用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物SSIV-1b及其检测方法

摘要

本发明涉及用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物SSIV-1b及其检测方法，属于植物分子遗传学领域。所述引物的核苷酸序列为：SSIV-1b F：5’GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3’；SSIV-1b R：5’ACT AAA ACC CAC TTT GCG AC 3’，其扩增区域包含TaSSIV基因的第3外显子的一部分和第4～5外显子以及第3～4内含子区，扩增片段长度1191bp。利用所述引物及本发明提供的检测方法，可以准确检测出小麦突变群体中相应区域的等位变异位点，从而在小麦淀粉合酶基因新等位变异的发掘过程中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物SSIV-1b及其检测方法， 属于植物分子遗传学领域。

背景技术

作为能量和碳素的重要储存方式，植物中淀粉的合成是分别在造粉体和叶绿体中完成的。 其中造粉体合成储藏型淀粉，这些淀粉主要储藏在植物的种子、块茎、根等组织中，是食用 或工业用淀粉的主要来源；叶绿体则合成过渡淀粉，而过渡淀粉是调控植物生长发育的重要 因素。白天或光照条件下，植物经光合作用固定二氧化碳合成糖类，并经过一系列的催化反 应最终合成过渡淀粉；夜晚或黑暗条件下，植物通过降解过渡淀粉以提供其生长所必需的碳 素。在不同的光照/黑暗条件下，植物通过调节过渡淀粉合成/降解的速率实现其正常的生长发 育(Bahaji et al.2014)。因此过渡淀粉的合成/降解对植物的生长速度及生物产量的形成起着重 要的作用。

储藏淀粉和过渡淀粉均以淀粉粒的形式存在于植物体中，而淀粉粒是由直链和支链淀粉 组成的。直链淀粉和支链淀粉均以ADP葡萄糖(ADPG)为合成起始底物。在淀粉合酶(starch  synthase，SS)的作用下，ADPG通过α-1,4糖苷键链接形成葡聚糖链，进而合成直链淀粉； 或进一步在淀粉分支酶/淀粉去分支酶的作用下，通过α-1,6糖苷键产生分支，形成支链淀粉。 淀粉合酶包含颗粒结合淀粉合酶(granule-bound starch synthase，GBSS)和可溶性淀粉合酶。 不同SS酶在淀粉合成过程中的作用、催化底物及其组织分布各不相同。GBSSⅠ与淀粉粒紧 密结合，主要作用于直链淀粉，由waxy基因编码。而可溶性淀粉合酶部分存在于质体基质中， 部分与淀粉粒结合，催化支链淀粉的延伸，且不同SS同工型的特性和在淀粉合成中的作用各 不相同。SSⅠ、SSⅡ、SSⅢ分别优先延长短链(DP6-10)、中等链(DP11-24)、长链(DP25-35) (Keeling and Myers 2010；Zeeman et al.2010)。以SSⅡ酶为例，单子叶植物中有SSⅡa和SSⅡb 两种同工酶，SSⅡa存在于胚乳中，而SSⅡb分布于叶片等光合组织中。六倍体禾谷类作物 小麦中一个或多个SSⅡa酶缺失将使较短的分支链(DP6-10)数量增加，中等长度的分支链 (DP11-24)数量减少(Shimbata等，2005)。

对SSIV的功能研究目前主要集中在拟南芥上，研究表明SSⅣ可能在淀粉粒的合成起始 反应中起重要作用(Crumpton-Taylor et al.2013)。拟南芥AtssIV基因功能缺失突变体的每个叶 绿体中仅合成1个大的淀粉粒(Roldan et al.2007)，而AtssIII和AtssIV基因双缺失突变的叶绿 体中则没有任何淀粉粒合成，表明SSIV在淀粉粒起始合成和淀粉累积过程中都起着重要的 作用(Szydlowski et al.2009)。白天/光照条件下，AtSSIV基因的过量表达导致叶片中过渡淀粉 增加，而增加的这些淀粉在夜晚/黑暗条件下全部转换为植物生长所必需的碳素，从而提高了 植株的生长速率。过表达AtSSIV基因的马铃薯产量和块茎中储藏淀粉的含量均有显著提高， 分析表明AtSSIV基因表达量的增加使AGP和SuSy活性增强、酸性转换酵素活性降低、ADPG 含量增加，推测产量及淀粉含量的增加是这一系列酶活性增强共同作用产生的结果 (Gamez-Arjona et al.2011)。

小麦的SSIV基因仅在叶片和胚中表达，而不在胚乳中表达(Leterrier et al.2008)，但SSIV 在小麦过渡淀粉或淀粉合成中的作用及其对生长过程甚至产量形成的影响还没有深入细致的 研究，创制和挖掘SSIV基因新等位变异及其缺失突变体是研究SSIV功能的重要途径。SSIV 蛋白的N端第1～405位氨基酸为其区别于其他淀粉合酶的特异序列，含有2个卷曲螺旋结构 域和1个1433蛋白识别位点(Leterrier et al.2008)，该区域碱基突变将导致基因功能变异。因 此，在上述区域挖掘出SSIV基因新等位变异及其缺失突变体将促进SSIV功能的深入研究。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一对用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的 引物及使用所述引物检测小麦TaSSIV等位变异的方法。本发明请求保护的技术方案如下：

用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物，其核苷酸序列为：

SSIV-1b F：5’GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3’；

SSIV-1b R：5’ACT AAA ACC CAC TTT GCG AC 3’。

用于检测小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异的方法，包括如下步骤：

(1)以小麦突变群体为材料，提取基因组DNA；

(2)混合小麦突变群体中不同株系的基因组DNA，构建样本池；

(3)以每个样本池的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物及其荧光引物进行PCR 反应，获得PCR产物；

所述荧光引物为：在权利要求1所述引物的基础上，在引物SSIV-1b F上添加IRdye700 荧光标记获得的荧光引物SSIV-1b F IRdye700，在引物SSIV-1b R上添加IRdye800荧光标记 获得荧光引物SSIV-1b R IRdye800；

(4)采用特异性限制性内切酶对步骤(3)获得的PCR产物进行酶切反应，得到酶切产物；

(5)进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用Li-Cor 4300DNA遗传分析系统检测步骤(4)获 得的酶切产物，得到两张电泳图片，A图包含IRdye700荧光标记，B图包含IRdye800荧光 标记；

(6)若A图中DNA片段大小与B图中DNA片段大小的和等于1191bp，即可初步判断该 片段所来自的样本池中含有特异酶切片段，即等位变异；

(7)以初步判断含有特异酶切片段的样本池的原始样本基因组DNA为模板，采用权利要求 1所述的引物进行PCR反应、测序验证所述等位变异。

所述混合指将诱变群体中不同株系的基因组DNA两两等量混合。

所述权利要求1所述的引物及其荧光引物的混合比例为：SSIV-1b F:SSIV-1b F IRdye700: SSIV-1b R:SSIV-1b R IRdye800＝4:1:1:4。

所述特异性限制性内切酶是CELI酶，所述酶切反应的条件为45℃酶切15min。

所述PCR反应的10μl体系为：10×Buffer 0.5μl；1.5mmol/L Mg²⁺；0.2mmol/L dNTP； 0.25mmol/L引物；高保真DNA聚合酶0.5U；200ng模板DNA。

所述PCR反应的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，以0.5℃/s 的速度升至72℃并延伸1min，8个循环，每循环的退火温度比上一循环降低1℃；94℃变性 30s，58℃退火30s，以0.5℃/s的速度升至72℃并延伸1min，35个循环；72℃总延伸5min； 99℃变性10min；70℃退火20s，70个循环，每循环的温度比上一循环降低0.3℃。

SSIV蛋白的N端第1～405位氨基酸为其区别于其他淀粉合酶的特异序列，含有2个卷 曲螺旋结构域和1个1433蛋白识别位点，该区域的碱基突变将导致基因功能变异。由于普通 小麦为六倍体，而该区域又高度保守，为检测小麦该区域的突变体，只有设计筛选出特异性 极好的引物进行PCR电泳，才能将发生等位突变的同源染色体与其它同源染色体区分开来， 从而扩增到可通过凝胶电泳及测序的方法检测出的等位突变。本发明经过设计和筛选，提供 一对用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物，所述引物的扩增区域为TaSSIV基 因的第3外显子的一部分和第4～5外显子以及第3～4内含子区，扩增片段的长度为1191bp， 退火温度为58℃，其核苷酸序列为：SSIV-1b F：5’GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3’； SSIV-1b R：5’ACT AAA ACC CAC TTT GCG AC 3’。试验数据证明，该引物能特异地检测到 TaSSIV等位突变，如实施例2，图2和图3所示，可有助于小麦SSIV的功能研究。

所述等位变异指与野生型相比，淀粉合酶基因TaSSIV发生了单碱基突变如转换或颠换， 或者发生了小于10个碱基的小片段插入或缺失。

本发明还提供一种用于检测小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异的方法，利用该方法能够 准确地从小麦突变群体中检测出TaSSIV等位变异位点。所述小麦突变群体可以是小麦干种子 经EMS(甲基磺酸乙酯)溶液处理后构建的诱变群体，也可以是自然产生的或以其它本领域 公知的诱变方式(例如叠氮化钠诱变)产生的突变群体。利用EMS诱变小麦，优选含0.7～1.5％ EMS 0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)，根据所需等位变异的多少可对EMS的浓度进行调整，浓度 越高所获得的等位变异越多。所述诱变群体的大小可根据所需等位变异的多少进行调整，群 体越大所获得的等位变异越多。种子经EMS溶液处理后种植获得M₁代，植株抽穗后套袋自 交获得M₂代种子，将M₂代种子种植，取叶片提取单株小麦的基因组DNA，每一株自交收 获种子。然后将诱变群体中不同株系的基因组DNA两两等量混合构建样本池。所述两两等 量混合是将每个单株的DNA浓度稀释为相同浓度后，每2个不同样本取相同体积，混合后 构建1个样本池。在实际应用中，根据小麦突变群体的大小及所需等位变异的数量，也可以 选择其它混合方式，例如，每个样本池含有4或8份小麦基因组DNA。以每个样本池的基因 组DNA为模板，采用本发明提供的引物SSIV-1b F、SSIV-1b R及其荧光引物进行PCR反应， 获得PCR产物。采用芹菜中所含的CELI酶对所述PCR产物进行酶切，酶切产物经变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测获得两张电泳图谱，若A图中DNA片段大小与B图中DNA片段大小 的和等于1191bp，那么所述片段对应的样本池中含有特异酶切片段，鉴定其等位变异位点。 对含有特异酶切片段的样本池的原始基因组DNA进行PCR，所述PCR的反应体系和程序与 步骤(3)中PCR的反应体系和程序相同。最后对PCR产物进行测序，验证样本所含的等位 变异。

综上所述，本发明提供的用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物SSIV-1b F 和SSIV-1b R，利用所述引物，结合本发明用于检测小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异的方 法，能够准确检测出小麦突变群体中单株小麦的TaSSIV基因等位变异位点，为小麦淀粉合酶 基因TaSSIV的深入功能研究奠定基础。

附图说明

图1.1.0％EMS溶液诱导小麦产生的部分表型突变，

其中，从上到下，从左到右依次为拔节期、旗叶宽度、株型、黄绿叶色、类斑、条纹叶 和抽穗期突变。

图2.以引物SSIV-1b扩增小麦淀粉合酶基因TaSSIV电泳图，

其中，A含IRdye700标记；B含IRdye800标记；红色方框为含IRdye700标记的特异酶 切片段，蓝色方框为含IRdye800标记的特异酶切片段，二者长度相加为1191bp。

图3.部分突变株系序列比对图

具体实施方式

生物材料及来源：小麦推广品种京411，已知品种，可商购，北京市小麦区域试验原对 照品种。

上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

仪器设备：美国Li-Cor公司的Li-Cor 4300DNA遗传分析系统。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得， 可商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1.EMS诱发小麦京411突变群体

1.实验材料与方法

以含体积百分比为1％EMS的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)处理小麦品种京411的干种子， 处理完成后，单粒点播种植获得M₁代，抽穗后套袋自交，单株收获，每株取1粒种子，用以 构建M₂群体。M₂代种子单粒点播于中国农业科学院作物科学研究所中圃场试验基地，行长 2m，行距30cm，株距10cm，正常田间管理。苗期取叶片备用，每一株自交收获种子，整 个生育期间田间调查表型变异，分析诱变群体的诱变效率。

2.实验结果

在M₂群体的生长过程中，田间鉴定到拔节期、抽穗期、叶色、旗叶宽度、株型(图1)、 千粒重等多种表型变异，在4400个株系中共筛选到296株突变体，总突变率为6.73％。从表 型突变频率分析，该群体突变率较高，推测其基因的等位变异率也相应较高。

实施例2.以引物SSⅣ-1b鉴定小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异

1.引物设计及合成

综合采用COODLE软件、primer 5软件和NCBI网站在线引物设计功能，对NCBI网站 数据库中小麦淀粉合酶基因TaSSIV(登录号DQ400416.1)第5内含子前的卷曲螺旋结构域和 1433蛋白识别位点进行分析，设计特异扩增引物序列。该序列需满足一般引物设计条件，且 退火温度在55℃～65℃之间、扩增区存在潜在突变位点。所设计序列经人工合成后首先在野 生型样品中扩增验证其特异性，之后用于突变样品的筛选鉴定。

2.样品池构建

用实施例1所取M₂代单株叶片提取基因组DNA，并将每个样品的浓度稀释为40ng/μl， 将DNA两两等量混合构建样品池。共提取1600个单株的DNA，构建了800个样品池。

3.PCR扩增

PCR扩增时使用的引物为普通引物SSIV-1b F、SSIV-1b R与荧光标记引物SSIV-1b F  IRdye700、SSIV-1b R IRdye800的混合物，混合比例为SSIV-1b F:SSIV-1b F IRdye700:SSIV-1b  R:SSIV-1b R IRdye800＝4:1:1:4。以每个样品池的基因组DNA为模板，按照下列体系和程序 进行PCR，获得扩增产物。

PCR体系(10μl)：含10×Buffer 0.5μl；1.5mmol/L Mg²⁺；0.2mmol/L dNTP；0.25mmol/ L引物；高保真DNA聚合酶0.5U；200ng模板DNA。

PCR程序：

4、限制性内切酶酶切

按照下列酶切体系对步骤3中的PCR产物进行酶切：

酶切体系：以超纯水作为反应缓冲溶液，上述PCR反应产物+CELI酶1U+超纯水至 30μl。

酶切条件为45℃酶切15min，酶切完成后以0.225M EDTA(pH 8.0)溶液终止反应。

5、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

电泳采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳设备采用美国Li-Cor公司的Li-Cor 4300DNA 遗传分析系统。结果获得2张图片，一张图片中包含IRdye700荧光标记(命名为A图)，另 一张图片中包含IRdye800荧光标记(命名为B图)。

6、电泳图谱分析

利用GelBuddy软件同时打开A图和B图，如果A图中DNA片段大小与B图中DNA 片段大小的和等于1191bp，那么该片段对应的样品池中含有特异酶切片段，鉴定等位变异位 点。

7、等位变异验证

以含有特异酶切片段样品池的2个原始样本DNA为模板，采用引物SSIV-1b F和SSIV-1b  R，按照步骤3中的PCR反应体系和程序进行PCR，对获得的PCR产物测序，验证所含等位 变异。

结果如图2所示，分析800个样品池的电泳结果并经测序验证后，共获得5个等位变异 位点，这些等位变异分别产生了无义突变(即终止突变)和沉默突变。表1、图3为部分突 变株系的等位变异情况。

表1.部分小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异情况表

实施例3.在不同诱变群体中鉴定小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异

以含体积百分比为1.5％EMS的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)处理小麦品种京411的干种 子，构建新的诱变群体，用以验证SSIV-1b引物在不同群体中的应用效果。诱变群体的构建 过程和种植方法同实施例1，TaSSIV等位变异的鉴定方法同实施例2。

结果获得1300个M₂单株，共构建了650个样本池。实验共获得14个等位变异，其中包 含6个错义突变和8个沉默突变，这些突变都位于外显子区域。部分突变株系的等位变异情 况如表2、图3所示。

表2.部分小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异情况表