一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方法

摘要

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方法。该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组热稳定性漆酶及阿魏酸形成成膜液，超声脱气后，在80～90℃水浴加热15～25min，50-55℃干燥36-48h制得。本发明以乳清蛋白为基料，以甘油为增塑剂，通过添加重组热稳定性的漆酶作为交联剂所制备的乳清蛋白膜绿色可食用，拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性均表现出良好的性质。

说明书

技术领域

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用热稳定性重组漆酶制备乳清蛋白膜的方 法。

背景技术

塑料制品自产生以来给社会带来巨大方便的同时，它也给人类生存环境带来极大威胁。这 种用高分子化学聚合材料制成的包装不仅难以降解，还会因燃烧产生污染气体。随着人们对环 保意识的增强，采用天然绿色材料来制备可食用的包装膜成为许多研究者的焦点。可食性包装 材料是以天然可食性物质，如蛋白质、多糖(淀粉、纤维素)等为原料，通过分子间相互交联 作用形成的具有多孔网状的结构，可食用、易降解，并具有一定包装保护功能。

但是目前可食用包装膜应用并不广泛，无法取代塑料的使用，究其原因，主要是制备的可 食用膜性能无法同化学聚合物塑料相比，例如拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性、软产品(包 装膜)多硬产品(包装盒)少；另外成本问题也是制约其发展的一个因素。造成上述两方面的 问题的原因正是可食性包装材料的核心问题之一是仍未寻找到良好的起到分子间相互交联作 用的交联剂。目前早期在有关交联剂、增塑剂的研究方面以无机试剂为主，如氨水、CMC-Na、 聚醇环氧氯丙烷、二元羧酸、NaH₂PO₄等。上述研究结果，虽然在一定程度上提高了食品包装 材料的性能，但是仍不能与化学材料媲美。另外，所采用的无机试剂交联剂也给“绿色”蒙上 了阴影。酶制剂作为一种纯天然生物制品，具有催化效率高的本质，其本身就是蛋白质，经食 品加工后，变性为无毒无害的食品组分，酶制剂是标准的绿色食品添加剂。因此，利用酶催化 蛋白、多糖的交联作用，以酶制剂作为可食性包装材料的交联剂将是必然趋势。

我们前期利用重组脂肪氧合酶(LOX)制备了乳清蛋白膜，其性能优于未经LOX处理的对 照膜。有研究报道通过高温加热的物理处理方法(80-90℃，处理20-30分钟)，可提高以蛋白 质为基质的膜的性能。其机理是加热处理使得蛋白充分变性，降低温度后蛋白质分子的多肽链 之间重新形成新的共价键，进而强化了蛋白质分子内及分子间的交联作用。然而，我们前期使 用的重组LOX在高温条件下迅速失活(50℃半衰期5-7分钟)。因此在制备膜的过程中，加入 重组LOX，在20-25℃下反应2-3h后铺膜，50-55℃干燥36-48h后揭膜。目前为止，在乳清蛋 白质加热变性过程中，加入热稳定性的酶，提高膜性能的研究还未见报道。

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2，Lac)，是自然界普遍存在的一种含铜金属酶类，可催化各 种酚类物质如儿茶酸、单宁、黄酮等氧化为醌，是目前研究发现的对蛋白质、多糖有交联作用 的主要酶制剂之一。Lac可以催化蛋白质发生交联聚合，可能是由于Lac能催化蛋白质分子中 的酪氨酸残基以及与蛋白质通过非肽键相连的酚类化合物的氧化来实现。另外，可使酚类化合 物氧化成醌，而醌类化合物也可与蛋白质的氨基、巯基、吲哚基等基团发生反应从而导致蛋白 聚合。大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门 (Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌，其中最主要 的是担子菌门中的白腐真菌。真菌漆酶最大的问题是其热稳定性差，不适合于实际的生产加工 应用。细菌来源漆酶具有良好热稳定性，在蛋白质交联过程中与加热物理变性可以起到协同作 用，促进交联反应的进行。而目前关于热稳定性的重组漆酶应用于可食性包装膜的制备还未见 报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述，提供一种乳清蛋白膜的制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种乳清蛋白膜，该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组漆酶及阿魏酸 得成膜液，成膜液于80-90℃水浴加热15-30min,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，50‐55℃干 燥36‐48h揭膜所得；其中所述的重组漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的重组漆酶的编码基因优选如SEQ ID NO.1所示。

所述的重组漆进一步优选通过如下方法制备：

(1)以死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和 序列为SEQ ID NO.4的下游引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI 酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体 培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱 导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g 离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书 进行纯化得到所述的重组漆酶。

所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量优选8％-12％，进一步优选10％；甘油与乳清蛋白 质量比例优选1:4-1:5，进一步优选1:4；阿魏酸质量百分含量优选成膜液质量的1％-1.2％， 进一步优选1％，重组漆酶量优选10U/g-20U/g成膜液，进一步优选15U/g；成膜液pH优选 5.5-6，进一步优选5；反应温度优选85℃，反应时间优选20min。

一种制备乳清蛋白膜的方法，在纯水中加入乳清蛋白、甘油、重组漆酶及阿魏酸的成膜液， 成膜液于80-90℃水浴加热15-25min,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，50‐55℃干燥36‐48h 揭膜；其中所述的重组漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的重组漆优选通过如下方法制备：

(1)以死亡谷芽孢杆菌fmb-103基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的上游引物和 序列为SEQ ID NO.4的下游引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的漆酶基因序列；

(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI 酶切位点之间，获得含有漆酶基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；

(3)将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体 培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱 导，5小时后离心收集菌体；

(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g 离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书 进行纯化得到所述的重组漆酶。

所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量优选8％-12％，进一步优选10％；甘油与乳清蛋白 质量比例优选1:4-1:5，进一步优选1:4；阿魏酸质量百分含量优选成膜液质量的1％-1.2％， 进一步优选1％，重组漆酶量优选10U/g-20U/g成膜液，进一步优选15U/g；成膜液pH优选 5.5-6，进一步优选5；反应温度优选85℃，反应时间优选20min。

所述的制备乳清蛋白膜的方法，进一步优选称取乳清蛋白粉溶于超纯水中配制成质量百 分含量为10％的溶液，搅拌加入甘油、阿魏酸和所述的重组漆酶，磁力搅拌使其充分溶解后用 NaOH或HCl溶液调节pH至5形成成膜液，将成膜液超声波脱气处理后，至于85℃恒温水域 中加热30,min，涂布成膜或导入平面容器中成膜。

有益效果：

本发明通过添加热稳定性重组漆酶氧合酶作为交联剂，同时采用高温加热处理乳清蛋白基 质的处理方法，使酶制剂的催化效果与蛋白质加热变性的效果达到协调作用，制备乳清蛋白膜。 所制备的乳清蛋白膜，绿色可食用，拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性均表现出良好的性质， 性能优于利用真菌漆酶处理和未用酶处理的对照组，具有重要的应用价值。

附图说明

图1重组fmb-103漆酶基因表达载体构建过程

图2不添加阿魏酸与添加阿魏酸酸的乳清蛋白成膜效果

A为不添加阿魏酸，不添加酶的乳清蛋白成膜效果

B为添加阿魏酸，不添加酶的乳清蛋白成膜效果

图3不添加热稳定性重组漆酶与添加酶的乳清蛋白成膜效果

A为不添加热稳定性重组漆酶的乳清蛋白成膜效果

B为添加热稳定性重组漆酶的乳清蛋白成膜效果

图4添加热稳定性重组漆酶与阿魏酸的乳清蛋白成膜效果

生物材料保藏信息

死亡谷芽孢杆菌fmb-103，分类命名为Bacillus vallismortis，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏地址北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.6198。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因的克隆

离心收集死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103菌体(CGMCC No.6198)，用 上海生工基因组DNA提取试剂盒提取死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103的 基因组DNA。

根据Genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因(No.GU972592.1)设计两个引物：

上游引物F-1：5’-ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物R-1：5’-TTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3’(SEQ ID NO.4)；

在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM,fmb-103菌株基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃3min；30×(94℃40s，53℃50s，72℃90s)； 72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-simple-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的 LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上 海生工测序，用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个序列如SEQ ID NO.1所示的长度 为1542bp的ORF，即fmb-103漆酶基因(fmb-L103)，编码一个由514个氨基酸组成的蛋白质， 序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因原核表达载体的构建 (附图1)

根据获得的漆酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上 XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列):

上游引物F-2：5′-CGCGAGCTCATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3′(SEQ ID NO.5),

下游引物R-2:5′-CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3′(SEQ ID NO.6),

按照下列PCR体系加入各成分，扩增漆酶基因:

PCR程序为：94℃3min；30×(94℃40s；53℃50s；72℃90s)；72℃10min。

用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀， ddH₂O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化 平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞 后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

实施例3：死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因在大肠杆菌中的表达

将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液 体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的 100ml LB液体培养基，35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度 100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，获得重组死亡谷 芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)漆酶(fmb-rL103)的粗酶液。

漆酶活性测定采用2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法稍作改动：反 应体系总体积3mL，包括2.45mL 0.2mol/L pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液、0.5mL 6mmol/L ABTS 及50μl用pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶粗提液，45℃测定反应的前3min内反 应液在420nm处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成1μmol反 应物所需的酶量定义为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式：漆酶活力(U)＝V_总×ΔOD/(V _酶×ε×Δt×10^-6)×总酶酶液稀释倍数；其中，ε＝3.6×10⁴mol/cm；Δt：3min； ΔOD：3min内吸光度OD的变化值；V_总：酶反应中，反应液的总体积；V_酶：酶反应中，酶液 的体积。实验重复3次，取平均值。

采用上述方法测得pET-23a-fmb-L103转化BL21(DE3)pLysS后的工程菌，重组漆酶的产量 为12000U/ml发酵液。

实施例4：重组死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶(fmb-rL103) 的分离纯化

采用NTA(镍柱，GE公司产品)亲和层析法对实例3中获得的fmb-rL103粗酶液进行分离 纯化。

样品中加5mM咪唑(终浓度)，增强吸附柱。

上样前，用20mM咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到fmb-rL103与亲和柱材料充 分结合的目的。

上样结束后，用100mM咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。上述纯 化制备的重组漆酶fmb-rL103酶活为3.6U/mg蛋白。

实施例5：乳清蛋白包装膜的制备流程

称取乳清蛋白粉溶于超纯水中配制成质量百分含量10％，甘油与乳清蛋白比例1:4于搅拌 过程中缓慢加入获得成膜液，磁力搅拌使其充分溶解后用NaOH或HCl溶液调节pH至5，阿 魏酸质量百分含量为1％，加入重组fmb-rLac，酶量15U/g成膜液。将成膜液至于85℃恒温水 域中加热20min，待成膜液冷却后，超声波脱气处理，倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，室温 20℃反应2h，55℃干燥36h揭膜。

实施例6：乳清蛋白膜性能的测定

膜感官指标的测定：感官评定膜的颜色，表面光滑度以及膜的黏性，是否易揭膜。

膜厚度(mm)的测定：在被测膜上随机(除膜的最边缘)取五个点，用电子数显卡尺测量 其厚度，取其平均值并记录。

膜折痕(FM)的测定：将膜对折，依据折痕程度来判断膜的折痕，用0-4作为指标，0表示 无折痕，1表示折痕轻微，2表示膜折痕明显，3表示膜对折后部分断裂，4表示膜对折的部分 全部断裂。

透光率的测定：将试样裁成一定规格(0.8mm*4.5cm)的长方形，贴入比色皿的内光滑面， 在500nm的波长下测定其透射比即透光率，以空比色皿作为对照。每个试样做2个平行。

膜水溶性测定：将膜样(2cm×2cm)在105℃条件下干燥至恒重,称重后根据干、湿重之差 计算水分含量.将测定完水分含量的膜放入盛有30mL水的烧杯中,在室温下溶解24h,再将膜在 105℃条件下干燥至恒重,称重,根据两次干重之差计算水溶性.

水蒸气透过率测定:取直径3cm、深4cm的圆形敞口塑料杯,加入3g干燥的CaC1₂,将裁 切成直径7cm的膜样品,盖住杯口,膜与杯之间的接口用石蜡封住。而后将各杯置于底部加入 1000mL的蒸馏水的干燥器中(25℃,相对湿度100％)。每12h称量1次,持续1周。通过杯重 的增加量确定水蒸气的透过量。按ASTM方法(E96-93,1993)计算水蒸气转移速率(WVTR)和水蒸 气透过率(WVP)。

机械性能测定：将薄膜裁剪成4cm*2cm规格的长条，并固定于物性仪上测定。设置物性仪 两夹具的初始距离为20mm，速度为1mm/sec。测定结束后，记录膜拉断瞬间的力(g)和膜断裂 时两夹具的距离L。每个试样取三个平行样品测定。

拉伸强度TS(g)：用膜拉断时瞬间的力表示拉伸强度。

断裂伸长率E(％)按下式计算：

E＝(L1－L0)/L0

式中：E—膜的断裂伸长率(％)；

L1—膜断裂时两夹夹具的距离(mm)；

L0—两夹具初始时的距离(mm)。

按照上述方法，对重组漆酶处理、未加重组漆酶处理的两种方法制备的乳清蛋白膜性能指 标对比如表1：

表1不同处理制备的乳清蛋白膜性能