用于核酸的序列特异性纯化和多重复合体分析(multiplex analysis)的方法和组合物

摘要

用于确定在所提供样品中存在至少一种核酸的方法和材料，所述方法包括(1)使用序列特异性杂交捕获的纯化步骤；(2)扩增步骤；和(3)使用两个分离的序列特异性多核苷酸探针的检测步骤。还提供了包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:727的核酸和核酸探针，以及包括这些核酸探针的探针组。

说明书

对相关申请的涉及

本申请要求2010年1月29日提交的美国临时专利申请号61/299,531和2010年4月20日提交的美国临时专利申请号61/326,067的优先权，其每篇文件通过提述以其整体并入本文。

发明领域

本公开内容涉及用于纯化、检测和表征核酸的方法和组合物。

背景

鉴定样品中存在或不存在特异核酸序列是现代研究实验室和临床装置中使用的许多测定法和测试的核心部分。在典型的设计方案中，首先通过操作各种物理性质将样品的核酸与样品中存在的其它大分子分离。例如，由于其磷酸二酯主链，核酸在中性pH通常带有净的负电荷。使用阴离子交换树脂可以对此性质进行操作以将核酸与其它大分子分离。作为另一个实例，核酸与其它大分子在某些溶剂中的不同溶解性可用于从样品中提取核酸。存在大量其他此类方案。然而，靶核酸的量相对于纯化的核酸总量而言通常是非常低的。因此，必需进行一些类型的扩增。或者通过靶物扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)增加特异核苷酸序列的量，或者将特异的核苷酸序列与可检测的标签反应，并将来自标签的信号放大到可检测的水平。

不幸的是，这些方法应用有限。一个限制是靶物特异性扩增方法如PCR本身是易错的。例如，尽管引物杂交的严格性可以被控制，但是仍然会存在非特异性引物结合和不依赖引物的扩增的可能性，这会导致假阳性结果。而且，不同的序列可能以不同的速度扩增，导致扩增偏好。结果，单一反应中多个核酸序列的定量分析经常受到缺乏灵敏性的困扰。此外，相对于其它核酸以低浓度存在的靶核酸可以有效地“掩盖”而接触不到聚合酶，这会导致假阴性结果。可能存在降低这类测定法的特异性和灵敏性的其它因素。PCR的另一个限制是靶物的相对较少部分得到扩增。结果，在突变/缺失的情况下，测定法可产生假阴性结果。

因此，需要对于含有至少一个特异序列的至少一个靶核酸区段进行特异性和灵敏性分离和分析的方法和组合物。

发明内容

本公开在多个方面和实施方案中通过提供检测并对至少一种靶核酸进行基因分型的方法和用于所述方法的分离的核酸而解决这些多种需求和问题。

在一个实施方案中，提供了分离的核酸，其全长不超过100个核苷酸，包含至少一种核苷酸序列，基本上由至少一种核苷酸序列组成或者由至少一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:727和其互补物的核苷酸序列具有至少75%的同源性。

在一个方面中，分离的核酸能够在严格条件下与选自下组的人乳头瘤病毒(HPV)基因组的一部分杂交：HPV2,HPV3,HPV6,HPV10,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV27,HPV28,HPV29,HPV30,HPV31,HPV32,HPV33,HPV34,HPV35,HPV39,HPV42,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV54,HPV56,HPV57,HPV58,HPV59,HPV64,HPV66,HPV67,HPV68,HPV69,HPV70,HPV73,HPV82,HPV84,HPV85,HPV86,HPV87和HPV94。

在一个方面中，所述核酸能在选择性严格条件下与选自E6、E7和L1的HPV基因杂交。

在一个方面中，所述核酸不能在严格条件下与多于一个人乳头瘤病毒(HPV)基因组杂交。

在一个方面中，所述核酸能够在严格条件下与选自下组的人乳头瘤病毒(HPV)基因组的组中的至少两个杂交：a)组A7，由HPV18,HPV39,HPV45,HPV59,HPV68,HPV70和HPV85组成；和b)组A9，由HPV16,HPV31,HPV33,HPV35,HPV52,HPV58和HPV67组成。

在另一个方面中，所述核酸能够与选自下组的一对HPV基因组杂交：a)HPV18和HPV45;b)HPV39和HPV68;c)HPV59和HPV70;d)HPV70和HPV85;e)HPV16和HPV35;f)HPV31和HPV35;g)HPV52和HPV67;h)HPV33和HPV58;i)HPV26和HPV69;j)HPV51和HPV82;k)HPV30和HPV53;l)HPV56和HPV66;m)HPV34和HPV73;和n)HPV6和HPV11。

在一个方面中，所述分离的核酸在其全长上与人乳头瘤病毒基因组的至少一部分具有至少75%的同源性，其中HPV选自下组：HPV2,HPV3,HPV6,HPV10,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV27,HPV28,HPV29,HPV30,HPV31,HPV32,HPV33,HPV34,HPV35,HPV39,HPV42,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV54,HPV56,HPV57,HPV58,HPV59,HPV64,HPV66,HPV67,HPV68,HPV69,HPV70,HPV73,HPV82,HPV84,HPV85,HPV86,HPV87和HPV94。

在一个方面中，所述分离的核酸在其全长上与选自E6、E7和L1的基因的一部分具有至少75%的同源性。

在一个方面中，所述分离的核酸包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:727、其RNA和DNA等同物、和其互补物。

在另一个方面中，提供了核酸探针，其包含如本文所公开的分离的核酸，并且任选地进一步包含可检测标签和/或配体。在进一步的方面中，所提供的核酸探针与固体支持物结合。

在进一步的方面中，如上所述的核酸探针作为探针组的部分提供。

在另一个方面中，提供了检测在含有非靶核酸的样品中检测靶核酸的方法，所述方法包括：

a.通过如下方法从样品纯化靶核酸，该方法包括：

(i)使所述样品与至少一个纯化探针接触，其中所述核酸探针的至少一部分与至少一个靶核酸杂交以形成DNA:RNA杂合体。

(ii)通过如下方法将所述DNA:RNA杂合体固定于第一固体支持物，所述方法包括将DNA:RNA杂合体与能够结合该DNA:RNA杂合体的至少第一抗体接触，其中所述抗体结合于或适于结合于所述第一固体支持物；和

(iii)从所述样品分离所述第一固体支持物以产生至少一个纯化的靶核酸；

b.通过如下方法对纯化的靶核酸进行基因分型，所述方法包括：

(i)扩增纯化的靶核酸的至少一部分以产生扩增子，如通过等温扩增，如全基因组扩增；

(ii)通过如下方法将扩增子固定在第二固体支持物上，所述方法包括将所述扩增子与至少一个固定探针接触，其中：

(α)所述固定探针结合于或适于结合于所述第二固体支持物；和

(β)所述固定探针的至少一部分与至少一个靶核酸杂交；

(iii)将固定的扩增子与至少一个检测探针接触，其中所述检测探针的至少一部分与至少一个靶核酸杂交以产生检测复合体；和

(iv)检测由所述检测复合体产生的至少第一可检测信号，其中该可检测信号指示靶核酸的基因分型。

在另一个方面中，纯化的核酸在扩增之前被断成碎片(fragmented)。

在另一个方面中，该第二固体支持物产生该第一可检测信号。

在另一个方面中，产生了多个不同的纯化的靶核酸。

在另一个方面中，多个纯化的靶核酸与多个固定探针接触，其中多个固定探针的每一个对于不同的纯化的靶核酸是特异的。

在另一个方面中，多个固定探针中的至少两个对于同一纯化的靶核酸是特异的。

在另一个方面中，多个固定探针中的至少两个对于同一纯化的靶核酸的不同区域是特异的。

在另一个方面中，使用了多个不同的第二固体支持物，其中：(α)每个第二固体支持物包含至少一个对于单个靶核酸特异的固定探针，但不包含任何对于多个靶核酸中任何其它者特异的固定探针；和(β)每个固体支持物产生独特的第一可检测信号，其指示靶核酸的基因型。

在另一个方面中，产生第二可检测信号，其指示扩增子固定于所述第二固体支持物。

在另一个方面中，所述检测探针包含产生第二可检测信号的可检测标签。

在另一个方面中，所述第二可检测信号进一步指示靶核酸的基因型。

在另一个方面中，所述第二可检测信号进一步指示固定于每个固体支持物的扩增子的量。

在另一个方面中，该第一可检测信号指示选自下组的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型：高危HPV(HR-HPV)类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82；和低危HPV(LR-HPV)类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91。

在另一个方面中，纯化探针、固定探针和/或检测探针的至少一个包含分离的核酸，所述核酸其全长不超过100个核苷酸并且包含序列，所述序列与选自下组的核苷酸序列具有至少75%的同源性：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:727、其DNA和RNA等同物和其互补物。

在另一个方面中，所述纯化探针包含选自下组的核苷酸序列：SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:727和其互补物。

在另一个方面中，所述固定探针包含选自下组的核苷酸序列：SEQ IDNO:344-SEQ ID NO:727和其互补物。

在另一个方面中，所述检测探针包含选自下组的核苷酸序列：SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:727和其互补物。

在另一个方面中，提供了一种方法，所述方法包括：

a.纯化步骤，其包括：

--通过使至少一个靶核酸与包含对于至少一个靶核酸是特异的至少第一核酸探针的杂交探针组杂交而产生至少一个靶核酸的双链核酸杂合体；

--通过使所述双链核酸杂合体与能够结合于所述双链核酸杂合体的至少第一抗体接触并将所述至少第一抗体与第一固体支持物结合，而将所述双链核酸杂合体固定于第一固体支持物；和

--将所述双链核酸杂合体与样品分离而产生至少一种纯化的核酸；

b.扩增步骤，其中至少一种纯化的核酸的至少一部分被扩增而产生扩增的核酸；和

c.基因分型步骤，其包括：

--通过将扩增的核酸与包含至少一种对于至少一种靶核酸特异的多核苷酸探针的固定探针组杂交，而被扩增的核酸固定于至少第二固体支持物；和

--用包含至少一种对于至少一种靶核酸特异的多核苷酸探针的检测探针组检测至少一种靶核酸的存在。

在进一步的方面中，所述扩增步骤包括等温扩增。

在进一步的方面中，所述扩增步骤包括全基因组扩增。

在进一步的方面中，所述扩增的核酸在基因分型步骤前断成碎片。

在进一步的方面中，所述固定探针组与置于悬浮液中的多个固体支持物结合。

在进一步的方面中，所述多个固体支持物被可检测标记。

在进一步的方面中，本文所述的方法适于检测多种靶核酸的存在。

在进一步的方面中，所述固定探针组包含至少一种对于多个靶核酸中每个特异的探针。

在进一步的方面中，所述固定探针组基本上由两种对于多个靶核酸中每个特异的探针组成。

在进一步的方面中，这两种对于多个靶核酸特异的探针与变体的不同区域结合。

在进一步的方面中，多个固体支持物中的每个仅含有对于多个靶核酸中的一种核酸特异的探针，从而多个靶核酸中只有一种核酸会与多个固体支持物中的每个结合。

在进一步的方面中，多个固体支持物中的每个被可检测标记，从而对于多个靶核酸中的第一核酸特异的固体支持物带有与对于多个靶核酸中的第二核酸特异的固体支持物不同的可检测标签。

在进一步的方面中，所述检测探针被可检测标记。

在进一步的方面中，多个固体支持物中每个的可检测标签用于指示与之结合的靶核酸的同一性(identity)；并且检测探针组的可检测标签用于指示与每个固体支持物结合的靶核酸的相对量。

在进一步的方面中，至少一种靶核酸是人乳头瘤病毒(HPV)核酸。

在进一步的方面中，所述HPV核酸选自下组：高危HPV(HR-HPV)类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82；和低危HPV(LR-HPV)类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91。

在进一步的方面中，多个HPV核酸被检测。

在进一步的方面中，所述多个HPV核酸包括如下、由如下组成或者基本上由如下组成：HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82，或其任何亚组；和/或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91，或其任何亚组。

在进一步的方面中，将本文公开的方法适于可在单个反应中检测和鉴定59个高危和低危HPV类型。

在另一个方面中，提供了用于对核酸进行基因分型的试剂盒，其包含：(a)如本文所公开的分离的核酸；(b)核酸聚合酶；(c)引物；(d)第一固体支持物；(e)结合或适于结合于第一固体支持物的抗DNA:RNA杂合体抗体；和(f)可检测标记的第二固体支持物。

附图简述

图1A是常规扩增的结果和人类基因组DNA如何降低期望靶物扩增的图示；图1B是杂交捕获和扩增结果以及期望靶物的扩增如何不被人类基因组DNA降低的图示。

图2是显示用于检测四重HPV感染的20重反应的结果的图。

图3A是在各种扩增子体积下靶物检测结果的图示；图3B是在过夜扩增后靶物检测结果的图示。

图4A和4B是2种HPV类型的靶物检测结果的图示。

图5是测试26种HPV类型和全部HR-HPV类型的多重实验结果的图示。

图6是显示测试26种HPV类型和全部HR-HPV类型的多重实验结果的S/N值的数据表。

图7是单一HPV类型感染的检测结果的图示。

图8是单一HPV类型感染的检测结果的图示。

图9是四重HPV类型感染的检测结果的图示。

图10是两种HPV类型感染的检测结果的图示。

图11是图解杂合体捕获、全基因组扩增和靶核酸检测的示意图。

发明详述

本公开内容涵盖用于确定样品中至少一个靶核酸的存在的方法、组合物、试剂和试剂盒(套盒)。所述方法、组合物、试剂、系统和试剂盒可用于临床诊断目的，包括但不限于检测和鉴定致病生物和检测特定疾病的遗传素因(predisposition)。

I.样品和样品制备

A.样品

任何样品均可用作起始点，包括但不限于样本或培养物(例如细胞、微生物和病毒培养物)，包括临床和实验生物学和环境样品。生物样品可来自动物，包括人，流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体或固体食物和饲料产品和成分如乳品(dairy item)、植物/蔬菜(vegetable)、肉类和肉类副产品，和废物。环境样品包括环境材料，如表面物质、污物/土壤(soil)、水和工业样品，以及从食物和乳品加工设施、设备、装置、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。

例示的生物样品包括，但不仅限于，宫颈上皮细胞(例如从宫颈拭子获得的样品)、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰和精液。

在一个方面中，生物样品被收集和储存在收集介质中。收集介质具有多种功能，包括作为防腐介质以保存核酸并抑制核酸酶，从而防止核酸在分析之前被降解。在一个方面中，收集介质是基于洗涤剂的。没有任何限制，例示的收集介质包括见于美国专利公开No.US 2010-0105060A1和美国专利公开No.US2010-0159463A1的那些，两篇文件均通过提述以它们的整体并入本文。

在一个方面中，基于洗涤剂的收集介质包含如下，基本上由如下组成或者由如下组成：1.0%NP-40,0.25%脱氧胆酸钠,50mM Tris-HCl,25mM EDTA,150mM NaCl和0.05%叠氮化钠。在另一个方面中，基于洗涤剂的收集介质包含如下，基本上由如下组成或者由如下组成：约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,约25mM-约75mM Tris-HCl,约10mM-约50mMEDTA,约50mM-约200mM NaCl,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在另一个方面中，基于洗涤剂的收集介质包含如下，基本上由如下组成或者由如下组成：约0.8%-约1.5%NP-40,约0.20%-约0.40%脱氧胆酸钠,约30mM-约60mMTris-HCl,约20mM-约40mM EDTA,约100mM-约200mM NaCl,和约0.025%-约0.075%叠氮化钠。在另外一个方面中，基于洗涤剂的收集介质包含如下，基本上由如下组成或者由如下组成：约0.9%-约1.2%NP-40,约0.20%-约0.30%脱氧胆酸钠,约30mM-约60mM Tris-HCl,约20mM-约30mMEDTA,约100mM-约150mM NaCl,和约0.04%-约0.06%叠氮化钠。

在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由NP-40和EDTA组成。在另一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由NP-40、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由脱氧胆酸钠、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由NP-40、脱氧胆酸钠、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由NP-40、脱氧胆酸钠、Tris-HCl、EDTA和叠氮化钠组成。

在另一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：0.5%-约2.0%NP-40和10mM-约50mM EDTA。在另一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：0.5%-约2.0%NP-40，10mM-约50mM EDTA，和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,10mM-约50mM EDTA，和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,10mM-约50mMEDTA，和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,约25mM-约75mM Tris-HCl,约10mM-约50mM EDTA,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在某些方面中，收集介质包含、基本上由或者由如下组成：1%NP-40,0.25%脱氧胆酸钠,50mM Tris-HCl,25mM EDTA,150mM NaCl和0.09%叠氮化钠。该介质在本文常常称为Digene收集介质或DCM。

可将样品收集在其它已知的收集介质中，并可以用在本文所述的方法中。其它收集介质的实例包括PRESERVCYT，SUREPATH,尿(urine)和STM(样品/样本传输介质)。在这些介质的一些中收集的样品在可对样品中的核酸进行检测和分析之前可需要处理。处理样品(也称作制备样品)的多种方法是本领域已知的。例如，在介质如PRESERVCYT中收集的用于细胞学分析的宫颈细胞样品可以和基于洗涤剂的裂解缓冲液组合，然后添加包含核酸结合表面的磁珠。

在另一个方面中，样品可包含、由或者基本上由已从生物样品提取的核酸组成。已知大量方法用于从生物学或环境样品提取核酸，包括但不限于：酚/氯仿提取；阴离子交换层析；氯化铯梯度超离心；大小排阻层析；和二氧化硅(silca)/离液盐(chaotropic salt)提取。如果期望包含特定核酸大小的样品，则提取的核酸可通过凝胶电泳根据大小进一步分离，并从凝胶中提取。

B.靶核酸

如上文指出的，本文公开的方法涉及样品中至少一种靶核酸的检测和基因分型。至少一种靶核酸可为DNA或RNA或DNA和RNA两者，并可为单链、双链或部分单链的。至少一个靶核酸可包含在更大的核酸内。至少一种靶核酸或包含所述至少一种靶核酸的更大核酸的检测涵盖于本公开。

至少一种靶核酸可包括，但不限于，样本或培养物(例如细胞、微生物和病毒培养物)中存在的核酸，包括生物学和环境样品。所述至少一种靶核酸可存在于来自如下的生物样品中：动物包括人，流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食品和饲料产品和成分如乳品(dairy item)、植物/蔬菜、肉类和肉类副产品，和废物。至少一种靶核酸可存在于环境样品中，并包括环境材料如表面物质、污物/土壤、水和工业样品，以及从食物和乳品加工设施、设备、装置、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。

生物样品中存在的至少一种靶核酸包括，但不限于，宫颈样品(例如从宫颈拭子获得的样品)或宫颈细胞样品、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰和精液。所述至少一种靶核酸可来自其它病毒、细菌、分枝杆菌或原质团(plasmodia)，如巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、H1N1、淋病奈瑟氏菌(GC)、沙眼衣原体(CT)、阴道毛滴虫、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、SARS相关的冠状病毒或流感病毒。

在一个方面中，至少一个靶核酸与和如下任意一种样品相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性：宫颈样品(例如从宫颈拭子获得的样品)或宫颈细胞样品、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰、尿和精液、其它病毒、细菌、分枝杆菌或原质团(plasmodia)，例如巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、H1N1、淋病奈瑟氏菌(GC)、沙眼衣原体(CT)、阴道毛滴虫、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、SARS相关的冠状病毒或流感病毒。

在一个方面中，所述至少一个靶核酸是HPV核酸。在另一个方面中，所述HPV核酸是HR-HPV类型的HPV DNA。在另一个方面中，所述HPV核酸是LR-HPV类型的HPV RNA。在另一个方面中，所述至少一种靶核酸是HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82的任一种，或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90,和91的任一种。

在另一个方面中，靶定了多种靶核酸。在一个方面中，所述多种靶核酸由如下组成：具有不同核苷酸序列的2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100种核酸的组。可以使用任何靶定核酸的组。在一个方面中，选择多种靶核酸，使得每一种均与其它靶核酸相关。作为实例而非限制，核酸的组可以是：彼此结构相关(例如基因家族的成员)；彼此功能相关(例如编码致炎细胞因子的核酸)；彼此种系遗传相关(例如对于病毒家族(如HPV家族病毒)的不同成员特异的核酸)；由于在不同细胞或组织类型中的差异表达而相关(例如巨噬细胞相关的核酸和前列腺相关的核酸)或者由于疾病状态而相关(宫颈癌相关核酸)。在一个方面中，核酸的组是不相关的。

在一个方面中，靶核酸的组包含、由或者基本上由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82，或其任何亚组组成。在另一个方面中，靶核酸的组包含、由或者基本上由LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91，或其任何亚组组成。在另一个方面中，靶核酸的组包含、由或者基本上由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82，或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91，或其任何亚组组成。在另一个方面中，至少一种靶核酸与和如下任一者相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性：HPV、HPV的遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPV RNA。在另一个方面中，至少一种靶核酸与和如下相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性：HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82的任一种，或者LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一种。

如先前指出的，所述至少一种靶核酸可为DNA或RNA。当所述至少一种靶核酸是DNA时探针可为RNA，而当所述至少一种靶核酸是RNA时探针可为DNA。然而，DNA探针可与至少一种靶核酸DNA一起使用，并且RNA探针可与至少一种靶核酸RNA一起使用。

C.样品制备

在如上所述将样品收集于收集介质中之后，可将样品用变性试剂处理以使至少一种靶核酸可以进行杂交。在一个方面中，样品用碱性溶液变性。不受限制地，合适的碱包括NaOH和KOH。

蛋白质的碱处理有效地使样本均质化以确保给定样品的分析结果的可再现性。还可以减少样品的粘性而增加动力学，使样品均质化，并通过破坏样品中的任何内源单链RNA核酸、DNA-RNA杂合体或RNA-RNA杂合体而降低背景。还有助于使可存在于样品中的酶如RNA酶和DNA酶失活。本领域的技术人员会意识到，如果RNA是所述至少一种靶核酸(与DNA相对)，不同的试剂可为优选的，包括但不限于，酚提取和TCA/丙酮沉淀，和硫氰酸胍-酚-氯仿提取。

可采用其它的变性方法，如使用加热步骤，例如将样品加热到约95°C以分离核酸链。也可以使用酶，如解旋酶。

II.纯化

在检测样品中的核酸的典型测定法中，进行核酸的大量非特异性提取。然后，用户在这个巨大的非特异性核酸汇集物的存在下尝试扩增或检测靶核酸。然而，非特异性核酸汇集物经常会干扰期望的扩增或检测步骤，特别是当靶核酸与非特异性核酸相比浓度很低时。因此，本公开方法在进行检测之前通过如下将靶核酸从非特异性核酸汇集物中分离：(1)将序列特异性多核苷酸纯化探针与靶核酸杂交而形成双链核酸杂合体；(2)使所述双链核酸杂合体与至少一种特异结合双链核酸杂合体的分子复合；和(3)将所述复合物捕获于固体支持物。

A.探针的杂交

在制备出用于杂交的含核酸样品之后，将其在如下条件下与至少一种多核苷酸杂交探针接触，该条件足以使一种或多个多核苷酸杂交探针与样品中的至少一种靶核酸杂交而形成双链核酸杂合体。所述至少一种多核苷酸杂交探针可为全长、截短或合成的DNA或全长、截短或合成的RNA。如果所述至少一种靶核酸是DNA，那么该至少一种多核苷酸杂交探针可为RNA，并且如果所述至少一种靶核酸是RNA，那么该探针可为DNA。

在一个方面中，使用单个多核苷酸探针纯化靶核酸。所述单个多核苷酸探针可仅对于单一的靶核酸为特异的，或者可设计为在严格条件下与多种靶核酸杂交。作为实例而非限制，可针对编码特异基因产物的核酸的高度保守区设计多核苷酸探针，使得所述多核苷酸探针可预期在严格条件下与基本上全部的编码该基因产物的核酸杂交。

在另一个方面中，使用多个多核苷酸探针纯化靶核酸。所述多个多核苷酸探针可仅对于单一的靶核酸为特异的，或者可对于多个靶核酸为特异的。作为实例而非限制，对于单一靶核酸特异的多个多核苷酸探针可通过断裂该靶核酸而产生。在一个方面中，为每个靶核酸提供至少一个多核苷酸杂交探针。在另一个方面中，为每个靶核酸提供至少两个多核苷酸杂交探针。

在一个方面中，多核苷酸杂交探针能够与如下核酸杂交或结合，所述核酸与和HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPVRNA、或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82之一的任一个、或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性。在另一个方面中，探针与HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPVRNA、或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82之一的任一个、或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个互补。

在另一个方面中，提供了多个多核苷酸杂交探针，所述多个探针被选择与靶核酸的组的每一个杂交并将其纯化。在一个方面中，所述多个多核苷酸杂交探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交：HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82核酸或其任何亚组。在一个方面中，所述多个多核苷酸杂交探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交：LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组。在一个方面中，所述多个多核苷酸杂交探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交：HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组。

如果使用碱处理使所述至少一种靶核酸变性，则一个或多个多核苷酸探针可稀释在探针稀释液中，所述稀释液也可以充当中和杂交缓冲液(以中和碱性变性试剂)。

用于DNA或RNA探针的探针稀释液是不同的，因为DNA和RNA稳定性所需的要求是不同的。例如，如果探针是RNA，优选首先中和样品然后添加探针，或者可选地，同时向样品添加RNA探针和中和剂(探针稀释液)，因为过多的碱性会破坏RNA。探针稀释液可用于溶解和稀释探针，并也有助于将样品保持在约中性pH，例如约pH6至约pH9，而提供更有利的杂交环境。可使用足够体积的探针稀释液，优选样品体积的一半，来中和碱处理的样品。

对于全长探针，可向样品添加热碱性溶液，然后可在室温向样品添加探针稀释液，随后可再加热样品。这样的方法能够抑制二级结构的形成。抗体倾向于不可逆地结合于具有二级结构的结构。当使用非全长探针如截短的或合成的探针时，加热溶液或样品可为不需要的，因为不存在二级结构问题。在一个方面中，当使用截短的或合成的探针时，不加热样品。

在用变性试剂处理之后，可以在合适的条件下向样品添加中和缓冲液的等分试样，在一个方面中为前述的探针稀释液，其中溶解了一种或多种探针，以使探针与至少一种靶核酸发生杂交或结合。中和缓冲液可含有单一的缓冲盐。在一个方面中，中和缓冲液不含有多于单一的缓冲盐。杂交条件足以使一种或多种多核苷酸探针与样品中可能存在的相应互补核酸序列退火以形成双链核酸杂合体。

采用适于本文所述的特殊探针和稀释液的杂交条件。例如，可将探针和样品核酸温育一定的杂交时间，优选至少约5-约30分钟，约5-约20分钟，或者约7-约15分钟，或者约10分钟，以及在所述范围内足以使一种或多种多核苷酸探针与相应的互补核酸序列退火的任何数字。杂交条件可包括如下的杂交温度：至少约65°C，约68.5°C，和约67°C-约70°C，以及所述范围内的任何数字。对于给定的至少一种靶核酸和给定探针，本领域的普通技术人员能够通过常规实验容易地确定理想的杂交条件。本领域的普通技术人员会进一步意识到，杂交时间和温度必须相对彼此进行优化。因此，更高的杂交温度可进行更短的时间，反之亦然。并非限制，可通过提高温度、将离子条件增加至0.5M以上(例如NaCl)或降低PAA的浓度而控制严格杂交条件。作为实例而非限制，严格杂交条件可包括在高温进行杂交反应，如至少约65°C，至少约68.5°C，约67°C-约70°C，和约69°C-约70°C。严格杂交条件还可包括高温，如至少约65°C，至少约68.5°C和约67°C-约70°C。核酸杂交的广泛指导可见于：Tijssen,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes,第I部分第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993);和Current Protocols inMolecular Biology，第2章,Ausubel等编,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)，通过提述以其整体并入。

就本目的而言，“严格条件”涵盖如下条件，即只有杂交分子和靶序列之间有25%或更少的错配时才会发生杂交。未来更精确的定义，“严格条件”可分解为严格性的特定水平。因此，如本文所使用的，“温和严格性”条件是具有超过25%序列错配的分子不杂交的条件；“中等严格性”条件是具有超过15%错配的分子不杂交的条件；而“高严格性”条件是具有超过10%错配的序列不杂交的条件。“非常高严格性”条件是具有超过6%错配的序列不杂交的条件。关于获得特定严格性程度所需的杂交条件的计算也由Sambrook等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,第9和11章讨论，通过提述以其整体并入本文。

在一个方面中，杂交/捕获步骤在50°C在约15-25分钟内；在50°C在约20-25分钟内；或者在50°C在约22.5分钟内完成。

在一个方面中，样品悬浮在收集介质中，用变性试剂使所述至少一种靶核酸变性，并与悬浮在中和缓冲液中的核酸探针杂交。在另一个方面中，中和缓冲液是本发明的探针稀释液。在另一个方面中，探针稀释液包括2.2M BES(N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸),2.6%聚丙烯酸,0.7N NaOH和0.05%叠氮化钠。

B.复合和捕获双链核酸杂合体

在探针与至少一种靶核酸杂交并形成双链核酸杂合体之后，通过对于该双链核酸杂合体特异的分子捕获该杂合体。对于该双链核酸杂合体特异的分子包括，但不仅限于，单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质例如但不限于RNAseH、核酸包括但不限于核酸适体、或序列特异性核酸。适体是随机序列的短的伸展，其通过与靶物杂交、扩增该杂交的适体和重复该选择过程而从连续地选自序列的文库。

在一个方面中，通过称作抗杂合体抗体的抗体捕获对于双链核酸杂合体特异的分子。在另一个方面中，抗杂合体抗体在捕获该双链核酸杂合体之前固定在支持物上。将抗体固定于固体支持物的方法是本领域公知的。作为实例而非限制，抗体可共价连接于固体支持物。作为另一个实例，抗体可吸附在吸附物上，例如蛋白-蛋白相互作用、蛋白-G珠、生物素-抗生蛋白链菌素相互作用、EDAC与羧基或甲苯磺酰基等连接，或者使用例如亲和柱中的序列特异性核酸直接杂交到固体支持物上。

在另一个方面中，抗杂合体抗体可在固定到固体支持物上之前与双链核酸杂合体复合。作为实例而非限制，抗杂合体抗体可与生物素标签缀合，而支持物可与抗生蛋白链菌素基团缀合。然后在没有固体支持物的情况下可得到抗杂合体抗体/双链核酸杂合体复合物。在向反应混合物添加固体支持物时，抗杂合体抗体/双链核酸杂合体复合物通过生物素缀合物和抗生蛋白链菌素基团之间的相互作用固定于固体支持物。

支持物包括但不限于珠；磁珠，包括顺磁的、反磁的、强磁的/铁磁的、强磁的/铁磁的和反磁的珠、柱子、板、滤纸、聚二甲基硅氧烷(PDMS)；浸渍片(dipstick)；涂覆的管、板和盘；和树脂柱。可以使用任何支持物，只要它允许液相的提取并提供分离出结合的与未结合的抗体的能力。顺磁珠是特别有用的，因为在施加磁场固定珠时，它们能够被留在溶液中并且液相可以被提取或倾析。小而且具有高表面积的珠是优选的，如直径约1μm的珠。也可以使用其它利用电荷转换或二氧化硅捕获(与磁场相对)的珠。

将杂合体与附接于支持物的抗杂合体抗体温育足够长的时间，以允许固定的抗杂合体抗体捕获双链核酸杂合体。在一个方面中，支持物是珠。

抗杂合体抗体可为单克隆的或多克隆的。在一个方面中，抗体是单克隆的。在一个方面中，抗体通过1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)接头与支持物偶联。在一个方面中，支持物是聚苯乙烯珠。在一个方面中，与抗体偶联的支持物或珠稀释在珠稀释缓冲液中。该珠稀释缓冲液有助于使珠上蛋白质的变性最小化。珠稀释缓冲液的一个实例包含6%酪蛋白,100mMTris-HCl,300mM NaCl,和0.05%叠氮化钠。

在一个方面中，将用抗杂合体抗体涂覆的珠与样品在约67°C-约70°C温育约30分钟。在另一个方面中，珠和样品在约68°C-约69°C温育约30分钟。在另外一个方面中，珠和样品在约68.5°C温育30分钟。温育时间的范围可为约5分钟-约60分钟，约15分钟-约45分钟，约20分钟-约40分钟，或者所述范围内的任何数字，并且一般地与温度成反比。本领域的技术人员应当会理解，可以改变温育时间、温度和/或振荡条件以实现期望的可选择的捕获动力学。

在如上所述捕获至少一种靶核酸/探针杂合体之后，可通过洗掉未捕获的核酸将被捕获的杂合体与样品的其余部分分离。

III.扩增

一旦纯化了至少一种靶核酸，就可以将其扩增。此时进行扩增以通过增加至少一种靶核酸的量而提高本方法的灵敏度。

核酸扩增可以广义地分成两类：温度循环扩增和等温扩增。

在温度循环扩增中，通常将温度提高到超过靶核酸的熔点，以“融化”任何双链部分，然后降低到寡核苷酸引物与靶核酸的单链部分退火的点，随后再提高到引物保持退火且聚合酶为活性的温度。

在等温扩增中，向反应混合物中添加试剂以允许无温度循环的扩增。例如，在解旋酶依赖性扩增(“HDA”)中，向扩增混合物中添加具有解旋酶活性的酶。如本文所使用的，“解旋酶”或“具有解旋酶活性的酶”是指任何能够解开双链核酸的酶。解旋酶发挥解开双链核酸的功能，从而不再需要重复的熔解循环。实例性解旋酶包括大肠杆菌(E.coli)解旋酶I,II,III和IV，Rep,DnaB,PriA,PcrA,T4Gp41解旋酶、T4Dda解旋酶、T7Gp4解旋酶,SV40大T抗原,酵母RAD。其他可用解旋酶包括RecQ解旋酶,来自腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis)和嗜热栖热菌(T.thermophilus)的热稳定UvrD解旋酶，来自水生栖热菌(T.aquaticus)的热稳定DnaB解旋酶，和来自古细菌和真核生物的MCM解旋酶。作为另一个实例，在缺口引发的扩增(nick-initiated amplification)(“NIA”)中，使用缺口诱导剂在核酸主链的磷酸二酯键中诱导断裂。然后，具有链置换活性的聚合酶会在缺口位置使用核酸的一条链为引物另一条链为模板启动扩增。如本文所使用的，“缺口诱导剂”是指任何在双链核酸的一条链内两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键中引入断裂的酶或化学剂或物理处理。缺口诱导剂的实例包括Bpu10 I,BstNB I,Alw I,BbvC I,BbvC I,Bsm I,BsrD,和大肠杆菌内切核酸酶I。

所公开方法中的扩增可为温度循环扩增或等温扩增。例示的扩增方法包括，但不限于：聚合酶链式反应(“PCR”),反转录酶(“RT”)反应,RT-PCR,HDA,RT-HDA,嗜热解旋酶依赖性扩增(“tHDA”),RT-tHDA,全基因组扩增(“WGA”),RT-WGA,连接酶链式反应(“LCR”),RT-LCR,NIA和RT-NIA。

扩增反应可进一步分成序列依赖性或非序列依赖性扩增。

“序列依赖性扩增”是指使用靶特异性引物相对于样品中存在的非靶序列对靶序列进行扩增。如本文所使用的，“靶特异性引物”是指单链核酸，其能够结合靶核酸上预定的单链区以促进对待选择性扩增的靶核酸进行聚合酶依赖性复制。

在一个方面中，扩增是序列特异性扩增。在另一个方面中，使用一对靶特异性引物实现靶序列的指数扩增，一个与每个靶核酸中靶序列的5’-侧翼杂交而另一个与靶序列的3’-侧翼杂交。当全部靶核酸均包括一个寻求基因分型的可变区并且该可变区的两侧为保守区时，这种安排是有用的。在另一个方面中，在单一反应中多对靶特异性引物用于同时扩增多个靶核酸。

一般地，合适的靶特异性引物对是短的合成寡核苷酸，例如长度大于10个核苷酸并且小于50个核苷酸。靶特异性寡核苷酸引物设计涉及多个参数，例如基于串的比对分数(string-based alignment score)、熔解温度、引物长度和GC含量。在设计靶特异性引物时，一个重要的因素是选择靶片段内对于待扩增核酸分子是特异性的序列。另一个重要的因素是计算用于反应的靶特异性引物的熔解温度。靶特异性引物的熔解温度由寡核苷酸的长度和GC含量确定。优选地，引物的熔解温度比发生引物杂交和靶物扩增的温度高约10-30°C。

“引物杂交”是指寡核苷酸引物在如下条件下与单链核酸模板的区结合，在该条件下，引物仅特异结合其在模板链之一上的互补序列，而不会与模板中的其它区结合。杂交的特异性可受到寡核苷酸引物的长度、进行杂交反应的温度、离子强度和反应混合物的pH的影响。

每个靶特异性引物与靶核酸的每个末端杂交，并可使用靶核苷酸序列作为模板通过聚合酶以3’→5’方向延伸。为了实现特异性扩增，同源或完美匹配的靶特异性引物是优选的。然而，靶特异性引物可在5’端包括与靶核苷酸序列不互补的序列。可选地，靶特异性引物可含有整体与靶核酸不精确互补的核苷酸或序列。

靶特异性引物可包括任何脱氧核糖核苷酸碱基A,T，G或C，和/或一个或多个核糖核苷酸碱基A,C,U,G，和/或一个或多个修饰的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，其中该修饰不会阻止引物与核酸的杂交或者靶特异性引物的延长或双链分子的变性。靶特异性引物可以用化学基团如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或者用非核苷酸接头修饰，以增强其性能或促进扩增产物的表征。

一般地，适合于允许靶特异性引物-模板识别和随后退火的特异性的变性温度可发生在一定的温度范围，例如20°C-75°C。优选的变性温度可根据选择用于熔解工程的解旋酶来选择。确定在所选解旋酶存在下扩增核酸的最佳温度的测试可通过常规实验确定，即改变反应混合物的温度并使用凝胶电泳比较扩增产物。

在进一步的方面中，扩增是非序列依赖性扩增。如本文所使用的，“非序列依赖性扩增”是指任何不扩增特异序列的扩增。作为实例而非限制，可以使用随机引物混合物或缺口诱导剂以启动非序列依赖性扩增。

如本文所使用的，“随机引物混合物”是指短的随机产生的寡核苷酸序列的混合物。

如本文所使用的，“缺口启动的聚合酶活性”是指在没有外源引物存在下的聚合酶活性，其由模板中的单链断裂启动。合成在DNA的单链断裂处启动，而不是在外源合成引物的末端启动。利用缺口启动的合成，不需要除去引物，从而减少成本、处理时间以及产物损失和降解的可能性。此外，缺口启动的合成减少由于引物的自延伸导致的假扩增信号。通过使用在识别序列处产生缺口的酶，可将缺口引入到限定的位置，或者可随机引入靶多核苷酸。如本文所使用的，“缺口诱导剂”是指任何在双链核酸一条链内两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键中引入断裂的酶或化学试剂或物理处理。缺口诱导酶的实例包括Bpu10I、BstNB I、Alw I、BbvC I、BbvC I、Bsm I、BsrD和大肠杆菌核酸内切酶I。在一个方面中，包括至少一种缺口诱导酶替换反应混合物中的解旋酶。在另一个方面中，除了至少一种解旋酶之外，还向反应混合物中添加至少一种缺口诱导酶。

在一个方面中，扩增是等温扩增。在另一个方面中，等温扩增是全基因组扩增(“WGA”)。WGA是使用靶核酸序列作为模板使用非特异性引物产生扩增子的等温过程。因为使用多个随机引物，所以可使用WGA扩增包含靶核酸的基本上整个分子。例如，Phi 29DNA聚合酶可与非特异性引物组合使用以扩增靶核酸序列。聚合酶可以沿着靶核酸序列移动，移开互补链。移开的链成为复制的模板，从而允许待生成的高分子量DNA的高产量(yield)。在一个方面中，WGA反应经修饰以包括至少一种解旋酶、至少一种缺口诱导酶，或两者。

在进一步的方面中，通过扩增步骤产生的扩增子可以在扩增之后裂成碎片。

IV．基因分型

A．捕获

在扩增了至少一种靶核酸之后，使它在足以使一种或多种多核苷酸捕获探针与至少一种靶核酸杂交的条件下与所述至少一种多核苷酸探针接触。所述至少一种多核苷酸捕获探针可以是全长、截短或合成的DNA，或全长、截短或合成的RNA。

当期望对多种靶核酸进行基因分型时，应当提供至少一种对于每种靶核酸特异的多核苷酸捕获探针。在一个方面中，使用多个多核苷酸探针纯化靶核酸。所述多个多核苷酸探针可以仅由对于每种靶核酸特异的单一核酸探针组成，或者可由对于每种靶核酸特异的多个核酸探针组成。在一个方面中，可提供对于每种单一靶核酸特异的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种多核苷酸捕获探针。在另一个方面中，选择每种多核苷酸捕获探针以使它在严格条件下仅对于一种靶核酸是特异的并且不与任何其它靶核酸交叉反应。在另外一个方面中，为每种靶核酸提供至少2种多核苷酸捕获探针，其中每个多核苷酸捕获探针与靶核酸的不同区杂交。例如，当靶核酸包括HPV核酸时，可选择至少一种多核苷酸捕获探针使之与待测试的每种HP核酸的E6/E7和L1区的每一个杂交。

多核苷酸捕获探针可适于固定于第二固体支持物。在一个方面中，所述多核苷酸捕获探针在与至少一种靶核酸杂交之前固定于第二固体支持物。支持物包括，但不限于，珠；磁珠，包括顺磁的、反磁的、强磁/铁磁的、强磁/铁磁的和反磁的珠；柱子；板；滤纸；聚二甲基硅氧烷(PDMS)；浸渍片；管；盘；云母(mica)芯片。

在进一步的方面中，第二固体支持物包括珠。在一个方面中，提供了多种珠，其中多种珠的每一种只固定仅对于单一靶核酸特异的多核苷酸捕获探针，从而使每种珠仅特异固定单一的靶核酸。在进一步的方面中，多种珠的每一种带有可检测标签，其中所述可检测标签与珠对其特异的靶核酸的基因型相对应。

在一个方面中，提供了聚苯乙烯微球作为第二固体支持物。聚苯乙烯微球可填充有多种染料，允许每个单个微球成为可检测地标记的。在一个方面中，使用出售的商标名的聚苯乙烯微球。微球的内部用各种浓度的红色和红外荧光团染色，使得可产生100种不同的光谱特征。这样，通过将对于单一靶核酸特异的多核苷酸捕获探针固定于具有单一可鉴定标签的珠组可产生对于100种不同靶核酸特异的微球。

在一个方面中，多核苷酸捕获探针能够杂交或结合与和如下相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%或100%同一性的核酸：HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA、或HR-HPV类型的HPV RNA，或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82的任一个；或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个。在另一个方面中，固定探针与如下互补：HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA、或HR-HPV型的HPV RNA，或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82的任一个或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个。

在另一个方面中，提供了多个多核苷酸捕获探针，选择所述多个探针以与靶核酸的组的每个杂交。在一个方面中，多个多核苷酸捕获探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82核酸或其任何亚组组成。在一个方面中，多个多核苷酸捕获探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组组成。在一个方面中，多个多核苷酸捕获探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组组成。在进一步的方面中，提供了多种第二固体支持物，其由对于靶核酸的组的每个核酸特异的固体支持物组成，所述靶核酸的组由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组组成。

采用适合于本文所述的特定探针和稀释液的杂交条件。例如，可将探针和样品核酸温育一定的杂交时间，优选至少约5-约30分钟，约5-约20分钟，或约7-约15分钟，或约10分钟，以及在所述范围内足以使一种或多种多核苷酸探针与相应的互补核酸序列退火的任意数字。杂交条件可包括如下杂交温度：至少约65°C，约68.5°C，和约67°C-约70°C，以及所述范围内的任意数字。对于给定的至少一种靶核酸和给定探针，本领域的普通技术人员能够通过常规实验容易地确定理想的杂交条件。本领域的普通技术人员会进一步意识到，杂交的时间和温度必须相对彼此进行优化。因此，更高的杂交温度可进行更短的时间，反之亦然。并非限制，可通过提高温度、将离子条件增加至0.5M以上(使用例如NaCl)或降低PAA的浓度而控制严格杂交条件。作为非限制性实例，严格杂交条件可包括在高温进行杂交反应，如至少约65°C，至少约68.5°C，约67°C-约70°C，和约69°C-约70°C。严格杂交条件还可包括高温，如至少约65°C，至少约68.5°C和约67°C-约70°C。

B.检测

在一个方面中，在与其杂交时，固定探针与扩增子形成DNA:RNA杂合体。在这种情况下，可通过提供对于双链DNA:RNA杂合体也为特异的第二抗体进行检测。第二抗体可直接或间接地被可检测标记，并可以是单克隆或多克隆抗体。

可选择地，扩增子可进一步与对于至少一种靶核酸特异的至少一种多核苷酸检测探针杂交。检测探针可为DNA、RNA、synRNA或PNA，并可任选地被可检测标记。在一个方面中，可检测标签是生物素，其可通过将生物素与用荧光团(包括藻红蛋白)标记的抗生蛋白链菌素缀合而检测。

在一个方面中，每种检测探针仅对于单一的靶核酸为特异的，并且不与其它的靶核酸交叉反应。

在另一个方面中，使用多种多核苷酸检测探针。所述多种多核苷酸探针可仅由对于每种靶核酸特异的单一核酸探针组成，或者可由对于每种靶核酸特异的多个核酸探针组成。在一个方面中，可以提供对于每种单一靶核酸特异的1,2,3,4,5,6,7,8,9或10种多核苷酸捕获探针。在另一个方面中，选择每种多核苷酸捕获探针使得它在严格条件下仅对于一种靶核酸为特异的，并且不与任何其它靶核酸交叉反应。在另外一个方面中，为每种靶核酸提供至少2种多核苷酸捕获探针，其中每个多核苷酸捕获探针与靶核酸的不同区杂交。例如，当靶核酸包括HPV核酸时，可对于HPV核酸E6/E7和L1区的每一个选择至少一种多核苷酸。

在另一个方面中，提供了单一的多核苷酸检测探针，其能够在严格条件下与全部的靶核酸杂交。

在一个方面中，多核苷酸检测探针能够杂交或结合与和如下相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%或100%同一性的核酸：HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA、或HR-HPV类型的HPV RNA，或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68或82；或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90或91。在另一个方面中，检测探针与如下互补：HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA、或HR-HPV类型的HPV RNA，或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82的任一个；或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个。

在另一个方面中，提供了多个多核苷酸检测探针，选择所述多个探针以与靶核酸的组的每个杂交。在一个方面中，多个多核苷酸检测探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82核酸或其任何亚组组成。在一个方面中，多个多核苷酸检测探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由LR-HPV类型6,11,40,43,53,61,67,69,70,71,72,81和83组成。在一个方面中，多个多核苷酸检测探针能够与靶核酸的组的每个核酸杂交，所述靶核酸的组由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组组成。

在一个方面中，每种多核苷酸检测探针具有相同的可检测标签。

在另一个方面中，使用多核苷酸检测探针产生双链核酸杂合体，其然后可以通过提供对于双链核酸杂合体也为特异的第二抗体加以检测。第二抗体可直接或间接地被可检测标记，并可为单克隆或多克隆抗体。在一个方面中，第二抗体是单克隆的。在另一个方面中，第二抗体用可检测标志直接标记且是单克隆的。第二抗体用于检测双链核酸杂合体的存在。在一个方面中，第二抗体具有标签，其必须与底物反应以提供可检测的信号。所述第二抗体可溶解在合适的缓冲液中。在一个方面中，所述缓冲液包含100mM TrisHCl,pH7.4,0.5M NaCl,0.1mM ZnCl2,1.0mM MgCl2,0.25%Tween 20,0.2mg/mlRNase A,4%羟丙基-b-环糊精(环糊精),如先前讨论的30%珠稀释缓冲液,0.05%羊IgG，0.05%叠氮化钠。

本领域的技术人员会理解，可使用任何可检测标签，如但不限于，酶、放射性分子、荧光分子、或金属颗粒如金颗粒。在某些方面中，可检测标签可为碱性磷酸酶。将标签与抗体缀合的方法是已知的。例如，可用二硫苏糖醇(DTT)将抗体还原以产生单价抗体片段。然后可将还原的抗体通过Ishikawa等J.Immunoassay 4:209-237(1983)和Means等,Chem.1:2-12(1990)的方法直接缀合于马来酸化的碱性磷酸酶，所述文献每篇的内容通过提述以其整体并入本文，并可通过HPLC纯化最终的缀合物。所述缀合物可使用任何类型的大小排阻层析纯化。纯化的一个益处是一个蛋白与一个抗体的缀合物可与具有其他蛋白-抗体比例的缀合物分离。

在另一个方面中，双链核酸杂合体可用非直接标记的第二抗杂合体抗体检测。例如，第二抗体可为小鼠免疫球蛋白，其可通过标记的羊抗小鼠抗体加以检测。

存在于被标记固体支持物上的标签可用于鉴定靶核酸的特定基因型。检测探针或检测抗体上的标签可传达有关纯化的每种靶核酸的量的信息，而且除此之外，可传达关于靶核酸的基因型的额外信息。

用于检测各种标签的方法是本领域已知的。例如，Coutlee等,J.Clin.Microbiol.27:1002-1007(1989)描述了比色法、放射性、表面等离子体共振或化学发光法，该文件内容通过提述以其整体并入本文。例如，使用试剂如LUMI-PHOS 530试剂(Lumigen,Detroit,MI)或DR2(Applied Biosystems,Foster City，CA)，使用检测器如E/LUMINA发光计(Source Scientific Systems,Inc.,Garden Grove,CA),OPTOCOMPI发光计(MGM Instruments,Hamden,CT)等，如Turner Biosystems的Veritas微孔板发光计通过化学发光检测结合的碱性磷酸酶缀合物。也可以顺序或平行使用多种检测技术。例如，可通过化学发光和荧光检测缀合物。在另一个方面中，可通过化学发光检测偶联物。

使用不同的缀合物检测技术的检测器可为例如以模块的方式可逆或不可逆附接于能够执行用于确定样品中是否存在至少一种靶核酸的方法的仪器。

本文所用的所有探针(包括杂合体、捕获和检测探针)可为短的合成RNA探针，其仅特异性结合至少一种靶核酸。实例在美国专利申请公开No.US2009-0298187A1中描述，该文件内容通过提述以其整体并入本文。

本公开还提供了测定组合物、探针和条件，其中与标准的FDA批准的HPV测定和探针组相比，HR-HPV探针组与LR-HPV类型之间的交叉反应性被显著减少。在一个方面中，HPV高危探针组选自下组：HPV高危类型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82，或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91。使用本测定及这些HR-HPV探针，LR-HPV类型与HR-HPV探针之间的交叉反应性减少。参见，例如，美国专利申请公开No.US 2009-0298187A1。

本公开还提供了用于检测癌症例如宫颈癌的方法和测定，其是通过检测样品中至少一种靶核酸，如HPV，的存在来进行的。

本领域的技术人员会理解，本发明可以在大量平台上进行，包括但不限于，管、浸渍片、微阵列、微孔板、384孔板、其它微滴定板和微流体系统。本领域的技术人员会理解，与发展中国家相关地，本发明对于涉及移动液体的步骤可利用低技术方法，如滴瓶、橡皮球、Pasteur吸管或喷射瓶(squirtbottle)。这些设备可在测定所需的大致范围内传递相对精确的体积。在一个方面中，本公开的方法不包括自动移液器或其它电池供电或能量供电的移液设备。

在一个方面中，通过本文所述的方法在收集介质的约1ml-20ml的体积中在约30分钟-约3小时的时间内可纯化至少一种靶核酸的10个或更少的拷贝或对其进行基因分型。在其他方面中，通过本文所述的方法在收集介质的约1ml的体积中在约30分钟-约1小时的时间内可检测至少一种靶核酸的10个拷贝或更少、25个拷贝或更少、或50个拷贝或更少。在一个方面中，至少一种靶核酸是选自下组的至少一种HPV核酸：HPV高危类型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82，和LR-HPV类型6,11,40,43,53,61,67,69,70,71,72,81和83。

V.试剂盒

还提供了用于检测样品中至少一种靶核酸的试剂盒，该试剂盒包含、由或者基本上由下述组成：

i.收集介质；

ii.变性试剂；

iii.至少一种多核苷酸杂交探针；

iv.用第一抗杂合体抗体涂布的珠；

v.聚合酶；

vi.解旋酶；

vii.多种用固定探针涂布的珠，其中每种珠用一种对于单一靶核酸特异的固定探针涂布，并且其中每种珠被可检测标记；

viii.检测探针，其中该检测探针可任选地被标记，其中该任选的标签选自下组：生物素、His标签、蛋白G、荧光团；和

ix.任选地包括选自下组的检测试剂：与检测探针上的可检测标签反应的化合物，包括抗生蛋白链菌素:HRP复合体；带有第二可检测标签的第二抗杂合体抗体；和

x.清洗缓冲液。

收集介质、变性试剂、珠、第一和第二抗体、多核苷酸探针、检测试剂和清洗缓冲液先前已经描述。

在一个方面中，试剂盒提供有多种杂合体探针、多种捕获探针和多种检测探针，其中每种的多个探针对于由如下组成的靶核酸的组是特异的：HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82,或其任何亚组；和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91,或其任何亚组。

试剂盒还可包括描述与所公开方法和测定相关的步骤的说明。试剂盒还可包括用于抄录(transcribing)患者信息的装置。在一个方面中，该装置包括纸、计算机和能够传送患者信息的设备。试剂盒可包括在获取患者样品的同一地点处完成本方法的全部所需组件。

在一个方面中，试剂盒可包括与检测测定相关的彩色编码试剂。该试剂小瓶被彩色编码以便于使用，并可包括在试剂盒中。试剂瓶也可以用符号、字母或其它已知的标识符标识。

因为试剂盒的各个组分集合在易于使用的平台上，本文所述的试剂盒的一个优点是，它提供样品的立即测试。这允许快速确定患者结果。

在一个方面中，本公开的方法可包括在现场(in the field)对患者样品进行收集、处理和进行纯化步骤。在一个方面中，在收集样品之后，可在收集患者样品的同一地点进行一些方法步骤。该地点可为个人接受医学检查和评估的乡村、诊所、实验室或公用区域。地点可为永久的或者临时的。在一个方面中，核酸在如下地点被检测，例如与获取样品处不同的实验室或临床。在一个方面中，试剂盒设计为在不容易得到医疗保健的发展中国家或地理区域中使用。

本方法进一步与STM和PC样品相容。

下面的实施例只是说明性的，并不意欲以任何方式限制本公开。

实施例

在可以通过上述方法纯化、检测和/或表征的许多可能的靶核酸序列中，HPV核酸序列提供了一种优异的例证实例。

HPV家族的成员与多种不同的病症和/或感染有关，包括寻常疣、生殖器疣、和头、颈、喉、阴茎、肛门、子宫颈、女阴和阴道癌症。迄今已经描述了超过100种类型的HPV病毒，其中56种与黏膜和/或皮肤损伤有关。这56中黏膜和/或皮肤损伤相关的HPV类型通常分为“高危”和“低危”两组。HR-HPV与恶性损伤相关，并可包括例如HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82。LR-HPV与良性损伤有关，并包括例如HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91。

然而，在开发出上述方法之前，没有能够对所有已知HR和LR-HPV类型进行基因分型的测试。其它用于检测HPV的分子诊断方法受限于其多重复合能力，降低了这些方法用于基因分型的有用性。化学发光方法，如杂合体捕获2，灵敏而可靠，但具有同质的输出，需要待检测的每种基因型的单独的孔。PCR和PCR样测试依赖于共有引物(例如GP5+/6+,MY09/MY11等)的使用。这些测试固有地对不同靶物具有不同的效力，导致扩增偏好，使得多重HPV感染的检测困难而且不可靠。此外，荧光基团之间的交叉影响(cross-talk)、扩增过程中的竞争和引物二聚体增加的问题均对能够同时扩增和检测的靶物的数目具有负面影响和限制。而且，另一种限制是靶定扩增子区的尺寸相对较小，这进而导致测定对缺失、突变或插入敏感。例如，如果该靶定区域在病毒整合入宿主基因组过程中发生缺失(如以L1区所示)，则感染将被错失掉。此外，当检测探针靶定的区中存在突变或缺失时，可发生假阴性。

在下面的实施例中，使用上述的方法纯化、检测和表征26种HPV类型，包括所有目前已知的HR-HPV。

实施例1：测定法设计

下面的实施例均采用相同的一般测定法设计。首先，通过使用杂合体捕获从样品分离HPV核酸。然后，用全基因组扩增对分离的HPV核酸进行扩增。随后用固定于独特标记珠的对于每个个体HPV血清型特异的捕获探针根据HPV血清型将扩增的HPV核酸分离。然后，将生物素化的检测探针与分离的HPV核酸杂交，并将抗生蛋白链菌素/藻红蛋白(SA-PE)缀合物与检测探针结合以产生信号。用流式细胞术测量珠的独特标签和由SA-PE产生的信号两者。珠标签用于指示结合到珠上的基因型，而SA-PE信号用于指示结合于每个珠的HPV核酸的存在或缺失。

A.纯化探针制备

设计纯化探针组以能够分离存在的全部HPV血清型的核酸。尽管在原理上探针可为任何长度，但是选择短的25-聚体探针以提供探针设计的灵活性和生产的便利。

使用两个基本标准制备纯化探针组。首先，选择探针使得它们在整个靶基因组中分散，以便捕获基因组的全部区域。其次，在特定区周围簇集多种探针，以确保被测试的每个区得到纯化。

为了使所需探针的总数最小，设计探针使得单一探针能够用作两种或更多种HPV类型的共有探针。为了发现共有序列，对被测试HPV序列以逐个家族(family-wise)的方式进行比对。例如，通过ClustalW对A9(HPV16)家族，包含HPV 16,31,33,35,52,58和67,或A7(HPV18)家族，包含HPV18,HPV39,HPV45,HPV59,HPV68,HPV70和HPV85，的所有成员进行比对，并对连续25聚体序列的存在进行共有序列分析。然后选择这种序列作为探针候选物。根据分析过程中构建的系统进化树，将两个最紧密相关的序列彼此进行比对，并重复共有序列的搜索。这样，设计了表1(下面)中列举的探针。

表1：用于27种类型HPV的纯化探针序列

  SEQ ID NO.  名称  序列  1  HPV16-E6E7-1  AACCGAAACCGGUUAGUAUAAAAGC  2  HPV16-E6E7-2  UUAGAAUGUGUGUACUGCAAGCAAC  3  HPV16-E6E7-3  GGUAUAUGACUUUGCUUUUCGGGAU  4  HPV16-E6E7-4  AGUAUAUAGAGAUGGGAAUCCAUAU  5  HPV16-E6E7-5  ACAACAAACCGUUGUGUGAUUUGUU  6  HPV16-E6E7-6  UUAGGUGUAUUAACUGUCAAAAGCC  7  HPV16-E6E7-7  GAUUCCAUAAUAUAAGGGGUCGGUG  8  HPV16-L1-1  AUGUUGCACGCACAAACAUAUAUUA  9  HPV16-L1-2  GUUCCUAAAGUAUCAGGAUUACAAU  10  HPV16-L1-3  UCCCUAUUUUCCUAUUAAAAAACCU  11  HPV16-L1-4  GUUUGGGCCUGUGUAGGUGUUGAGG  12  HPV16-L1-5  GUCAGCCAUUAGGUGUGGGCAUUAG  13  HPV16-L1-6  UGUGUUUAAUUGGUUGCAAACCACC  14  HPV16-L1-7  GGUGAUUGUCCACCAUUAGAGUUAA  15  HPV16-L1-8  CAGUUAUUCAGGAUGGUGAUAUGGU

  SEQ ID NO.  名称  序列  16  HPV16-A9-1  GAAAUCCUUUUUCUCAAGGACGUGG  17  HPV16-A9-2  CAAUGUGUAGACAUUAUAAACGAGC  18  HPV16-A9-3  UUAGACAUUUAUUUAAUAGGGCUGG  19  HPV16-A9-5  CAUAUGAUAAUCCUGCAUAUGAAGG  20  HPV16-A9-6  AAUAUGAUUUACAGUUUAUUUUUCA  21  HPV16-A9-7  AUCCUUUAUUAAAUAAAUUGGAUGA  22  HPV16/35-A9-8  CUAUUAGUACACAUAAUUAUGAAGA  23  HPV31/35-A9-1  GGUACAAUGGGCAUAUGACAAUGAU  24  HPV31/35-A9-2  GACAAACAGUAUUACAGCAUAGUUU  25  HPV31/35-A9-3  GAUGGUAUAGAUAUAGUGUGUAUGG  26  HPV31/35-A9-4  GAUUAAAUUUGCACGAGGAAAGAGG  27  HPV31-E6E7-1  ACGAUGAACUAAGAUUGAAUUGUGU  28  HPV31-E6E7-2  ACAGAGGUAUUAGAUUUUGCAUUUA  29  HPV31-E6E7-3  UUAAUUAGGUGUAUAACGUGUCAAA  30  HPV31-E6E7-4  AGAAGAAAAACAAAGACAUUUGGAU  31  HPV31-E6E7-5  AGGAAGGUGGACAGGACGUUGCAUA  32  HPV31-L1-1  GAACCAACAUAUAUUAUCACGCAGG  33  HPV31-L1-2  AUCCAUAUUAUUCCAUACCUAAAUC  34  HPV31-L1-3  UCAGGAUUACAAUAUAGGGUAUUUA  35  HPV31-L1-4  GACACUGAAAACUCUAAUAGAUAUG  36  HPV31-L1-5  AAUGUAUAUCAAUGGAUUAUAAACA  37  HPV31-L1-6  CUAUUGGAGAGCAUUGGGGUAAAGG  38  HPV31-L1-7  GGUGAUUGUCCUCCAUUAGAAUUAA  39  HPV31-E6E7-6  UAGUAUAUAGGGACGACACACCACA  40  HPV31-E6E7-7  CUGAAACCCAAGUGUAAACAUGCGU  41  HPV35-E6E7-1  GCUAUGAUUUGUGUAUAGUAUAUAG  42  HPV35-E6E7-2  UCCAGUUGAAAAGCAAAGACAUUUA  43  HPV35-E6E7-3  UUGUAAAUGUGAGGCGACACUACGU  44  HPV35-E6E7-4  AAGAUUUAUUAAUGGGCACAUUUGG  45  HPV35-L1-1  GCACAAACAUCUACUAUCAUGCAGG  46  HPV35-L1-2  CAAUACAGAGUAUUUAGAGUAAAAU  47  HPV35-L1-3  CUAAUAAGUUUGGAUUUCCAGACAC  48  HPV35-L1-4  UGGUUUGGGCCUGUACAGGAGUUGA  49  HPV35-L1-5  GUACAGAUAACAGGGAAUGCAUUUC  50  HPV67-E6E7-1  UAACCGAAAACGGUUUGACCGAAAA  51  HPV67-E6E7-2  CGAAAAACCACGCAACCUGCACGAA  52  HPV67-E6E7-3  CUUUGGAAACCACGGUGCAUGAAAU  53  HPV67-E6E7-4  CUUUGGACAGAAACGAGGUAUAUGA

  SEQ ID NO.  名称  序列  54  HPV67-E6E7-5  UCUGUGAGUGCACUUUGCGUUUGUG  55  HPV67-E6E7-6  AAUCCAGCAGAUGCUUAUGAACACA  56  HPV67-L1-1  UAUUGAAAUAGGGCGAGGACAGCCU  57  HPV67-L1-2  CUGAUAAUAGGGAAUGCUUGUCUAU  58  HPV67-L1-3  UUUGGAACUUAUGAAUACUGUUAUU  59  HPV67-L1-4  GAGCAGGUAAAUUAGGGGAGGAUGU  60  HPV67-L1-5  GCAAACACUUCUGCACUGCAAACCU  61  HPV67-L1-6  GCUAAACCUAAACUAAAACGUUCUU  62  HPV67-L1-7  CAAAACGUAAAAAGGUUAAAAGGUA  63  HPV52-E6E7-1  GUGUAGCUAACGCACGGCCAUGUUU  64  HPV52-E6E7-2  UGCACGAAUUGUGUGAGGUGCUGGA  65  HPV52-E6E7-3  UACAACGAAGAGAGGUAUACAAGUU  66  HPV52-E6E7-4  ACGAAUAGUAUAUAGAGACAAUAAU  67  HPV52-E6E7-5  GGCAUUAUCAAUAUUCACUGUAUGG  68  HPV52-E6E7-6  CUAUGAGCAAUUAGGUGACAGCUCA  69  HPV52-E6E7-7  GCCAGAUGGACAAGCAGAACAAGCC  70  HPV52-L1-1  UAACAGUAGGACAUCCCUAUUUUUC  71  HPV52-L1-2  AAAAAAGUUUUAGUUCCCAAGGUGU  72  HPV52-L1-3  UUUGAUGAUACUGAAACCAGUAACA  73  HPV52-L1-4  AGGGAAUGUUUAUCUAUGGAUUAUA  74  HPV52-L1-5  UGCAAACCUCCUAUAGGUGAACAUU  75  HPV52-L1-6  AGGAUGGGGACAUGGUAGAUACAGG  76  HPV33/58-A9-1  UAGAAGACAGCGGAUAUGGCAAUAC  77  HPV33/58-A9-2  GCUGUACAGAUUGGUGUAUAACAGG  78  HPV33/58-A9-3  AUUGGUUUAGAACAGCAAUGUCAAA  79  HPV33/58-A9-4  UCAUAUUUUGGAAUGAGUUUAAUAC  80  HPV33/58-A9-5  UUUUGGUUGCAGCCAUUAUCAGAUG  81  HPV33/58-A9-6  AAUAGAGGAAGAGGACAAGGAAAAC  82  HPV33/58-A9-7  AUGGAGGAAAUAUCAGCACGUUUAA  83  HPV33/58-A9-8  CAUCACAAAUUGAACAUUGGAAACU  84  HPV33/58-A9-9  GGACAUUGCAACAAACAAGCUUAGA  85  HPV33/58-A9-10  AUUUUAAAUAUUUUAAAGAGGAUGC  86  HPV33/58-A9-11  AAUAUCCACUACUGAAACUGCUGAC  87  HPV33/58-A9-12  CAAAUAGUUUAAAAUGUUUAAGAUA  88  HPV33/58-A9-13  UGAUGUGUAUUAAUUUUCAUGCACA  89  HPV33/58-A9-14  UCUACAAGGCGCAAGCGUGCAUCUG  90  HPV33/58-A9-15  GAAAACAUACCAAUGGAUACCUUUG  91  HPV33/58-A9-16  GCCCUGUGGCACGCCUUGGUUUAUA

  SEQ ID NO.  名称  序列  92  HPV33/58-A9-17  CAGAUGUCCGUGUGGCGGCCUAGUG  93  HPV33/58-A9-18  ACAUUGCAGGCUAAUAAAAGUGAUG  94  HPV33/58-A9-19  CAGUACAUGCAAAUAUCCAGAUUAU  95  HPV52/67-A9-1  GAGAAAUGGUGCAAUGGGCAUAUGA  96  HPV52/67-A9-2  UUUUUAAAAGGUAUACCUAAAAAAA  97  HPV52/67-A9-3  UAACAGUGCAAUACGAUAAUGAUAA  98  HPV52/67-A9-4  CAGAUGUCCGUGUGGCGGCCUAGUG  99  HPV52/67-A9-5  AGGCCACUGUGUACCUGCCUCCUGU  100  HPV52/67-A9-6  UUAGAGGACUGGCAAUUUGGCCUUA  101  HPV52/67-A9-7  CAUGUUUUAAACUGCUUUUAGGCAC  102  HPV18/45-A7-1  AUGCUGCAUGCCAUAAAUGUAUAGA  103  HPV18/45-A7-2  UUAAAACGAAAGUUUGCAGGAGGCA  104  HPV18/45-A7-3  UCAGAUAGUGGCUAUGGCUGUUCUG  105  HPV18/45-A7-4  UUAGAAAUUUUAAAAGUGAUAAAAC  106  HPV18/45-A7-5  UGUAAAUGGGGAGUAUUAAUAUUAG  107  HPV18/45-A7-6  CACCAAAAUUGCGAAGUAGUGUUGC  108  HPV18/45-A7-7  AUGCAUUUCCAUUUGAUAAAAAUGG  109  HPV18/45-A7-8  GAAAGGACAUGGUCCAGAUUAGAUU  110  HPV18/45-A7-9  UUGAUUGUAAUGACUCUAUGUGCAG  111  HPV18/45-A7-10  UACCAGUGACGACACGGUAUCCGCU  112  HPV18/45-A7-11  GUGGUAACACUACGCCUAUAAUACA  113  HPV18/45-A7-12  GUAAUAAAACUGCUUUUAGGCACAU  114  HPV18-E6E7-1  AGGAUCCAACACGGCGACCCUACAA  115  HPV18-E6E7-2  CUUCACUGCAAGACAUAGAAAUAAC  116  HPV18-E6E7-3  AGGUAUUUGAAUUUGCAUUUAAAGA  117  HPV18-E6E7-4  GAGGCCAGUGCCAUUCGUGCUGCAA  118  HPV18-L1-1  UGGUAAUCCAUAUUUUAGGGUUCCU  119  HPV18-L1-2  UUCCUAAGGUUUCUGCAUACCAAUA  120  HPV18-L1-3  AUCCUGAAACACAACGUUUAGUGUG  121  HPV18-L1-4  AGGACGUUAGGGACAAUGUGUCUGU  122  HPV45-E6E7-1  UGACGAUCCAAAGCAACGACCCUAC  123  HPV45-E6E7-2  UAGACACCUUAAGGACAAACGAAGA  124  HPV45-E6E7-3  GUGUGACGGCAGAAUUGAGCUUACA  125  HPV45-E6E7-4  UACAGCAGCUGUUUUUGAGCACCUU  126  HPV45-L1-1  UGUAGGCAAUCCAUAUUUUAGGGUU  127  HPV45-L1-2  UUCCUAAGGUAUCCGCAUAUCAGUA  128  HPV45-L1-3  AUAAUCCUGAAACACAACGUUUGGU  129  HPV45-L1-4  AGGAUGUUAGGGAUAAUGUGUCAGU

  SEQ ID NO.  名称  序列  130  HPV39/68-A7-1  CCAUACAAAUUGCCAGACCUGUGCA  131  HPV39/68-A7-2  UCGGUGUAUGCAACUACAUUAGAAA  132  HPV39/68-A7-3  UACAAUGAAAUACAGCCGGUUGACC  133  HPV39/68-A7-4  UUGUAUGUCACGAGCAAUUAGGAGA  134  HPV39/68-A7-5  GAUGAAAUAGAUGAACCCGACCAUG  135  HPV39/68-A7-6  AGCGUGAGACAGCACAGGUACUUUU  136  HPV39/68-A7-7  AGUGCUAUAGAUAGUGAAAACCAGG  137  HPV39/68-A7-8  GUAAAAGAUUGUGCAACAAUGUGUA  138  HPV39/68-A7-9  AAAUUUCCUAAUGCAUUUCCAUUUG  139  HPV39/68-A7-10  GAAAAGACUUGGUGCAGAUUAGACU  140  HPV39/68-A7-11  GACGAGGAUGAAGGAGACAAUGAUG  141  HPV39/68-A7-12  AAGCAUAUCAAGCUAUUGAACUGCA  142  HPV39/68-A7-13  CAUUGUCCUGACUCUAUGUGCAGUA  143  HPV39/68-A7-14  ACACCAGUACCAACAUUUACAGGCA  144  HPV39/68-A7-15  CAGGUUCGUGUUAGUAAUUUUGAUU  145  HPV39/68-A7-16  CACCCUUCAUCAUUUGUAACAUUUG  146  HPV39/68-A7-17  AUAAUCCUGCUUUUGAGCCUGUUGA  147  HPV39/68-A7-18  GAUCCGGAUUUUCUGGACAUUGUUC  148  HPV39/68-A7-19  UGCAAAUGUCUGCAGAUGUGUAUGG  149  HPV39/68-A7-20  CUAAACACAAACGUAAACGUGUGUC  150  HPV59/70-A7-1  GCAACAGAUACAGGUUCAGACUUGG  151  HPV59/70-A7-2  AUUUGUGUACAGGCAGAGCGCGAGA  152  HPV59/70-A7-3  UUAGUCAUCAUCCUGUCCAGGUGCA  153  HPV70-E6E7-1  UAUAAAACCAUGCAAAAGUUGCUUG  154  HPV70-E6E7-2  CCUGCAGAACGGCCAUACAAAUUGC  155  HPV70-E6E7-3  UGCAUGCCAAAAAUGUAUUAAAUUU  156  HPV70-E6E7-4  GACGUAUACGAAGAGAAACACAAGU  157  HPV70-E6E7-5  ACAUUGCAAGAGAUUGUUUUAGAUU  158  HPV70-E6E7-6  CUACACUGCACUUAGUAGUAGAAGC  159  HPV70-E6E7-7  GCAGCUGUUUAUGGAGACACUGUCA  160  HPV70-L1-1  GGGUAUCCCUACCUGAUCCUAAUAA  161  HPV70-L1-2  UAUAAUCCUGACACACAACGCCUGG  162  HPV70-L1-3  CUUCAGAGUUAUAUAUUAAAGGCAC  163  HPV70-L1-4  AUGUAUAUUCCCCUUCCCCAAGUGG  164  HPV70-L1-5  CACGUAGUACUAAUUUUACAUUGUC  165  HPV70-L1-6  CUGUAUAUAGCCCUACAAAGUUUAA  166  HPV70-L1-7  UCUAAACACAAACGGAAACGUGUGU  167  HPV59-E6E7-1  UUAUAGUGUAUAGAGACUGUACACC

  SEQ ID NO.  名称  序列  168  HPV59-E6E7-2  UUUUAUGCAAGAGUAAGAGAAUUAA  169  HPV59-E6E7-3  UAUUAUAGAGAUUCCGUGUAUGGAG  170  HPV59-E6E7-4  UGCCUAAAACCUCUAUGUCCAACAG  171  HPV59-E6E7-5  ACCACAAAAUUAUGAGGAAGUUGAC  172  HPV59-E6E7-6  CUCCGAGAAUGAAAAAGAUGAACCA  173  HPV59-L1-1  UGGACAUCCAUAUUUUAAAGUACCU  174  HPV59-L1-2  UUCCUAAGGUGUCUGCAUAUCAAUA  175  HPV59-L1-3  UGGAUGACACUGAAAACUCUCAUGU  176  HPV59-L1-4  GAUAAUGUAUCUGUGGAUUAUAAAC  177  HPV59-L1-5  UGAAUCACUAUAUAUUAAAGGUACU  178  HPV59-L1-6  UAUUCCCCUUCCCCAAGUGGGUCUG  179  HPV59-L1-7  GUGCAGCGCCUGCCCCUACCUCUAC  180  HPV59-L1-8  UCUUCCAGAAAAUAGUGUUGUUUGU  181  HPV59-na-1  UGUAUUGUUUGCCUGUUUGUAUGUU  182  HPV59-na-2  CCGUUUUGUUCAAUCUGCUGCUGUA  183  HPV59-na-3  AAGACAGCAACGACAAGCGCGUAGU  184  HPV54-E6E7-1  AAGCGGAUGUAGAAAACAGUUAUUU  185  HPV54-E6E7-2  ACGGACCAGCCGCGUACUCUAGCUG  186  HPV54-E6E7-3  UAUGCAUAGUUUGCAACUUCCUUGU  187  HPV54-E6E7-4  GCAGAGAUUUAUGCAUUUCAAUAUA  188  HPV54-E6E7-5  GUGGAGACACGGCUUUCCACAUGCU  189  HPV54-E6E7-6  AAAUAAAUUAUAGAAGGCAUCGCGA  190  HPV54-na-1  UGCAUGGAAAUGUGGCUACAAUUGA  191  HPV54-E6E7-7  GUGGAGGUGUGUGUUGUAAGACAGU  192  HPV54-E6E7-8  CAUAAGGGUACUGCAGGAACUGCUU  193  HPV54-na-2  AAACGAAAGUAUAUAGGCAGUCCGU  194  HPV54-na-3  GAGUUUUAUGGACCUAGCACGGUCC  195  HPV54-L1-1  UUAUUGGCUGUUGGACAUCCAUAUU  196  HPV54-L1-2  UAUUCCUAAAGUAUCAGGAUAUCAA  197  HPV54-L1-3  CUAUAGGUGAACACUGGGCUAAAGG  198  HPV54-L1-4  GCUGGUGACUGUCCUCCUUUGGAAU  199  HPV54-L1-5  GGAUUUUAAAACCCUACAAACCUCA  200  HPV54-L1-6  AUUUGUAAAUAUCCUGAUUACCUUA  201  HPV54-L1-7  GUAGUACUAACCUAACAUUGUGUGC  202  HPV54-L1-8  UUCUGACUUUAGGGAGUAUAUUAGA  203  HPV54-na-4  UAUGCUGCAACUCCUAGUGGCUCUA  204  HPV70/85-A7-1  UAGAUGACAGUGUAUUUGACCUGUC  205  HPV70/85-A7-2  UAUGGGGACAGUAUGUUUUUUUGUU

  SEQ ID NO.  名称  序列  206  HPV70/85-A7-3  GAGGAAUAUGAUUUACAAUUUAUAU  207  HPV85-E6E7-1  CUACCCGACCCUACAAACUACCAGA  208  HPV85-E6E7-2  AAGAUAUAGAAAUAAGCUGUGUAUA  209  HPV85-E6E7-3  AUAGCGACUCUGUGUAUGGGGAAAC  210  HPV85-E6E7-4  AUGAUAUAUUAAUAAGGUGUUUACG  211  HPV85-E6E7-5  AUAUAAUGAAGUGCAAGAGGUUGAC  212  HPV85-E6E7-6  AGGAAGAAAUAGAUGAACCAGAUAA  213  HPV85-L1-1  AUGACACAGAAAAUUCCCAUGUUGC  214  HPV85-L1-2  GAUAAUGUGUCAGUGGAUUAUAAAC  215  HPV85-L1-3  GGGAACAUUGGGCUAAGGGUACUGC  216  HPV85-L1-4  UGUCCUCCAUUAGAACUAGUAAAUA  217  HPV85-L1-5  GAAACUUAUAUAUAAAAGGUACUAA  218  HPV85-L1-6  UAUUCUCCAUCACCUAGUGGGUCUA  219  HPV85-L1-7  CAUCUGCCAUUACAUGUCAGAAGGA  220  HPV85-L1-8  UAUGAAAAAUUAAAGUUUUGGAAUG  221  HPV85-na-1  GUUUUUACUUGCUUUAAUUACACUA  222  HPV85-na-2  ACAAGAAAUAUCGUUAAAUAGCUAU  223  HPV85-na-3  CAAGGGAGCAUGGUCUUAAAACAAU  224  HPV26/69-E6E7-1  GCAGGUACAGUGUGUAUAUUGCAAG  225  HPV26/69-E6E7-2  GUGCCGCAACCCGAAAUUGACCUAC  226  HPV26/69-E6E7-3  GGACUAUGAACAAUUUGACAGCUCA  227  HPV26/69-E6E7-4  GUAAUAGUAUAGUGCAGCUAGCUGU  228  HPV26/69-E6E7-5  GUACAGGGUGGUUUUCAGUAGAAGC  229  HPV26/69-E6E7-6  AGAACAGCCCGUUGCAAGACAUAAC  230  HPV26/69-E6E7-7  AUACUGAAGUGGAAACUCUUACGCC  231  HPV26/69-E6E7-8  AGUGUGUGUAGUCAGGGGGGGUCAA  232  HPV26/69-na-1  UGUGGCAGGCUCUGUAGCAGAAAGU  233  HPV26/69-na-2  AUUUAUCAAAAAUGGUGCAAUGGGC  234  HPV26/69-na-3  GGCAAAAUAUGUAAAAGACUGUGCA  235  HPV26/69-na-4  GACAGCAAUGGGAAUCCUGUAUAUG  236  HPV26/69-na-5  UGGUCCAGAUUAGAUUUGGAGGAGG  237  HPV26/69-na-6  AUCUACCUGGCAUUGGACCAGUAAU  238  HPV26/69-na-7  GUUUGUGCUUUGCGUGUGUGUGUGU  239  HPV26/69-L1-1  CCUUUGAUAAUCCUGCAUAUGAACC  240  HPV26/69-L1-2  GUACUAGUGACAGCAAGGUAUAUCU  241  HPV26/69-L1-3  GAAACAGCAUGUUUUUUUUUCUUCG  242  HPV26/69-L1-4  ACAACACAUCCUGCCUCCUACGCUU  243  HPV26/69-L1-5  AAUAAAACUGCUGUUAGGCACAUAU

  SEQ ID NO.  名称  序列  244  HPV51/82-E6E7-1  CACUUGGGCCUGAAGAAAAGCAAAA  245  HPV51/82-E6E7-2  GUGUAAUAAAGCCAUGCGUGGUAAU  246  HPV51/82-E6E7-3  AAAUUGACUUGCAAUGCUACGAGCA  247  HPV51/82-E6E7-4  UGGACAGGCUACGUGUUACAGAAUU  248  HPV51/82-E6E7-5  AGCAGCCCAUUAGGAGACAUUACAA  249  HPV51/82-E6E7-6  GAUUACUGGACAGUUAUCCGGACAG  250  HPV51/82-E6E7-7  UGUGGAAGCAACGUUGCAGGUAGAU  251  HPV51/82-na-1  ACAGCCACUAGAGGAUGCUAAAAUA  252  HPV51/82-na-2  GUCCAGAUUAGAUUUGGAGGAGGAA  253  HPV51/82-na-3  UGCCAGGAGAAAAUACUAGACUGUU  254  HPV51/82-na-4  UCAACCUGGCAUUGGACCAGUAAUA  255  HPV51/82-na-5  ACAAGCCAAUAUGUGCUGCUAAUUG  256  HPV51/82-na-6  UGUGUGUGUGUCUUGUGUUGUGUUG  257  HPV51/82-na-7  ACAUGCAAAGCUGCUGGUACAUGUC  258  HPV51/82-na-8  UGGAGUGGGUUGGGUAUAUUUUUGG  259  HPV51/82-L1-1  GAACUUGAAAUGCAGCCUUUACUUU  260  HPV51/82-L1-2  UGUCUUCAUCUUAUGCAAAUGUUAC  261  HPV51/82-L1-3  UGGGGAUUACUAUUUGUGGCCCUAU  262  HPV51/82-L1-4  AAACGCCGUAAACGUAUACCCUAUU  263  HPV51/82-L1-5  UCUUCCUCUUCCUCUUCAGCCAAAC  264  HPV30/53-E6E7-1  CCGAAAACGGUACAUAUAAAAGCAC  265  HPV30/53-E6E7-2  GACACCAGAGGAAAAACAGUUACAC  266  HPV30/53-E6E7-3  AUGAGCAAUUGAACAGCUCAGAGGA  267  HPV30/53-E6E7-4  CAAUGGCGUCACCUGAAGGUACAGA  268  HPV30/53-E6E7-5  UAAAACGAAAGUAUUUAGGCAGUCC  269  HPV30/53-na-1  CAGCGGGUAUGGCAAUACUUUGGAA  270  HPV30/53-na-2  ACACAGUCACUUUUGGUUACAACCG  271  HPV30/53-na-3  GAAAGGACAUGGUCCAGAUUAGAUU  272  HPV30/53-na-4  CGUGCCAGGAGAAAAUUCUAGACUG  273  HPV30/53-na-5  UACAAGUGUGUAAAGCAAAGGCAUG  274  HPV30/53-na-6  UAAAGGCACAUGGGAAGUGCAUAUG  275  HPV30/53-na-7  GUAUUUAUUGUCCCGACUCUGUGUC  276  HPV30/53-L1-1  GAAAUACCUAUGCAAACAUUUGCUG  277  HPV30/53-L1-2  CACAGACCUGCCUUUACAACACGUA  278  HPV30/53-L1-3  GGUGGUGUGCGUUUUAGUAGGCUUG  279  HPV30/53-L1-4  AGAAGUGGCAAACAAAUAGGUGCUC  280  HPV30/53-L1-5  GAUGGCCUAUAUGAUAUUUAUGCAA  281  HPV30/53-L1-6  UUCCCUAUUUUCUUGCAGAUGGCGG

  SEQ ID NO.  名称  序列  282  HPV30/53-L1-7  GCUUAGAGGACAAAUACAGAUAUGU  283  HPV30/53-L1-8  UGUAUGACUGUAUGUAUGUGUAAUG  284  HPV56/66-E6E7-1  CCGAAAACGGUACAUAUAAAAGGCA  285  HPV56/66-E6E7-2  CUCAGAGGAUGAGGAUGAGGAUGAA  286  HPV56/66-E6E7-3  GCGGCCACAGCAAGCUAGACAAGCU  287  HPV56/66-E6E7-4  GCGUUAACAGUAACGUGCCCACUCU  288  HPV56/66-E6E7-5  GCAAGUACAAACAGCACAUGCAGAU  289  HPV56/66-na-1  ACAGACGUUGCAAAAACUAAAACGA  290  HPV56/66-na-2  AUGAAUAUGUGCCAGUGGAUAAAGC  291  HPV56/66-na-3  UGAAGGGGGUGAUUGGAAACCCAUU  292  HPV56/66-na-4  GGAUAACGACGAGGACAAAGAAAAC  293  HPV56/66-na-5  UGUAAAGCAAAAGCAUGUAGUGCAA  294  HPV56/66-na-6  GUCCUGACUCUGUGUCUAGUACCUG  295  HPV56/66-na-7  GUAUCCCACAGACCAGGAAAACGAC  296  HPV56/66-na-8  GUUUGCGCUUUGCUUUUGUGUUUGU  297  HPV56/66-na-9  AUAGGCCUGCAUUUACUACACGUAG  298  HPV56/66-L1-1  GAUAUAAGUCCUAUUGCACAGGCUG  299  HPV56/66-L1-2  AGGCGCCGUAAACGUAUUCCCUAUU  300  HPV56/66-L1-3  CUACCUCCAACACCUGUUUCAAAGG  301  HPV56/66-L1-4  UUCUAUGUGGUUUUACUUACGCAGG  302  HPV56/66-L1-5  AUAAACCUUAUUGGUUGCAACGUGC  303  HPV56/66-L1-6  ACGCGUGGUUGCAUAAACUAAGGUG  304  HPV34/73-E6E7-1  UAAUAAGGUGCGGAAAAUGCCAAAA  305  HPV34/73-E6E7-2  GACAACUCAGAGGAUGAGGAUGAAA  306  HPV34/73-E6E7-3  AGAAGAUGGCUGAUUCAGGUAAUUG  307  HPV34/73-E6E7-4  CGGGAUGGUUUAAUGUAGAAGCCAU  308  HPV34/73-E6E7-5  UGGGGGAUUUUAUUGAUAAUGCACA  309  HPV34/73-E6E7-6  AAUGCAGACAAUGAGGCUAUACGUG  310  HPV34/73-E6E7-7  GAUAUGGCAAUACUGAAGUGGAAAC  311  HPV34/73-E6E7-8  UAGUGGGUCCAGUAGCAUUUCAAAU  312  HPV34/73-na-1  UUUAACAGAGGACGACGACAAGGAA  313  HPV34/73-na-2  AAGCCUUGCAGUAUCACGAUCCAAA  314  HPV34/73-na-3  UGUUGCAACCUCCUCCACCCUUAGA  315  HPV34/73-na-4  GCCUCUGGCAGACUUUUAUUUUCAA  316  HPV34/73-na-5  AACAGGUUAAGGUUGUAGACCCUGC  317  HPV34/73-na-6  CAGCACAGUGACUUGCAUAAUGCUC  318  HPV34/73-na-7  UACUAGAAGUGGCAAACGUAUAGGU  319  HPV34/73-L1-1  AAAGGUAUACCUGCCCCCUGUGUCU

  SEQ ID NO.  名称  序列  320  HPV34/73-L1-2  AAAGUUUCAGGUUUGCAAUACAGGG  321  HPV34/73-L1-3  CUGUUGUAGAUACUACUAGAAGCAC  322  HPV34/73-L1-4  UUUUGGCUUCCUGCAGGCAACUUGG  323  HPV34/73-L1-5  UGCACACACAUUUUUUACCCACCCU  324  HPV6/11-E6E7-1  GAAAACGGUUCAACCGAAAACGGUU  325  HPV6/11-E6E7-2  GACCAGUUGUGCAAGACGUUUAAUC  326  HPV6/11-E6E7-3  ACUGCUGGACAACAUGCAUGGAAGA  327  HPV6/11-E6E7-4  GACCCUGUAGGGUUACAUUGCUAUG  328  HPV6/11-E6E7-5  AGACAGCUCAGAAGAUGAGGUGGAC  329  HPV6/11-E6E7-6  GUUGCUGUGGAUGUGACAGCAACGU  330  HPV6/11-na-7  CGGACGAUUCAGGUACAGAAAAUGA  331  HPV6/11-na-8  CAUUAUGCGACUGUGCAGGACCUAA  332  HPV6/11-na-1  ACAGCCAAAAAAGGUAAAGCGACGG  333  HPV6/11-na-2  GAAAAUGGGGGAGAUGGUCAGGAAA  334  HPV6/11-na-3  GAGGACGAGGAAGAUGGAAGCAAUA  335  HPV6/11-na-4  GGCAGCACAGUUAUAUGUUCUCCUG  336  HPV6/11-na-5  CUACUACAUACACCCCCGCACAGAC  337  HPV6/11-na-6  CUAUGGGAACACCCUUUAGUCCUGU  338  HPV6/11-L1-7  ACGCCGUAAACGUAUUCCCUUAUUU  339  HPV6/11-L1-1  UAGCGACAGCACAGUAUAUGUGCCU  340  HPV6/11-L1-2  CAGGCUUUGGUGCUAUGAAUUUUGC  341  HPV6/11-L1-3  CUGUGGUAGAUACCACACGCAGUAC  342  HPV6/11-L1-4  GAGUAACCUAAGGUCACACACCUGC  343  HPV6/11-L1-5  CCACACCCUACAUAUUUCCUUCUUA

B.固定和检测探针的设计

为了设计固定和检测探针，对所有可得的HPV基因组序列进行比对。从这些比对，根据系统进化树分类，选择HPV类型的最紧密相关的亚组。这些紧密相关的HPV亚组在更小的组内对全长、E6/E7和L1区再次比对。从再次比对序列的非共有区提取每个HPV类型的特异寡核苷酸探针。选择具有25-32bp和55°C-70°C的T_m的探针。然后，使用BLAST搜索将探针针对NCBI数据库中存在的其它HPV类型相比较，以确认它们对每种特定HPV类型的独特性。为每个HPV类型设计了多个探针。表2(下面)中可见根据这个方法产生的探针的完全列表。为了保护防止缺失或突变导致测定中的假阳性，为HPV基因组E6/E7和L1区各自开发一种探针。这对于整合的靶物是特别有帮助的，因为一些区可在整合过程中被破坏。固定探针经修饰以便于结合于检测珠。在下面的实例中，使用微球作为检测珠，其涂覆羧基以便于固定捕获探针。因此，固定探针均含有一个5’氨基-C12修饰。

在下面的实例中，使用SA-PE检测捕获的核酸。因此，下面实例中所有的检测探针均具有5’生物素修饰以便于被SA-PE检测。

表2：E6/E7特异性固定/检测探针

表3：L1特异性固定/检测探针

C.通过杂合体捕获的样品纯化

宫颈临床拭子、液基细胞学样品和尿液均用本公开的方法进行测试并确定是相容的。原则上，可使用任何类型的样品。

将样品的50μl等分试样置于聚苯乙烯杂交板的孔中，并与可从QiagenGaithersburg,Inc.(Gaithersburg,MD)得到的25μl碱性变性剂(DNR)混合。密封平板并振荡混合，然后在57.5°C以900rpm振荡温育15分钟以使样品中的核酸变性。

变性后，向每个反应添加包含在低粘性NextGen PD中的在实施例1中制备的每种纯化探针的纯化探针混合物至终浓度为1nM。振荡平板使之中和。制备在YT阻断剂中的0.02%固体顺磁珠储液，向每个反应添加25μl。然后用透明的密封物封盖平板，并以900rpm振荡在57.5°C温育30分钟。

D.扩增

将实施例1(C)中得到的平板置于磁力架上2分钟。弃去上清，然后用清洁的低皮棉吸附组织(low lint absorbent tissue)如(Kimberly-ClarkWorldwide公司)吸干平板。将珠清洗4次，即向每个孔添加120μl全基因组扩增(WGA)清洗缓冲液(可从Qiagen Gaithersburg公司(Gaithersburg,MD)获得)，等待1-2分钟，倾析并吸干。用小体积多通道移液器(multichannel)排除清洗缓冲液。然后向每个孔添加20μl的WGA反应混合物(在下面的表3中列出)。

表3

WGA反应混合物及QIAGEN REPLI-gMidi RXN混合物

*每20μl反应物0.5μl REPLI-g Midi

*dNTP和引物应在添加至反应混合物之前充分涡旋振荡

将平板振荡混合，然后在30°C温育2小时。可将扩增子保存在-20°C或者可直接进行检测。

E.基因分型

将在实施例1D中产生的扩增子的5μl等分试样转移到新的圆底96孔板中，并与10μl 0.75X DNR混合。然后将平板在70°C温育30分钟以使任何核酸变性。

变性后，向每个孔添加5μl加热到70°C的每种检测探针的5nM储液，并将平板在70°C温育2分钟。添加0.75X HC2-探针稀释液(可从Qiagen Gaithersburg,Inc.(Gaithersburg,MD)得到)的10μl等分试样，然后在平板振荡器上在室温以800rpm混合1分钟。以1000珠/μl(总计5000珠/测定)向每个孔添加微球溶液的5μl等分试样，然后将平板在50°C以400-450rpm振荡温育30分钟。向每个孔添加抗生蛋白链菌素-藻红蛋白溶液(在含有3%TWEEN-20的1X磷酸盐缓冲盐水中的10%羊血清中制备)的10μl等分试样至SA-PE终浓度为400ng/孔。然后将平板在50°C以400-450rpm振荡温育10分钟。最后，通过向每个孔添加150μl H₂O稀释反应混合物。

这样，每个微球与两种对于珠的HPV类型特异的寡核苷酸探针(每个各在E6/E7和L1区中)缀合。每个对于HPV类型特异的珠带有独特的荧光标签。通过将特异的生物素化探针与每个被捕获的靶物结合实现靶物检测。SA-PE与生物素化探针结合，通过激光器激发藻红蛋白后观察到了荧光信号。然后，在发光计上独立地测量每个珠的藻红蛋白标签和荧光标签。珠标签的测量结果指示与每个珠结合的靶核酸的基因型。藻红蛋白标签的测量结果用于确定与每个珠结合的靶物的相对量。然后收集荧光数据以指示样品中存在的每种靶核酸的相对量。

实施例2：证明杂交捕获样品制备对HPV核酸检测的影响

下面的实施例演示了人类基因组DNA对使用实施例1中所述方法检测HPV核酸的抑制效果。

将0,10²或10³个拷贝的含有HPV16基因组的质粒与0,50,100,200,1000或5000ng人基因组DNA混合。对其中一组样品进行杂交捕获纯化，而另一组则不进行。杂交捕获之后，通过全基因组扩增对样品进行扩增，并确定HPV16的存在与否。无杂交捕获样品制备的结果如图1A所示，而具有杂交捕获样品制备的结果如图1B所示。如可见的，杂交捕获样品制备有效去除抑制性DNA，使全基因组扩增高效地进行。这证明，在常规方法下，当存在无关的人类基因组DNA时，由于非期望靶物的无效扩增，HPV靶物的常规扩增被降低。

实施例3：四重感染的检测

使用对于HPV类型6,11,16,18,31,33,45,34,35,52,53,58,59,66,67,68,69,70,73和82的杂交捕获、固定和检测探针，在如实施例1中列出的20重测定中测试含有四重感染的样品。测试样品具有如下四重感染之一：(1)HPV 6,11,16,18;(2)HPV 31,33,45,34;(3)HPV 35,52,53,58;HPV 59,66,67,68;和HPV 69,70,73,和82。结果如图2所示。在上述的方法下，在20重反应中，可以高特异性和灵敏性同时对来自每种HPV类型的10²-10⁷个的四重感染进行检测。

实施例4：小扩增子体积的检测

根据实施例1对HPV 16进行测试，只是分别使用1,2,5,7和20μl的扩增子。结果如图3A所示。结果显示，低拷贝数目的稳固(robust)检测需要小量的扩增子。扩增非常稳固，仅需要小部分的扩增子以使所用的检测方法饱和。小体积的扩增子可以低拷贝扩增子以及高拷贝(>10⁷)扩增子给出强信号。

该过程用0.5和5μl过夜重复。结果如图3B所示。可以显见，如果扩增过夜进行，甚至更少量的扩增子可高效地使用。

实施例5：特异性检测

对含有HPV类型33和58的样品重复实施例1中概述的过程。使用相同的检测探针(对于HPV 33和HPV 58共有的)，并在两种扩增子存在时使用HPV 33或HPV 58捕获探针。当使用HPV 33捕获探针时，只有HPV 33被检测到(见图4A)。当使用HPV 58捕获探针时，只有HPV 58被检测到(见图4B)。图4A和4B显示了对每种捕获探针的结果。因此，特异的扩增子的检测只在正确的捕获珠上发生，而无论检测探针结合两种扩增子的事实。

实施例6：多重实验的灵敏性

使用多重实验，通过对于HPV类型6,11,16,18,26,31,33,34,35,39,45,51,52,53,54,56,58,59,66,67,68,69,70,73,82,和85重复实施例1所概括的过程来测试对26种HPV类型的灵敏性。结果如图5所示。这些结果显示了对每种测试类型在1000个拷贝的测定灵敏性。具体地，对全部26种HPV类型均实现了大于2的S/N。

实施例7：多重实验的特异性

进行多重实验以通过对于包括HPV类型6,11,16,18,26,31,33,34,35,39,45,51,52,53,54,56,58,59,66,67,68,69,70,73,82,和85的样品重复实施例1所概括的过程来测试公开的过程对26种HPV类型的灵敏性。结果如图6所示。这些结果显示，所有的HR-HPV类型在高达10⁶个拷贝的情况下针对其它类型是特异的。如可见的，对于每个测试数据点，所有非特异HPV类型的S/N均小于2.0。只有一个例外，所有特异HPV类型的S/N为约5或者更大。

实施例8：临床样品中单一HPV感染的检测

对临床样品进行实施例1概述的过程，所述样品通过对照测试显示具有HPV类型16感染。结果示于图7中并显示HPV 16的成功检测。

实施例9：临床样品中单一HPV感染的检测

对临床样品进行实施例1概述的过程，所述样品通过对照测试显示具有HPV类型18感染。结果示于图8中并显示HPV 18的成功检测。

实施例10：临床样品中四重HPV感染的检测

对临床样品进行实施例1概述的过程，所述样品通过对照测试显示具有HPV类型16,51,59和82感染。结果示于图9中并显示HPV 16,51,59和82的成功检测。

实施例11：临床样品中双重HPV感染的检测

对临床样品进行实施例1概述的过程，所述样品通过对照测试显示具有HPV类型18和70感染。结果示于图10中并显示HPV 18和70的成功检测。

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应当意识到，多个上面公开的和其它的特征和功能，或者其替代者，可以理想地组合入许多其它不同的系统或应用中。另外，本领域的技术人员随后可实现其中多种目前未预见或未预期的替换、修饰、变化或改进，并且也意图将它们涵盖在所附的权利要求中。