一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、荧光显色剂、阳性对照和阴性对照，阳性对照为副猪嗜血杆菌DNA，阴性对照为蒸馏水。其中环介导等温扩增反应液包括3对引物，即参照副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白基因（palA）的保守区设计了内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。本发明的试剂盒，检测灵敏度高，最低限度可检出0.04pg的基因组DNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的病原检测及可能污染的动物食品中副猪嗜血杆菌的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒。

背景技术

 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是革拉泽氏病（Galasser’s disease）的病原菌，是健康猪上呼吸道的常在菌，在机体受应激或感染导致免疫力下降时引起保育仔猪及青年猪发生纤维素性多发性浆膜炎。近年来，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性疾病常继发Hps感染而增加发病率和死亡率，给养猪业造成了严重的经济损失。

副猪嗜血杆菌的血清型众多，有15个血清型和20%以上未能定型菌株，其中血清1、5、10、12、13和14型为强毒力血清型，血清2、4、15型为中等毒力血清型，血清3、6、7、8、9和11型为无毒力血清型。且各血清型之间交叉保护力弱，疫苗的免疫效果大打折扣，从而更加重了副猪嗜血杆菌的流行，造成更大的损失。因此，迫切需要建立副猪嗜血杆菌的快速诊断技术，为我国副猪嗜血杆菌病的防控提供必要的技术支撑。

 肽聚糖相关脂蛋白（PalA）是细胞膜脂蛋白与肽聚糖相互作用的一类蛋白，其广泛存在于革兰氏阴性细菌中。PalA蛋白在维持细胞外膜的完整性和细菌的致病性方面都起着重要的作用。并且，palA基因在副猪嗜血杆菌中是比较保守的，可以作为副猪嗜血杆菌的诊断基因。

目前已有检测副猪嗜血杆菌的多种方法报道，如检测病原的细菌分离、免疫组化、寡核苷酸特异性捕获圆盘杂交（OSCPH）实验以及根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物建立的PCR方法；并且还有抗体的血清学诊断方法，如补体结合实验（CF）、间接血凝试验（IHA）和间接ELISA方法。但这些方法在成本、敏感度、操作的方便性上存在一定的缺陷，限制了它们在生产中的实际应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术的快速检测副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, Hps）的试剂盒。

本发明提供的副猪嗜血杆菌检测试剂盒，包括针对副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白（Peptidoglycan-associated lipoprotein, PalA）基因的保守区的三对引物，一对引物是与序列表中的序列1结合的内测引物对，一对引物是与序列表中的序列1结合的外测引物对，一对引物是与序列表中的序列1结合的环形引物对。

   所述序列1为 Hps palA基因的序列：

ATGAAAAAACTAGCTAAAGTTTTAATGATTGCGGCACCAGCTTTCGTTTTGGCAGCATGTAGCAGCTCAAACGACAATGCAAGTGCTAATGCAAGTGCTAATGCAGGTCAAACATTCGGTGGTATGTCTGTTCAAGATTTACAAACCCGTTACAACACTGTATATTTTGATTTCGACAGCTACACACTAAAAGCTGAAGATCAACAACTTTTAGATGCACACGCACAATACTTAGTTGCATCTAAAGGCAAAGTAACTGTTGCAGGTCACGCTGATGAGCGTGGTACTCCAGAGTACAACATCGCCTTAGGTCAACGTCGTGCTGACGCAGTTAAAGATTTTTTAGCAACTAAAGGTGCTAGCAACGTGGCAACAGTTTCTTACGGTGAAGAAAAACCAGCAGTATTAGGTCACTCAGAAGCTGATTACTCTAAAAACCGTCGTGCAGTGTTAGAGTACTAA

所述内测引物对包括上游引物（FIP）和下游引物（BIP），所述外测引物对包括上游引物（F3）和下游引物（B3），所述环形引物对包括上游引物对（LF）和下游引物（LB）。其中各引物的序列分别为：

FIP：TTAACTGCGTCAGCACGACGGATGAGCGTGGTACTCCA

BIP：GCAACGTGGCAACAGTTTCTAGTAATCAGCTTCTGAGTGAC

F3：AGTAACTGTTGCAGGTCAC

B3：TGTGTCTTAGTACTCTAACACTG

LF：TGACCTAAGGCGATGTTGTACTC

LB：CGGTGAAGAAAAACCAGCAGTAT

该可视化环介导等温扩增试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为副猪嗜血杆菌DNA；所述阴性对照为蒸馏水。所述环介导等温扩增反应液为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Triton X-100、甜菜碱、dNTP、Bst DNA大片断聚合酶、外测引物对(F3和B3)、内测引物对(FIP和BIP)、环形引物对(LF和LB)。

其中每23μL所述环介导等温扩增反应液中，各组分的物质的量如下：0.5 μL 1.0 mol/L Tris-HCl、0.5 μL 0.5 mol/L KCl、0.5 μL 0.5 mol/L (NH₄)₂SO₄、5-7 μL 20 mmol/L MgSO₄、0.1%（v/v）Triton X-100、2-3 μL 18 mmol/L甜菜碱、2.5 μL 2.5 mmol/L dNTP、1 μL 8U                                                /μLBst DNA 大片断聚合酶、1.6 μL 25 μmol/L FIP、1.6 μL 25 μmol/L BIP、0.4 μL 25 μmol/L F3、0.4 μL 25 μmol/L B3、0.8 μL 25 μmol/LLF、0.8 μL 25 μmol/LLB。

各组分的物质的量优选如下：

0.5 μL 1.0 mol/L Tris-HCl、0.5 μL 0.5 mol/L KCl、0.5 μL 0.5 mol/L (NH₄)₂SO₄、5 μL 20 mmol/L MgSO₄、0.1% Triton X-100、3 μL 18 mmol/L甜菜碱、2.5 μL 2.5 mmol/L dNTP、1 μL 8U/μLBst DNA 大片断聚合酶、1.6 μL 25 μmol/L FIP、1.6 μL 25 μmol/L BIP、0.4 μL 25 μmol/L F3、0.4 μL 25 μmol/L B3、0.8 μL 25 μmol/LLF、0.8 μL 25 μmol/LLB。

    所述试剂盒还包括荧光显色剂，如荧光染料SYBR Green I。

所述试剂盒中环介导等温扩增反应液与荧光显色剂的体积比为23：2-5，优选为23：2。

本发明还提供了一种检测死亡动物中是否携带副猪嗜血杆菌的方法，是用所述的副猪嗜血杆菌检测试剂盒对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带副猪嗜血杆菌；所述环介导等温扩增反应的条件为：55-60℃、30-60min。

所述检测死亡动物中是否携带副猪嗜血杆菌的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80℃反应5min的步骤。

应用本发明提供的试剂盒检测副猪嗜血杆菌，可以通过显色后直接检视判断样本是否含有副猪嗜血杆菌，也可以通过显色后在紫外光照射下检测判断样本是否含有副猪嗜血杆菌。检视时，环介导等温扩增反应液:阳性对照:阴性对照:荧光显色剂的体积配比为23:2:2:2-5。环介导等温扩增反应液:阳性对照:阴性对照:荧光显色剂的体积配比优选为23:2:2:2。

可以通过显色后直接检视判断样本是否含有副猪嗜血杆菌，也可以通过显色后在紫外光照射下判断样本是否含有副猪嗜血杆菌，还可以通过核酸电泳判断样本是否含有副猪嗜血杆菌。

①显色直接检测

在反应管中加入荧光显色剂，直接观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为桔红色。如果装有待检样品的反应管颜色为桔红色，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

②显色后在紫外光照射下进行检测

在反应管中加入荧光显色剂，在紫外光照射下观察有无荧光。装有阳性对照的反应管出现荧光，装有阴性对照的反应管没有荧光。如果装有待检样品的反应管没有荧光，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管出现荧光，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

③核酸电泳检测

在反应管中加入荧光显色剂和上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶电泳后于紫外透射仪照射下观察是否有梯形条带出现。装有阳性对照的反应管在电泳后出现梯形条带，装有阴性对照的反应管在电泳后没有梯形条带出现。如果装有待检样品的反应管在电泳后没有出现梯形条带出现，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管在电泳后出现梯形条带，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

应用本发明提供的副猪嗜血杆菌检测试剂盒进行检测，特异性高且敏感度好，最低限度可检测出0.04pg的核酸DNA，是PCR检测方法敏感度的100倍，且应用本发明提供的副猪嗜血杆菌检测试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，并且检测结果使用荧光染料来观察即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的副猪嗜血杆菌的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。

附图说明

图1为 palA基因的PCR敏感性试验结果（M：2000 bp DNA分子量标准; 1: 4 ng 模板DNA; 2: 0.4 ng模板DNA; 3: 40 pg模板DNA; 4: 4 pg模板DNA; 5: 0.4 pg模板DNA; 6: 阴性对照）

图2为 环介导等温扩增反应的敏感性试验结果（M：2000 bp DNA分子量标准; 1: 4 pg 模板DNA; 2: 0.4 pg模板DNA; 3: 40 fg模板DNA; 4: 4 fg模板DNA; 5: 0.4 fg模板DNA）

图3为 环介导等温扩增反应的特异性试验结果（M：2000 bp DNA分子量标准; 1: 猪链球菌; 2: 猪多杀性巴氏杆菌; 3: 猪胸膜肺炎放线杆菌; 4: 空白对照; 5: 副猪嗜血杆菌）

图4为 环介导等温扩增反应的临床试验结果（M：2000 bp DNA分子量标准; 1: 空白对照; 2: 血清1型; 3: 血清2型; 4: 阴性对照; 5: 血清4型; 6: 血清5型; 7: 血清10型; 8: 血清12型; 9: 血清13型; 10: 血清14型）。

具体实施方式

应用本发明提供的试剂盒检测副猪嗜血杆菌可包括如下步骤：

（1） DNA的提取

本发明提供的试剂盒可用于检测鼻腔、支气管分泌物、肺部病变、扁桃体、关节囊液、胸水和腹水中的副猪嗜血杆菌。不同来源的总DNA提取可参考相应资料，或使用相应DNA提取试剂盒。

（2） 环介导等温扩增

①   在装有23μL的环介导等温扩增反应液的反应管中加入2μL模板DNA；

②   于55－60℃水浴锅中放置30－60min，取出；

在步骤②完成后，取出前，可以再调水浴锅温度到80℃反应5min，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。

（3）结果判定

可以通过显色直接检视判断样本是否含有副猪嗜血杆菌，也可以通过显色后在紫外光照射下检测判断样本是否含有副猪嗜血杆菌，还可以通过核酸电泳判断样本是否含有副猪嗜血杆菌。

①显色直接检测

在反应管中加入荧光显色剂，直接观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为桔红色。如果装有待检样品的反应管颜色为桔红色，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

②显色后在紫外光照射下进行检测

在反应管中加入荧光显色剂，在紫外光照射下观察有无荧光。装有阳性对照的反应管出现荧光，装有阴性对照的反应管没有荧光。如果装有待检样品的反应管没有荧光，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管出现荧光，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

③核酸电泳检测

在反应管中加入荧光显色剂和上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶电泳后于紫外透射仪照射下观察是否有梯形条带出现。装有阳性对照的反应管在电泳后出现梯形条带，装有阴性对照的反应管在电泳后没有梯形条带出现。如果装有待检样品的反应管在电泳后没有出现梯形条带出现，则说明副猪嗜血杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管在电泳后出现梯形条带，则说明样品中副猪嗜血杆菌检测结果为阳性。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒的制备

1.引物的合成

人工合成以下3对引物：

2.配制环介导等温扩增反应液

每23μL 环介导等温扩增反应液，含有如下组分：Tris-HCl （1.0 mol/L）0.5 μL 、KCl （0.5 mol/L）0.5 μL、(NH₄)₂SO₄（0.5 mol/L）0.5 μL、MgSO₄（20 mmol/L）5 μL、0.1% Triton X-100、甜菜碱（18 mmol/L）3 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL、Bst DNA 大片断聚合酶（8U/μL）1 μL、FIP 和BIP（25 μmol/L）各1.6 μL、F3和B3（25 μmol/L）各0.4 μL、LF 和LB（25 μmol/L）各0.8 μL。

3.试剂盒的组装

该试剂盒由如下物质组成：步骤二配制的环介导等温扩增反应液、副猪嗜血杆菌DNA（阳性对照）（福建省农科院畜牧兽医研究所保存）、蒸馏水（阴性对照）、荧光染料SYBR Green Ⅰ。

实施例2：

palA基因的PCR敏感性试验：

将制备的副猪嗜血杆菌基因组DNA按10倍递增稀释，使用蛋白核酸定量仪测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为4ng、0.4ng、40pg、4pg、0.4pg。对各浓度DNA用建立的检测palA的PCR方法进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR的敏感性试验结果如图1所示，表明该PCR方法对副猪嗜血杆菌基因组DNA的最小检测限度为4pg。

试剂盒的敏感性试验：

以浓度分别为4pg、0.4pg、0.04pg、4fg、0.4fg的副猪嗜血杆菌基因组DNA作为待检模板DNA；在反应管中加入所述环介导等温扩增反应液23 μL，2 μL模板DNA，混匀；把反应管置入水浴锅55℃水浴30 min后取出，在80℃水浴中再反应5分钟；2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果如图2所示，该方法对副猪嗜血杆菌基因组DNA的最小检测限可达0.04pg，为PCR敏感性的100倍。

实施例3

试剂盒的特异性试验：

以副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌的基因组DNA为待检模板DNA；在反应管中加入所述环介导等温扩增反应液23 μL，2 μL模板DNA，混匀；把反应管置入水浴锅55℃水浴40 min；在80℃水浴中再反应5分钟；2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果如图3所示，只有副猪嗜血杆菌基因组DNA样品为阳性结果，而猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌的基因组DNA均没有特征性梯形条带出现。

实施例4：

 试剂盒的临床样品检测

以分离的8株有毒力不同血清型副猪嗜血杆菌基因组DNA为待检模板DNA；在反应管中加入所述环介导等温扩增反应液23 μL，2 μL模板DNA，混匀；把反应管置入水浴锅55℃水浴50 min；在80℃水浴中再反应5分钟；2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。如图4所示，经环介导等温扩增，临床分离的8株有毒力不同血清型副猪嗜血杆菌均出现了特征性梯形条带。

实施例5：

环介导等温扩增反应结果的荧光可视化观察

以所述试剂盒中的阳性对照和阴性对照为待检模板DNA；在反应管中加入所述环介导等温扩增反应液23 μL，2 μL模板DNA，混匀；把反应管置入水浴锅55℃水浴60 min；在80℃水浴中再反应5分钟；在反应结束后的产物中加入2 μL SYBR Green Ⅰ染料；肉眼可见副猪嗜血杆菌阳性对照管中溶液迅速变绿，而阴性对照管溶液则为较浅的桔红色；在紫外光下阳性管溶液发出明亮的荧光，阴性对照管溶液则没有荧光。

<110>  福建省福州市福建省农业科学院畜牧兽医研究所

 

<120>  一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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