别是本发明的化合物在癫痫发作的治疗中的作用。具体发现，本发明的化合物在大鼠戊四唑（PTZ）诱发的癫痫发作模型中选择性地强效拮抗TARP γ8依赖性AMPA受体并防止癫痫发作。本发明的化合物还在福尔马林诱发的小鼠疼痛模型中表现出镇痛活性。

为进一步证实本发明的化合物的特征，可以在下列体外和体内检测中使用化合物：

FLIPR拮抗剂功能测定

通过比较化合物对CHO-S细胞中与海马体富集的TARP（TARP γ-8）或小脑富集的TARP（TARP γ-2）共表达的AMPA GluA1 flop同种型受体亚基的活性，证实AMPA受体拮抗剂化合物的TARP亚型选择性。通过将上述活性与CHO-S细胞中在不存在共表达的TARP的情况下表达的AMPA GluA1 flip同种型受体亚基的活性进行比较，证实AMPA受体拮抗剂化合物的TARP依赖性。

简言之，CHO-S (Invitrogen)细胞在50/50定制培养基中悬浮生长至1x10⁷个细胞/毫升的密度。（50/50定制培养基是作为CD CHO培养基（Gibco #10743）和定制完全培养基的l:1（v/v）混合物制成的低钙培养基）。通过将0.40 mg/L环庚三烯酚酮、5.00 mg/L胰岛素、20 mM HEPES和0.075% Pluronic? F68添加到定制基础培养基中，制备所述定制完全培养基，其中所述定制基础培养基具有下列配方：（除非另有规定，值以mg/L表示）11.01无水氯化钙、0.050硝酸铁-9H₂O、0.420硫酸亚铁-7H₂O、28.64无水氯化镁、48.84无水硫酸镁、312.14 KCl、5505.96 NaCl、62.57磷酸二氢钠、71.28无水磷酸氢二钠、0.432硫酸锌-7H₂O、10.0乙醇胺HCl、6000 D-葡萄糖（右旋糖）、0.210 DL硫辛酸、0.081腐胺2 HCl、4.78次黄嘌呤钠、220.24丙酮酸钠、0.730胸苷、8.90 L-丙氨酸、211.23 L-精氨酸HCl、15.02 L-天冬酰胺H₂O、13,31 L-天冬氨酸、62.67胱氨酸2 HCl、7.360 L-谷氨酸、146.16 L-谷氨酰胺、30.0 gylicine、42.04 L-组氨酸HCl 2 H₂O、105.11 L-异亮氨酸、105.11 L-亮氨酸、146.16 L-赖氨酸HCl、30.03 L-蛋氨酸、66.07 L-苯丙氨酸、17.27 L-脯氨酸、42.04 L-丝氨酸、95.1 L-苏氨酸、16.02 L-色氨酸、104.11 L-酪氨酸二钠盐、94.1 L-缬氨酸、8.99 氯化胆碱、4.00叶酸、12.61 I肌醇、4.00烟酰胺、4.00吡哆醛HCl、0.031吡哆醇HCl、0.400核黄素、4.00泛酸钠、4.00硫胺素HCl、0.680维生素B12和2200碳酸氢钠）。细胞以1000 x g离心15分钟并以2x10⁶个细胞/毫升再悬浮在新鲜50/50定制培养基中。对于分批转染，每升细胞使用2毫克总DNA。对于CHO-S细胞的GluA1-γ8转染，人GluA1Qflop-Cacng8-pBudCE4.1 DNA（Qiagen）和人EAAT3 pAN104 DNA（Qiagen，谷氨酰胺转运体）以2:3的比率混合。对于CHO-S细胞的GluA1- γ2转染，使用人GluA1Qflop-Cacng2-pBudCE4.1（Qiagen）。对于CHO-S细胞的GluA1flip转染，使用人GluA1flip pcDNA3.1 DNA（Qiagen）。将DNA(s)和FreeStyle? MAX试剂（Invitrogen cat#16447-500）以10微克总DNA : 10微升FreeStyle? MAX试剂: 1毫升培养基的比例添加到基础定制培养基（见上文）中，以形成DNA复合物。在15分钟后，将适当体积（20% v/v）的DNA复合物添加到制成的细胞培养物中。在48小时后收取瞬时转染的CHO-S细胞并等分冷冻以备稍后使用。在新鲜制备和解冻的细胞等分试样中检验AMPA受体在转染细胞中的功能和药理学。

将表达AMPA受体的冷冻的转染CHO-S细胞解冻并以50,000个细胞/孔接种在384-孔聚-D-赖氨酸涂布板（Becton Dickinson, cat#354663）中的含有5%透析胎牛血清（Gibco, cat# 26400-036）和20 mM HEPES的Dulbecco’s Modified Eagle培养基（DMEM培养基）（Gibco, cat# 11960）中并在37℃下培养整夜。在实验当天，制备两种荧光染料加载缓冲液。Fluo-4 AM染料加载缓冲液由5 μM Fluo-4 AM染料（Molecular Probes, cat# F-14202）在含有20 mM HEPES（pH 7.4）、2.5 mM丙磺舒（Sigma, cat# P8761，防止细胞转运体将染料泵出）和5 nM Pluronic? F-127（分子探针，cat# P3000MP）的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中构成。通过将100毫升含有20 mM HEPES（pH 7.4）和2.5 mM丙磺舒的HBSS添加到一瓶Fluo-4 NW染料（Molecular Probes，高通量包装, cat# F36205）中，制备Fluo-4 NW染料加载缓冲液。在培养的GluA1-γ8和GluA1-γ2 CHO-S细胞中加载Fluo-4 AM染料加载缓冲液并在22℃下培养2小时。在GluA1flip CHO-S细胞中加载Fluo-4 NW染料加载缓冲液并在37℃下培养30分钟，接着在22℃下培养另外90分钟。在细胞开始暴露于化合物之前，除去细胞板中的染料加载缓冲液并加入新鲜的测定缓冲液。测定缓冲液由含20 mM HEPES（pH 7.4）、2.5 mM丙磺舒和4 mM CaCl₂的HBSS构成。通过添加化合物引发该测定，接着在测定缓冲液中用谷氨酸盐（最终浓度 = 45 μM）和环噻嗪（CTZ，最终浓度 = 20 μM）刺激细胞。通过荧光成像读板仪（FLIPR）动态记录细胞内[Ca++]变化。以谷氨酸盐 + CTZ在受试化合物存在下激发的响应与不存在化合物时观察到的作用的百分比表达受试化合物对谷氨酸盐的作用的抑制。使用4参数非线性逻辑方程计算相对IC₅₀。类似地使用表达单独的GluA1flip或GluA1flop-γ2的CHO-S细胞评估化合物以证实TARP依赖性活性和TARP选择性活性。

基本如上所述测定实施例2的化合物并发现在74.5 + 17.8 nM（平均值+ SEM, n=9）的IC₅₀下以大约85.6 + 0.7%（平均值+ SEM, n=9）抑制TARP γ8依赖性GluA1 flop受体的谷氨酸盐 + CTZ激活，但没有抑制无TARP的flip同种型，也没有抑制TARP γ2依赖性GluA1 flop受体（IC₅₀’s > 9260 nM的检测限）。

因此，本发明的化合物的生理学相关剂量预计提供TARP γ8 AMPA受体的显著体内抑制，同时基本不与其它生理学相关受体，例如不依赖TARP的受体或TARP γ2依赖性受体相互作用，因此可用于治疗癫痫发作，同时避免与非TARP-依赖性AMPA受体拮抗剂相关的不合意作用。

大鼠戊四唑(PTZ)诱发的癫痫发作模型:

将试验时的体重为90-110克的雄性Sprague Dawley大鼠（来自Harlan Sprague Dawley. Indianapolis, IN）每笼5只饲养在具有标准光照周期（早6点开灯，晚6点关灯）的大饲育室中，随意进食和进水。动物在试验前在饲育室中饲养至少3天。在试验开始前1小时将动物移到静室中。动物仅使用一次。

取出动物，口服给予10 mL/Kg的受试化合物或媒介物（5% DMSO、10%阿拉伯树胶和0.05% Dow Corning? 1510-US防沫剂）并送回它们的居住笼。在给药后25分钟，将动物放在筛网上并将筛网倒转180度以测试运动损伤。在倒转后60秒如下将动物计分：如果动物攀在筛网上，为0；如果动物挂在筛网底部，为1；如果动物从筛网上掉落，为2。在完成筛网试验后，动物皮下给药1 ml/kg体积的在盐水中的35 mg/kg PTZ。然后将动物置于观察笼中并在PTZ后观察30分钟。阵挛被定义为前肢和/或后肢的阵挛发作，在此期间大鼠表现出翻正（righting）损失。强直发作被定义为存在后肢强直性伸展的翻正（righting）损失。还记录观察期间的致死率。根据观察期间任何时刻的特定发作类型的存在将动物计分。以具有给定发作类型的动物数量报道数据（例如4/5阵挛发作是指5个动物中的4个在观察期间的任何时刻表现出至少一次任何持续时间的阵挛发作）。

基本如上所述在1-10 mg/Kg的剂量范围内测试实施例2的化合物并发现在1.74 mg/Kg的估计ED₅₀下防止大鼠发生PTZ诱发的癫痫发作并在10 mg/Kg剂量下提供100%保护，而没有任何如通过倒转筛网试验测得的观察到的运动损伤。这一数据表明，实施例2的化合物在大鼠癫痫发作模型中有效，因此本发明的化合物可用于治疗癫痫发作，同时避免与非TARP-依赖性AMPA受体拮抗剂相关的不合意作用。

人工福尔马林诱发的疼痛模型

人工福尔马林诱发的疼痛模型公知用于筛选化合物的镇痛性质（Mogil J.S.等人, Heritability of nociception I: Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain 80 (1999) 67-82）。在尺寸大约10 cm x 10 cm x 10 cm的Plexiglas?盒中进行该检测。置于笼子背面的镜子允许不受阻碍地观察注射福尔马林的爪子。将未禁食的雄性小鼠（Harlan (HSD) CD1-Icr）在实验前至少60分钟单独置于隔室中。所有测试在08:00和16:00 hr.之间进行，测试室温保持在21-23℃。在福尔马林激发前的不同时间外周给予（p.o.）多剂受试化合物（3、10和30 mg/kg）、媒介物（5% DMSO在10%阿拉伯树胶、0.05%防沫剂中）和阳性对照（曲马多80 mg/kg，在1% HEC、0.25% Tween 80、0.05%防沫剂中）。用27号针将福尔马林（20微升在0.9%盐水中的5%溶液）皮下注射到左后爪的跖面中。在福尔马林注射后立即开始观察。通过以5分钟为间隔记录各舔舐事件持续的秒数，量化福尔马林诱发的疼痛。在福尔马林注射后60分钟测量疼痛评分。如前所述观察疼痛行为的两个阶段（Wheeler-Aceto, H., Porreca, F.和Cowan, A., The rat paw formalin test: comparison of noxious agents, Pain 40 (1990) 229-238.）。早期在福尔马林注射后立即开始并持续大约5分钟，接着是在10-15分钟之间开始的晚期，通常在福尔马林注射后大约25-40分钟观察到最大响应。在60分钟观察期后，用CO₂、接着颈脱位法处死动物。在对福尔马林试验报道的不同计分参数中，舔舐和啃咬注射爪的总时间被认为最相关（Abbott等人, The formalin test: scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats, Pain 60 (1995) 91-102; Coderre等人, The formalin test: a validation of the weighted-scores method of the behavioral pain rating, Pain 54 (1993) 43-50）.）。早期分数是在第0至5分钟内花费的总舔舐时间（秒）。通过累加在观察期的第15分钟至55分钟花费的总舔舐秒数，获得后期分数。以平均值及平均值的标准误差（+ SEM）呈现数据。通过单因素方差分析（ANOVA）评估数据并通过用于双侧比较的Dunnett "t”检验分析适当的反差。如果P值小于0.05，差异被认为显著。(Abbott, 同上; Coderre, 同上；和Wheeler-Aceto, 同上)。

基本如上所述测试实施例2的化合物并发现显著减轻疼痛行为，由下列剂量响应推导出ED₅₀为2.61 mg/kg：

剂量 (mg/kg p.o.)    总舔舐时间的降低%     S.E.M.

30                             90.0                                3.4%

10                             80.4                                8.6%

3                               53.9                                7.2%。

因此，本发明的化合物可用于治疗疼痛。

尽管可以在没有任何配制的情况下直接给予本发明的方法中所用的化合物，但该化合物通常以包含式I的化合物或其可药用盐作为活性成分和至少一种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物的形式给药。这些组合物可以通过各种途径给药，包括口服、舌下、鼻内、皮下、静脉和肌内。此类药物组合物和它们的制备方法是本领域中公知的。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005)。

该组合物优选以单位剂型配制，各剂含有大约25至大约1000毫克，更通常大约50至大约500毫克，例如大约100毫克的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为单剂用于人类对象和其它哺乳动物的物理分立单位，各单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及至少一种合适的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

式I的化合物通常在宽剂量范围内有效。例如，每日剂量通常落在大约0.3毫克/公斤体重至大约15毫克/公斤体重，更通常大约0.7毫克/公斤体重至大约7.5毫克/公斤体重，例如大约1.5毫克/公斤体重的范围内。在一些情况中在上述范围的下限以下的剂量水平可能已经足够，而在另一些情况中可能使用更大剂量而不造成任何有害副作用，因此上述剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。在一天中分份给予日剂量也可能有利（例如每日两次每次?剂量或每日三次每次1/3剂量）。要理解的是，由医师根据相关情况，包括要治疗的病况、所需给药途径、实际给药的一种或多种化合物、个体患者的年龄、体重和响应及患者症状的严重程度来决定该化合物的实际给药量。

本发明的化合物或其可药用盐，例如在本发明的药物组合物中，预计通过慢性给药以预防癫痫发作和/或通过急性给药以控制或终止进行中的癫痫发作而用于治疗癫痫发作。