同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法

摘要

一种同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，属于肾脏功能生物标志物的分析检测手段，其特征是，检测手段为常压下直接质谱电离源EESI源耦合MS/MS，将LTQ-MS/MS设置为正离子检测模式，调整电喷雾溶剂组成等EESI源参数，定量分析中采用同位素稀释技术和标准加入法，尿样中加入梯度浓度肌酐和固定浓度氘代肌酐后，直接分析，绘制标准加入曲线，得到尿肌酐浓度。本发明能在无需样品前处理条件下直接测定尿肌酐，改善了现有技术分析周期长、效率低的不足。该法具有快速、准确、抗基质干扰等特点，尤其适用于肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）高通量样品分析。

说明书

技术领域

本发明涉及尿肌酐的检测方法，特别是一种同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法。

背景技术

尿肌酐是表征肾脏功能的重要生物标志物，对肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）意义重大。目前文献报道的尿肌酐分析方法包括：分光光度法、红外光谱法、表面增强拉曼光谱法、气相色谱质谱（GC-MS）法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱质谱（LC-MS）法、高效薄层色谱（HPTLC）法、毛细管电泳法、酶法等。在上述方法中，分光光度法是检测尿肌酐最经典和最常用的方法，但是该法易受到尿中内源物质干扰，方法选择性较差。以质谱为检测手段的GC-MS和LC-MS方法，与其它方法相比，具有选择性好、准确度高、响应灵敏等优点。然而LC-MS或GC-MS分析尿肌酐，因样品前处理和色谱环节耗时较长，无法满足肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）中高通量样品分析的迫切需求。

发明内容

本发明解决的目的就是提供一种具有快速、准确、抗基质干扰等特点，且技术分析周期短、效率高的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法。

本发明的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，是借助电喷雾萃取电离（EESI）源和商品化线性离子阱质谱仪进行无样品前处理条件下尿肌酐的快速检测，具体步骤是：

（1）肌酐和氘代肌酐母液的配制：称取10.0 mg 肌酐和10.0 mg氘代肌酐固体标样，分别置入100mL容量瓶中，加入电阻率18.2 MΩ·cm的纯水溶解，分别制得浓度为100 mg L^–1的肌酐母液和氘代肌酐母液。

（2）肌酐标液的配制：移取肌酐母液，用水稀释为浓度100μg L^–1的肌酐标液，将标液转移至20mL棕色小瓶中，4℃密封避光保存。

（3）加标尿样的准备：取肌酐母液和氘代肌酐母液，分别用尿样逐级稀释，得到肌酐浓度为0.5-5 mg L^–1的加标尿样及氘代肌酐浓度为1 mg L^–1的加标尿样。

加标尿样是为EESI-MS定量分析尿肌酐时所用的标准加入法所备。配制加标尿样所用的尿样为高纯水稀释500–2000倍后的尿样，这是因为未经处理的原尿中的肌酐浓度高达几百甚至上千mg L^–1，为确保加标后尿肌酐浓度仍在定量曲线的线性范围内以及减少加标量，实际尿样须稀释后方可加标。

（4）电喷雾萃取电离源（EESI）参数的调试： EESI电离源为东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室制造的电喷雾萃取电离源（美国专利号：US 2008/0179511 A1），其搭建简便，已广泛使用。电喷雾电离（ESI）溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为1–2 mm和50–70^o，二者与质谱仪金属离子传输管入口的距离和角度分别为5–10 mm和145–155^o，初级ESI溶剂甲醇水混合溶剂，甲醇与水体积比大于5比1，流速1–5μL min^–1，样品溶液流速2–7μL min^–1，ESI电压+ 3-- + 4.5 kV，金属离子传输管温度375–450℃，样品雾化气为纯度99.999%氮气，压力0.6–1.4 MPa。

（5）二级串联质谱（MS/MS）参数的设置：正离子检测模式，质子化后的肌酐母离子m/z114或质子化后的氘代肌酐母离子m/z117；母离子隔离宽度2.0；活化值Q（AQ）为0.30–0.40，碰撞能量（NCE）为25–100%，碰撞时间 30 ms，质量数扫描范围15–200；离子阱最大离子注入时间 200 ms，实际注入离子量由自动获取控制（AGC）确定，碰撞气He气，离子阱内压力0.84–0.98 × 10–5 Torr。

 （6）样品检测：在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白，肌酐标液，未加标尿样，梯度浓度加标尿样；每次进样0.5 min，平行进样6次；测定MS/MS谱图中m/z 117、m/z 114、m/z 89和m/z 86处质谱峰强度，进行定性定量分析，m/z 86处质谱峰是肌酐分子离子（m/z 114）的二级质谱碎片离子，m/z 89处质谱峰是氘代肌酐分子离子（m/z 117）的二级质谱碎片离子。

（7）数据处理：包括定性分析（a）和定量分析（b）两部分：

（a）定性分析：以肌酐标液MS/MS谱图中m/z 86和m/z 114处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中m/z 86和m/z 114处质谱峰强度比值，确认样品中肌酐是否被检出。

（b）定量分析：采用标准加入法定量尿肌酐，以未加标/加标尿样MS/MS谱图中m/z 86和m/z 89处质谱峰强度比值为纵坐标Y，以肌酐加标浓度为横坐标X，对实验数据进行线性回归分析，得到线性回归方程Y = aX + b，Y ＝0时得到X的绝对值，将此绝对值再乘以稀释倍数即为尿肌酐浓度。

本发明的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，尿样无需前处理即可直接分析，简化了分析流程，缩短了分析周期，提高了分析效率，如单次检测时间仅需0.5 min，单个样品重复测定6次可在6.0 min内完成。定性分析中采用MS/MS技术，提高了方法的选择性和准确性；定量分析中采用了同位素稀释技术和标准加入法，前者提高了方法的稳定性和准确性，后者减少了基质干扰。如同位素稀释EESI-MS/MS测定尿肌酐和氘代肌酐的相对标准偏差分别为4.9–13.4%和4.3–6.3%（n = 6），尿肌酐回收率为89(±14)%–115(±15)%。

本发明的同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，能在无需样品前处理条件下直接检测尿肌酐，改善了现有技术分析周期长、效率低的不足。该方法具有快速、准确、抗基质干扰等特点，尤其适用于肾脏疾病临床研究（如急性肾衰竭早期诊断）高通量样品分析。

附图说明

图1为本发明EESI-MS/MS分析样品时的选择离子流（m/z 86）色谱图；

图2为本发明肌酐的MS/MS谱图；

图3为本发明氘代肌酐的MS/MS谱图；

图4为本发明标准加入曲线。

具体实施方式

一种同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法，使用的EESI电离源为东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室制造的电喷雾萃取电离源（美国专利号：US 2008/0179511 A1），由于其装置搭建简便，已广泛使用。质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪；数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统，具体步骤如下：

（1）肌酐和氘代肌酐母液的配制：准确称取10.0 mg 肌酐或氘代肌酐固体标样，置入100-mL容量瓶中，加入高纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）溶解，得到浓度为100 mg L^–1的肌酐或氘代肌酐母液，将配制好的母液转移至20mL棕色样品小瓶中，4℃密封避光保存。

（2）肌酐标液的配制：移取一定体积肌酐母液，用高纯水稀释为浓度100μg L^–1的肌酐标液，将配制好的标液转移至20mL棕色样品小瓶中，4℃密封避光保存。

（3）尿样的采集：尿样取自一25岁的健康男性，尿样收集在20mL棕色样品小瓶中，于– 20℃密封避光保存。

（4）加标尿样的准备：取一定体积肌酐母液（100 mg L^–1）和氘代肌酐母液（100 mg L^–1），用尿样逐级稀释，得到肌酐加标浓度为0.5、1、1.5、2、3、4、5 mg L^–1以及氘代肌酐浓度为1 mg L^–1的加标尿样，配制加标尿样所用的尿样为高纯水稀释500倍后的尿样。

（5）EESI源参数的调试：ESI溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为1 mm和60^o，二者与质谱仪入口的角度和距离分别约为10 mm和150^o。初级ESI溶剂为甲醇，流速1μL min^–1；样品溶液流速5μL min^–1；ESI电压+ 4 kV；金属离子传输管温度400℃；样品雾化气为高纯氮气（纯度99.999%），压力1.0 MPa。

（6）串联质谱（MS/MS）参数的设置：正离子检测模式；母离子m/z 114（肌酐）或m/z 117（氘代肌酐）；母离子隔离宽度2.0；活化值Q（AQ）为0.35，碰撞能量（NCE）为25%，碰撞时间 30 ms；质量数扫描范围15–200；离子阱最大离子注入时间 200 ms；实际注入离子量由自动获取控制（AGC）确定；碰撞气He气（离子阱内压力0.84–0.98 × 10–5 Torr）；离子透镜等其它MS条件由LTQ-XL-MS自动优化得到。

（7）样品检测：在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白，肌酐标液，未加标尿样，梯度浓度加标尿样；如图1所示，每次进样约0.5 min，平行进样6次；测定图2所示MS/MS谱图中m/z 114和m/z 86处质谱峰强度以及图3所示MS/MS谱图中m/z 117和m/z 89处质谱峰强度。

（8）定性定量分析：如图2所示，以肌酐标液MS/MS谱图中m/z 86和m/z 114处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中m/z 86和m/z 114处质谱峰强度比值，确认尿肌酐被检出。如图2和图3中所示的未加标/加标尿样MS/MS谱图中m/z 86和m/z 89处质谱峰强度，以二者响应强度比值为纵坐标（Y），以肌酐加标浓度为横坐标（X），对实验数据进行线性回归分析。如图4所示，得到线性回归方程Y = 0.828X + 0.69（R² = 0.9970），Y ＝0时得到X的绝对值0.833 mg L^–1，将此绝对值再乘以稀释倍数500，即为同位素稀释EESI-MS/MS方法测得的尿肌酐的浓度417 mg L^–1。用分光光度法（中华人民共和国卫生行业标准尿中肌酐分光光度测定方法WS/T 97-1996）分析同一尿样，测定值为367 mg L^–1。同位素稀释EESI-MS/MS方法测定结果与分光光度法测定结果的相对偏差为14%。