莱茵衣藻细胞色素P450一氧化氮还原酶55B1的表达体系及应用

摘要

本发明提供了一种莱茵衣藻细胞色素P450一氧化氮还原酶55B1，所述一氧化氮还原酶55B1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该一氧化氮还原酶55B1由核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因所编码，该基因为CYP55B1基因。本发明构建了莱茵衣藻细胞色素P450一氧化氮还原酶55B1的表达体系，所述的宿主为大肠杆菌BL21，所述的表达载体中定向插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因。本发明克隆了CYP55B1酶的基因，实现了其在大肠杆菌中的大量表达及纯化，得到了有活性的CYP55B1酶,并将其应用于NO的荧光光谱检测。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的原核表达及表 达产物应用于一氧化氮的荧光光谱法检测。

背景技术

莱茵衣藻细胞色素P450(CYP55B1)属于一氧化氮还原酶，即P450nor，被Merchant S S等人2007年于莱茵衣藻中发现，该酶对NO的催化机制如下：

Fe³⁺+NI→Fe³⁺*NO   (1)

Fe³⁺*NO+NAD(P)H→I+NAD(P)⁺   (2)

I+NO+H⁺→Fe³⁺+N₂O+H₂O   (3)

但是目前还没有关于莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的克隆、表达及酶功能应用的报 道。

自1986年NO被证实为血管内皮舒张因子以来,大量研究结果表明，NO是重要的 生物信使分子，对生物体的生理过程起着重要的调节作用，因此，建立快速准确的生物 体系NO测定方法不仅能从本质上揭示某些生理现象，也为探索相关疾病的监控和病理 研究提供技术保障。目前已有大量的直接检测NO的方法，如电子顺磁共振波谱、化学 发光、质谱和荧光已经被应该用于生物体NO的检测。但基于细胞色素P450 55B1荧光 检测NO的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的基因并在大肠杆菌 BL21中进行异源表达、表达产物纯化及NO的荧光检测应用。

本发明所述的莱茵衣藻细胞色素P450一氧化氮还原酶55B1，所述一氧化氮还原酶 55B1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该一氧化氮还原酶55B1由核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的基因所编码，该基因为CYP55B1基因。

本发明构建了莱茵衣藻细胞色素P450一氧化氮还原酶55B1的表达体系，所述的宿 主为大肠杆菌BL21，所述的表达载体中定向插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的 基因。

上述表达体系的构建方法包括以下步骤：(1)CYP55B1基因ORF的扩增：先用touch  down PCR分别扩增CYP55B1基因的5’端序列和3’端序列，再将以上两扩增后的片段 等摩尔量混合，通过重叠PCR扩增CYP55b1基因全长；本发明中根据NCBI中莱茵衣 藻细胞色素P450还原酶CYP55B1的基因的开放阅读框的序列(XM_001700220)，设计 了两对引物P1/P2，P3/P4，所述引物的基因序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示。 其中5’端序列的上游引物P1包含EcoR Ⅰ限制性内切酶位点，3‘端序列的下游引物P4 包含HindⅢ限制性内切酶位点。

(2)表达载体pET28a-55b1的构建

采用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切空载pET-28a以及步骤(1)中的PCR产物CYP55b1 基因，分别回收1200bp的目的条带和5000bp的载体条带；将回收产物目的条带和载体 条带按摩尔比为3:1～10:1的量混合，并用T4连接酶于16℃下连接8h并热击转化大肠 杆菌DH5α，制得pET28a-55b1载体；挑取单克隆，PCR扩增鉴定、用EcoR Ⅰ和HindⅢ 双酶切鉴定及测序鉴定，测序结果正确。

(3)在大肠杆菌BL21细胞中表述上述pET28a-55b1载体。

以上构建成功的载体热击转化到宿主菌大肠杆菌BL21，进行表达，并且纯化得到 了单一的目的蛋白。采用荧光光谱法，将异源表达的莱茵衣藻细胞色素P450 55B1酶用 于NO检测。

所述的一氧化氮还原酶55B1荧光检测NO的方法，包括以下步骤：利用热击转化 方式，用pET28a-55b1载体转化大肠杆菌BL21，挑取阳性单克隆于37℃，180rpm条件 下培养使其OD600为0.6，加入5-氨基酮戊酸，并加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于 28℃诱导表达22h；离心10min后取菌体沉淀，用缓冲液处理后超声破碎8min，破碎 4s停6s，将混合液于4℃下离心12min，上清液采用Ni柱纯化，纯化后的蛋白样液进 行CO差示光谱测定，测得蛋白样液中一氧化氮还原酶55B1的浓度；

在荧光比色皿中加入500μL的蛋白样液，再加入2mL的0.1mol/L的中性的磷酸 缓冲溶液，通氮除氧30min后，固定激发波长为413nm，扫描600～680nm波长范围 的荧光光谱；然后在无氧条件下，加入NO储备液，并扫描光谱；然后进行平行实验， 记录不同NO浓度下对应的光谱强度，得到NO浓度与铁卟啉荧光强度变化的线性关系。

本发明的有益效果在于，本发明首次克隆了cyp55b1基因，构建了一氧化氮还原酶 55B1的原核表达体系，在大肠杆菌BL21中大量表达。此外本发明通过镍柱纯化蛋白而 得到了比较单一的一氧化氮还原酶55B1，基于一氧化氮还原酶55B1建立了NO的荧光 检测法。

附图说明

图1:PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的5’端序列(680bp)结果，Lane 1:Maker  DL2000；Lane 2:PCR扩增产物。

图2:PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1的3’端序列(630bp)结果，Lane 1:Maker  DL5000；Lane 2:PCR扩增产物。

图3:重叠PCR扩增莱茵衣藻细胞色素P450 55B1基因结果(两端带有EcoR Ⅰ和 HindⅢ),Lane 1:Maker DL5000；Lane 2:重叠PCR产物。

图4:重组质粒pET28a-55B1的EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定结果，Lane 1:Maker  DL15000；Lane 2-4:重组质粒pET28a-55B1用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切产物。

图5:重组质粒pET28a-55B1PCR鉴定结果，Lane 1:Maker DL5000；Lane 2-4:重组 质粒pET28a-55B1为模板PCR扩增CYP55B1。

图6:将质粒热击转化BL21后的单克隆PCR鉴定结果，Lane 1:Maker DL5000；Lane 2-6:重组质粒pET28a-55B1热击转化BL21单克隆PCR产物；Lane 7:质粒pET28a热 击转化BL21单克隆PCR产物。

图7:阳性克隆超声破碎SDS-PAGE结果，Lane 1:Protein Marker；Lane 2-4:转化空载 pET-28a的BL21、重组菌诱导8h及22h的上清；Lane5-7:转化空载、重组菌诱导22h及 12h的混合；Lane 8-10:转化空载、重组菌诱导22h及12h的沉淀。

图8:阳性克隆超声破碎western-blot结果，Lane 1、2:转化空载pET-28a的BL21、 重组菌诱导22h的上清；Lane3、4:转化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导22h的混合； Lane3、4:转化空载pET-28a的BL21、诱导22h的沉淀。

图9:重组菌上清样的CO差光谱的测定。

图10:空载转化BL21上清样的CO差光谱的测定。

图11:用High Affinity Ni-charged Resin(GeneScript公司)纯化上清蛋白CYP55B1后 样品的CO差光谱的测定。

图12:High Affinity Ni-charged Resin纯化样品的SDS-PAGE结果，Lane 1:Protein  Maker；Lane 2、3:转化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导8h的上清；Lane 4:流出液；Lane 5:含10mM咪唑的洗脱液；Lane 6-12:含250mM咪唑的洗脱液,分别为E1、E2、E3、E4、 E5、E6、E7、E8。

图13:High Affinity Ni-charged Resin纯化样品的western-blot结果，Lane 1、2:转化 空载pET-28a的BL21、重组菌诱导8h的上清；Lane 3、4:转化空载pET-28a的BL21、 重组菌诱导8h的混合；Lane 5、6:转化空载pET-28a的BL21、重组菌诱导8h的沉淀；Lane 7:含250mM咪唑的洗脱液E5。

图14：NO对CYP55B1铁卟啉荧光的影响(λex＝413nm)，a)不同NO浓度下CYP55B1 的铁卟啉荧光光谱，1：除氧30min后CYP55B1混合液，2-8：加入NO终浓度依次为 6.75uM，11.25uM，15.75uM，22.5uM，31.5uM,40.5uM,54uM。

图15：NO含量与CYP55B1铁卟啉荧光强度的关系。

图16：NO含量与CYP55B1铁卟啉荧光强度的线性关系。

图17：干扰因子对CYP55B1铁卟啉荧光的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限 于以下实施例。

1.莱茵衣藻CYP55B1开放阅读框序列的扩增

由于CYP55B1序列GC含量高达69％，本发明中以KOD-plus酶采用重叠PCR技 术扩增CYP55B1序列。先用step-down PCR分别扩增5’端序列(长680bp)和3’端序 列(长680bp)(图1，图2)，再将以上两片段等摩尔量混合通过重叠PCR扩增CYP55b1 全长(图3)。Step-down PCR反应程序如下：94℃，预变性2min；5个循环(98℃， 10s，68℃，90s)；5个循环(98℃，10s，66℃，90s)；5个循环(98℃，10s，64℃， 90s)；25个循环(98℃，10s，62℃，90s)；68℃，再延伸7min。

2.表达载体pET28a-55B1的构建

用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切实施方式1中的PCR产物CYP55B1和空载pET-28a， 分别回收1200bp的目的条带和5000bp的载体条带。

将回收产物目的条带和载体条带按摩尔比为3:1-10:1的量混合用T4连接酶16℃连 接8h并热击转化大肠杆菌DH5α。

挑取单克隆，用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定及PCR扩增CYP55b1鉴定(图4， 图5，图6)，由金斯瑞测序正确后用于后续实验。

3.细胞色素P450酶活性的测定及蛋白的纯化

将载体pET28a-55b1和空载pET-28a热击转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21， PCR鉴定，挑取鉴定好的单克隆于37℃,180rpm培养使其OD600约为0.6，加入5-氨基 酮戊酸16.8mg，且加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于28℃诱导表达22h。4000g，离 心10min取菌体沉淀，用缓冲液处理后超声破碎8min，破碎4s，停6s，将混合液于4℃， 12000g，离心12min，取上清蛋白液进行CO差示光谱测定(图7，图8),并采用SDS-PAGE 及western-blot分析蛋白样品(图9，图10)。按照High Affinity Ni-charged Resin说明书 对蛋白过镍柱进行纯化，并采用SDS-PAGE及western-blot分析纯化各步骤的蛋白样品 (图11，图12)。纯化后的蛋白浓度采用CO差光谱测定(图13)，并用于后续实验。 4.NO对CYP55B1铁卟啉荧光的影响

1)除氧前：于4mL荧光比色皿中加入500μL的CYP55B1蛋白储备液，再加入2mL 的0.1mol/L(pH7.0)的磷酸缓冲溶液，扫描光谱。固定激发波长为413nm，扫描混合物 的荧光光谱波长范围在600-680nm。

2)除氧中：将比色皿上用自做的橡皮塞塞紧皿口，除氧的管上上接上针头，插入到 比色皿液面的上方，打开氮气阀门，调节气流的大小，观察到气流吹动了液面，通氮30 min。

3)除氧后：将阀门调小，保持氮气氛的情况下，依次加入一定浓度的NO溶液，快 速混匀后，依次进行扫描，并保存图谱。设置固定激发波长413nm，于600～680nm范 围内扫描光谱。无氧条件下，依次加入一定体积的NO储备液(浓度为1.8uM)，扫描 光谱，进行3组平行实验，记录不同NO浓度下对应的光谱强度(图14)，得到NO浓度 与铁卟啉荧光强度变化关系(图15、图16)。

5)干扰实验：

参照4)的实验方法，加入实验所得的使铁卟啉荧光发生明显变化的NO含量等量的 干扰因子CO，GSH，H₂O₂，KNO₃，L-Arg，NaNO₂，抗坏血酸，进行荧光光谱扫描， 每种干扰因子进行3组平行实验，并记录在该浓度干扰因子下的荧光强度，考察 CYP55B1对NO检测的选择性(图17)。