一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法

摘要

一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，该方法是以茶多酚氧化酶同工酶PPO1为酶源，以茶多酚中的儿茶素EC和EGC组分为主要反应底物，以一定pH值的缓冲液作为反应体系，经摇床振荡酶促反应以及后续的萃取、离心、浓缩、冷冻干燥等步骤，定向酶促合成单一茶黄素组分TF(theaflavin)的技术及工艺优化。该方法克服了传统以茶叶多酚氧化酶粗酶液酶促合成茶黄素中同时产生多种茶黄素组分、分离纯化茶黄素组分工艺技术繁琐以及制备高纯茶黄素组分难度大等缺陷，实现了酶促合成产物单一、反应终端无副产物的技术创新，避免了茶黄素组分后续分离纯化的技术瓶颈，为茶黄素组分绿色、安全、高效大规模工业化生产与利用奠定了理论和实践依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制备领域，涉及一种茶黄素TF的制备方法，具体涉及 一种茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液在茶多酚溶液反应体系中定向酶促合成茶 黄素TF的方法。

背景技术

茶黄素类(theaflavins,TFs)是从红茶中发现具有多羟基的苯骈卓酚酮结 构混合物，占红茶干重的0.3％-1.5％，对红茶的色香味和品质起关键作用。现研 究表明，茶黄素类具有多种与人体健康有关的药理功效，在预防心脑血管系统 疾病、延缓衰老、增强免疫机能、防龋齿、抗肿瘤、抗菌杀病毒等均起作用， 素有“脑黄金”之称，是发酵茶类三大色素(茶黄素、茶红素、茶褐素)中功 效最明显、科学理论最完善、现阶段最具开发前景的天然产物之一，广泛应用 在医药、保健品、日化用品和食品添加剂等领域。

现已发现并鉴定的茶黄素组分有二十余种，其中主要以茶黄素 (Theaflavin，TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯(Theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、 茶黄素-3'-单没食子酸酯(Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G)和茶黄素 -3-3'-双没食子酸酯(Theaflavin-3-3'-gallate，TFDG)四种组分为主。就不同 的茶黄素组分而言，生物活性有较大差异。Lu Jie bo在比较4种主要茶黄素对 正常细胞和癌细胞的生长、凋亡、基因表达的作用时发现，10-50μmol的TF能 抑制突变体细胞WI38VA和Caco-2结肠癌细胞的生长，且对于相应的正常细胞 没有影响，而TFDG没有表现出显著的抑制效果。其机理是一定浓度的TF能在 mRNA和蛋白质水平上抑制血清诱导的Cox-2基因的表达，从而诱导细胞凋亡。

随着茶黄素的研究深入和生理活性明晰，对其组成、含量和纯度提出更高 要求。现有的制备方法主要集中于茶叶直接提取法、酶促合成法、化学氧化合 成法，但上述所得到的茶黄素均为多组分的茶黄素类混合物。同时，从茶叶直 接提取产能低、成本高、资源浪费明显。化学氧化合成法存在操作复杂、茶黄 素得率低、环境污染、试剂残留和安全毒害等系列问题。酶促合成法则因多酚 氧化酶组成复杂性及其同工酶的多样性，合成的产物为含有多种茶黄素组分的 混合物，并导致分离纯化茶黄素组分工艺技术繁琐以及制备高纯茶黄素组分难 度大等问题。王坤波等分别采用梨、茶叶、微生物、苹果、漆酶、蘑菇中的多 酚氧化酶粗酶液为酶源，氧化茶多酚溶液形成茶黄素类混合物，且四种主要茶 黄素组分生成量差异显著，总茶黄素(TFs)得率为20-52.5％；同时，将上述酶 源通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳发现，多酚氧化酶在梨、茶叶、蘑菇、苹果、 漆酶中分别有11、5、5、4、1种同工酶，说明多酚氧化酶催化氧化茶多酚合成 茶黄素的能力不仅与其酶活有关，还与同工酶本身有关。

对于茶黄素类多组分的分离纯化主要包括聚酰胺吸附树脂层析、纤维素柱 层析、葡聚糖凝胶层析、硅胶层析和高速逆流色谱等。Berkowltz等人采用纤维 素柱层析分离纯化发现，步骤繁琐、制备量小，且仅能得到茶黄素TFDG。丁晓 芳等人采用葡聚糖凝胶层析法分离茶黄素组分，仅得到了较理想的两个茶黄素 组分，而茶黄素TF-3-G和TF-3'-G难以分开。综合认为，仅用一种分离纯化 技术难以获得茶黄素组分的高纯品。此外，上述技术普遍存在成本高、制备量 小、工业化程度尚低、分离周期长等突出问题，严重制约了茶黄素组分的开发 与利用。

中国发明专利CN102286565A公开了一种茶黄素单体的制备方法，该方法 是将灵芝真菌通过液体发酵培养得到的含有漆酶的酶液以1:20-30的体积比加入 到质量浓度1％-3％茶多酚溶液中，经酶促反应以及进一步分离纯化，获得纯度 为95％的茶黄素TF-3-G。该发明工艺方法简单、节能环保，但也因该酶液的酶 活不高，酶促合成茶黄素组分TF-3-G的效率不高，需要使用较大量的酶液，并 由此导致的外源酶安全问题引人关注。另外，江和源等人(专利公开号 CN1011909099A)发明了一种制备四种茶黄素单体的方法，具体方案是将从茶叶 中提取的茶黄素类混合物缓慢通过聚酰胺层析柱进行分离纯化获得，但采用的 洗脱剂为酯、酮、醇和有机酸等混合物，限制了产品应用范围，同时存在操作 繁杂、溶剂残留、工业废弃污染以及得率低、制备量小等问题。

由此，结合现有的酶蛋白提取分离、同工酶制备、生物发酵等技术，探索 茶叶多酚氧化酶同工酶定向酶促合成单一的茶黄素组分，从源头上改变从茶叶 提取茶黄素类再经分离制备茶黄素单体以及利用外源漆酶酶促合成茶黄素 TF-3-G的技术现状，有助于推动和扩大茶黄素组分的开发与利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术直接从茶叶中提取制备 茶黄素和化学氧化制备形成茶黄素类混合物、多酚氧化酶同工酶组成复杂及其 酶促合成产物多样、茶黄素组分生物活性差异较大、纯化制备茶黄素组分成本 高、工业化程度尚低、操作繁琐等的不足，提供一种利用茶多酚氧化酶同工酶 PPO1酶促合成单一茶黄素组分TF的方法，利用特定的茶叶多酚氧化酶同工酶 PPO1，通过催化氧化茶多酚溶液转化形成茶黄素组分TF。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种利用茶多酚氧 化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，该方法步骤如下：

1)以茶多酚溶液为底物，以茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液为酶源，按1ml 茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液加500-800ml茶多酚溶液的比例，将茶多酚氧化 酶同工酶PPO1酶液加入到质量体积浓度为1.2％-3％的茶多酚溶液中；

2)以空气作为酶促合成的氧气来源，于20-44℃、60-150r/min摇床振荡 下酶促反应30-60min，得酶促反应液；

3)于酶促反应液中加入等体积的乙酸乙酯，静置萃取5-30min后以 500-3000r/min离心1-5min，取乙酸乙酯层溶液，无机相溶液重复萃取及离心 一次，合并乙酸乙酯层溶液，于真空度为-0.05～-0.09Mpa、温度为50～60℃ 条件下真空浓缩回收乙酸乙酯后，于真空度为-0.05～-0.09MPa、温度为-38～ -42℃条件下冷冻干燥，即可。

上述1.2％-3％质量体积浓度的茶多酚溶液是将茶多酚溶解于pH值为 4.5-6.5的Tris-HCl缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 中配制而成。其中，茶多酚为市购产品。

上述茶多酚氧化酶同工酶PPO1已记载于申请号为201410849876.3、发明名 称为茶叶多酚氧化酶同工酶单体PPO1和PPO2及其制备方法的申请中，其中对 该茶多酚氧化酶同工酶PPO1的分子量、结构、性质和制备过程等已有详细记载。 其中，该制备方法于凝胶介质层析二次纯化后所得的二酶液中的一酶液即为茶 多酚氧化酶同工酶PPO1，经检测，其酶活力为4340U/ml。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、制备特定的茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促催化合成单一茶黄素 组分TF，改变了以往采用茶叶多酚氧化酶粗酶液酶促合成茶黄素中同时产生多 种茶黄素组分的技术现状，实现了利用茶叶多酚氧化酶同工酶定向酶促合成茶 黄素组分TF的理论与实践创新。

2、在茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促合成单一茶黄素组分TF过程中， 主要是利用底物茶多酚中的EC和EGC组分，底物利用率显著提高，并且产物单 一、无副产物，有效避免了茶黄素类混合物分离纯化繁琐工序。

3、本发明通过酶蛋白提取分离、同工酶制备等技术，利用茶叶中本身含有 的多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促合成单一茶黄素组分TF，有效突破了以往利 用灵芝真菌通过液体发酵培养得到的含有漆酶酶液酶促合成茶黄素组分TF-3-G 过程中的酶活不高、需要使用较大量的酶液、酶促合成茶黄素组分TF-3-G的效 率不高以及外源漆酶引起的安全问题等技术瓶颈。

4、本发明所建立的茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促合成单一茶黄素 组分TF方法，实现了酶促反应制备茶黄素组分的绿色环保、简便高效、特定明 确，为单一茶黄素组分的生物活性研究及功能开发提供了物质基础，同时为后 续开展茶黄素组分大规模工业化生产与利用提供了理论和技术支撑。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不用以限制本发明的范 围。

附图说明

图1是本发明实施例1茶黄素高效液相色谱(HPLC)检测图谱。

图2是本发明实施例2茶黄素高效液相色谱(HPLC)检测图谱。

图3是本发明实施例3茶黄素高效液相色谱(HPLC)检测图谱。

图4是对比实验茶黄素高效液相色谱(HPLC)检测图谱。

具体实施方式

原料的准备：

(1)茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液及粗酶液的制备：参照申请号为 201410849876.3记载的制备方法，制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体PPO1酶液， 粗酶液是于该制备方法中的硫酸铵分级沉淀后获取的超滤液。

(2)茶多酚为市购原料，该茶多酚中儿茶素含量分别为：EGC 8.53701％、 DL-C 1.15196％、EC 6.23421％、EGCG 41.2888％、GCG 1.39888％、ECG 9.10367％， 其中EGC、EC总百分含量为14.77％。

实施例1

将茶多酚溶解于pH值为5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成质量 体积浓度为1.2％的茶多酚溶液。

取酶活力为4340U/ml的茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液1ml，加入到质 量体积浓度为1.2％的500ml茶多酚溶液中，以空气作为酶促合成的氧气来源， 36℃条件下以60r/min摇床振荡60min后，立即用与反应液等体积的乙酸乙酯 静置萃取5min，萃取液于1500r/min下离心3min，取有机相乙酯乙酯层溶液， 对无机相溶液部分再次重复上述操作萃取一次，离心，合并两次所得的有机相 乙酸乙酯溶液，于真空度为-0.05Mpa、温度为50℃条件下真空浓缩回收乙酸乙 酯后，最后于真空度为-0.05MPa、温度为-38℃条件下冷冻干燥，即可获得含有 单一茶黄素组分TF的提取物粉末。取少量该粉末用甲醇溶解后经高效液相色谱 检测，结果见图1，合成茶黄素组分TF的量为1.403g。同时，检测发现利用的 茶多酚底物主要是EC和EGC组分，两者总转化率为76.51％。

实施例2

将茶多酚溶解于pH为4.5的醋酸钠-醋酸缓冲液中，配制成质量体积浓度 为3.0％的茶多酚溶液。

将酶活力为4340U/ml的茶叶多酚氧化酶同工酶单体PPO1酶液1ml加入到 质量体积浓度为3％的650ml茶多酚溶液中，以空气作为酶促合成的氧气来源， 20℃条件下以90r/min摇床振荡45min后，立即用与反应液等体积的乙酸乙酯 静置萃取20min，萃取液于3000r/min下离心1min，取有机相乙酯乙酯层溶液， 对无机相溶液部分再次重复上述操作萃取、离心一次，合并两次所得的有机相 乙酸乙酯溶液，于真空度为-0.09Mpa、温度为60℃条件下真空浓缩回收乙酸乙 酯后，最后于真空度为-0.09MPa、温度为-42℃条件下冷冻干燥，即可获得含有 单一茶黄素组分TF的提取物粉末。取少量该粉末用甲醇溶解后经高效液相色谱 检测，结果见图2，合成茶黄素组分TF的量为3.7391g。同时，检测发现利用 的茶多酚底物主要是EC和EGC组分，两者总转化率为62.74％。

实施例3

将茶多酚溶解于pH为6.5的Tris-HCl缓冲液中，配制成质量体积浓度为 2.1％的茶多酚溶液。

将酶活力为4340U/ml的茶叶多酚氧化酶同工酶单体PPO1酶液1ml加入到 质量体积浓度为2.1％的800ml茶多酚溶液中,以空气作为酶促合成的氧气来源， 于44℃以150转/min摇床振荡30min后，立即用与反应液等体积的乙酸乙酯静 置萃取30min后，萃取液于500r/min下离心5min，取有机相乙酯乙酯层溶液， 对无机相溶液部分再次重复上述操作萃取、离心一次，合并两次所得的有机相 乙酸乙酯溶液，于真空度为-0.075Mpa、温度为55℃条件下经浓缩回收乙酸乙酯 后，最后于真空度为-0.075MPa、温度为-40℃条件下冷冻干燥，即可获得含有 单一茶黄素组分TF的提取物粉末。取少量该粉末用甲醇溶解后经高效液相色谱 检测，结果见图3，合成茶黄素组分TF的量为4.2287g。同时，检测发现利用 的茶多酚底物主要是EC和EGC组分，两者总转化率为78.35％。

对比实验

将茶多酚溶解于pH值为5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成质量 体积浓度为1.2％的茶多酚溶液。

取前述制备的粗酶液1ml加入到质量体积浓度为1.2％的500ml茶多酚溶液 中，以空气作为酶促合成的氧气来源，36℃条件下以60r/min摇床振荡60min 后，立即用与反应液等体积的乙酸乙酯静置萃取20min后，萃取液于800r/min 下离心3min，取有机相乙酯乙酯层溶液，对无机相溶液部分再次重复上述操作 萃取、离心一次，合并两次所得的有机相乙酸乙酯溶液，于真空度为-0.075Mpa、 温度为55℃条确件下经浓缩回收乙酸乙酯后，最后于真空度为-0.075MPa、温度 为-40℃条件下冷冻干燥，即可获得提取物粉末。取少量该粉末经甲醇溶解后经 高效液相色谱检测，结果见图4，合成产物为含有四种主要茶黄素的混合物，共 总量为2.272g。其中TF为0.657g，TF-3-G为0.570g，TF-3’-G为0.512g， TFDG为0.533g，茶多酚底物转化率为37.87％，与其他利用茶叶多酚氧化酶粗酶 液酶促合成茶黄素以及茶多酚转化率上无明显区别。