副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

摘要

副猪嗜血杆菌病（Haemophilusparasuis，Hps）又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称革拉瑟氏病(Glasser'sdisease)，由副猪嗜血杆菌引起。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，在正常条件下不表现任何临床症状，但在特定条件下可引起严重的全身性疾病。该菌在环境中普遍存在，世界各地都有。近些年来随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业发展的新发细菌性传染病，它常作为继发的病原菌和其它主要病原混合感染，给全球的养猪业带来了巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展，故建立快速、准确的检测方法是成功防治该病的关键。
　　 目前针对副猪嗜血杆菌的检测方法主要有细菌分离培养、免疫学（抗体监测）方法及PCR法。但副猪嗜血杆菌的分离培养操作极其繁琐，检测所需时间长且灵敏度低;免疫学方法的灵敏度也不理想，PCR法虽敏感、快速但其需要昂贵的仪器设备和繁琐的过程，使其很难在基层推广应用。
　　 环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由日本科学家Notomi研发的新型核酸扩增技术，它能够在恒温条件下特异性地扩增靶序列，该法以高效、快速且成本低廉、操作简便等优点迅速在诸多领域广泛应用。
　　 本试验是采用环介导等温扩增技术检测副猪嗜血杆菌，以副猪嗜血杆菌的高保守序列OMPP2基因序列(NZ_ABKM01000007.1)为靶基因，根据LAMP引物设计的原则，应用PrimerExplorer3.0软件针对6个特定区域，设计出4条特异性引物。在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，对模板DNA进行等温扩增，并对LAMP反应体系中内外(F3∶FIP和B3∶BIP)引物、MgSO4、dNTP及Bst酶的浓度、反应时间和反应温度等扩增条件进行优化，最终确定了25μL的LAMP最佳反应体系:内引物(FIP和BIP)各1.6mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2mmol/L;镁离子的浓度为3.0mmol/L;dNTP浓度为3.0mmol/L;8U的BstDNA聚合酶的添加量为0.8μL，2.5μL10×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2μLDNA模板，并用无菌双蒸水补足体系。LAMP的基本反应过程为:先将反应混合物置于62℃水浴锅中反应40min，然后在80℃水浴锅中水浴10min终止反应，反应结束后肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀来判断LAMP反应是否发生，亦可加入荧光染料或用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　 以PCR方法作为对照，测定LAMP法的灵敏度。结果表明，PCR最低检测DNA量为20pg/μL;而LAMP最低检测DNA量为0.2pg/μL，LAMP比PCR方法敏感100倍;同时利用LAMP方法对猪胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪肺炎支原体9种常见病原进行特异性试验，结果表明，9种病原体LAMP反应均为阴性，说明LAMP方法具有良好的特异性。
　　 综上，本试验建立的LAMP体系为检测副猪嗜血杆菌提供了快速、灵敏、特异高效的检测方法。该法操简便易行，对操作人员技术水平要求并不高且不需要昂贵的仪器设备，对于基层和实验室应用均具有良好前景。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究现状

1．2 副猪嗜血杆菌简介

1．2．1 副猪嗜血杆菌发现历史

1．2．2 副猪嗜血杆菌的基本特征

1．2．3 副猪嗜血杆菌的毒力因子

1．2．4 副猪嗜血杆菌的病原学

1．2．5 副猪嗜血杆菌的流行病学

1．2．6 致病机理

1．2．7 临床症状

1．2．8 病理变化

1．3 检测方法研究现状

1．3．1 直接涂片镜检

1．3．2 细菌的分离培养及培养特性检查

1．3．3 生化试验

1．3．4 乳胶凝集试验快速检测方法

1．3．5 免疫组化法诊断

1．3．6 酶联免疫吸附试验

1．3．7 聚合酶链式反应(PCR)

1．4 预防与治疗

1．4．1 预防

1．4．2 治疗

1．5 环介导等温扩增(LAMP)技术

1．5．1 LAMP法的概述

1．5．2 LMMP法的引物设计原理

1．5．3 LAMP引物设计的注意事项

1．5．4 LAMP法的基本原理

1．5．5 LAMP的反应体系

1．5．6 扩增结果的检测方法

1．5．7 LAMP法的应用

2 材料与方法

2．1 主要试剂与菌株

2．1．1 试验菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试验所用溶液及其配制

2．2 菌种的培养

2．3 涂片镜检

2．4 细菌DNA的提取

2．5 LAMP及PCR引物设计、反应体系及主要操作

2．5．1 PCR引物设计

2．5．2 引物的处理

2．5．3 LAMP和PCR反应体系

2．5．4 LAMP扩增法和PCR扩增法的操作程序

2．5．5 LAMP反应条件优化

2．6 LAMP引物特异性的检测

2．7 副猪嗜血杆菌的敏感性试验

2．7．1 LAMP反应的敏感性试验

2．7．2 PCR反应的敏感性试验

2．8 LAMP扩增产物的分析

2．8．1 LAMP扩增产物可视结果的分析

2．8．2 LAMP扩增产物凝胶成像分析

3 结果与分析

3．1 所培养菌株涂片镜检的结果

3．2 LAMP反应条件的优化

3．2．1 引物比梯度的优化

3．2．2 镁离子梯度的优化

3．2．3 dNTPs梯度的优化

3．2．4 Bst DNA聚合酶的优化

3．2．5 温度梯度的优化

3．2．6 时间梯度优化的结果

3．3 LAMP特异性的研究

3．4 LAMP和PCR检测副猪嗜血杆菌灵敏度的比较

3．5 荧光染料法对扩增产物的分析

3．6 LAMP检测方法的临床应用

4 讨论

4．1 靶基因OMP P2基因的选择

4．2 LAMP反应体系的分析

4．2．1 镁离子浓度

4．2．2 dNTPs浓度

4．2．3 甜菜碱

4．2．4 环引物

4．2．5 温度对LAMP扩增反应的影响

4．3 LAMP操作过程中假阳性的问题

5 结论

参考文献

作者简历

致谢