由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法

摘要

本发明的课题在于提供高效的由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法，还提供能够高效地向成牙本质细胞分化诱导的分化诱导剂；所述由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法使用能够激活Wnt信号传导途径的物质；另外，所述分化诱导剂包含能够激活Wnt信号传导途径的物质；具体地说，所述物质是选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种。

说明书

技术领域

本发明涉及有关牙本质的再生医疗的领域。具体地说，涉及位点特异性地诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化的方法，还涉及由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂。进而，涉及含有上述分化诱导剂作为有效成分的盖髓材料。

本申请要求用以参考在此引用的日本申请特愿2009-262378号优先权。

背景技术

以往，在龋齿(虫牙)的治疗中，采用如下治疗的方法：龋齿部分通过切削而去掉，用树脂或石膏充填该切削的部分，以使其人工恢复。在龋齿引起的龋洞大时，将软化牙本质留下一部分的情况下暂时中止牙髓的切削，使用氢氧化钙作为盖髓材料。

牙髓是填满存在于牙内部的称作牙髓腔的空洞的血管性结合组织，是由来自中胚层的牙乳头形成的非钙化组织。相对于此，牙本质是存在于牙髓腔周围的硬的钙化组织。一直以来，根据牙髓为软组织、牙本质为硬组织这样的结构特征，二者作为完全不同的物质被处理。但是，近年来，牙髓和牙本质无论是在胚胎学上还是在功能上都是相同的组织，在临床上，理解为牙本质-牙髓复合体(Dentin-PulpComplex)的倾向也较强。

牙患龋齿时，根据其程度，实施不去除牙髓而进行保护的治疗(直接牙髓覆盖)、仅去除牙髓的一部分(冠部牙髓)而保存根部牙髓的治疗(活髓切断)、去除全部牙髓后用金属或树脂添堵空洞的治疗(拔髓)等。但是存在如下问题：去除牙髓后，由于向牙的营养供给被断绝，因而牙本质产生脆化，并且由于没有传达疼痛的神经，因而再次龋齿进行时得不到自觉症状而恶化。因此，近年来人们认为，为了维持牙的健康状态，优选尽可能保存牙髓。为了保存牙髓并维持其功能，根据牙本质的破损状态和牙髓的病理状态，使用间接盖髓材料或直接盖髓材料。间接盖髓材料用于牙本质破损但牙髓未露出的状态，直接盖髓材料在牙髓露出的情况或通过治疗切断牙髓的一部分的情况下使用。作为直接盖髓材料，以往使用了氢氧化钙制剂、甲醛甲酚制剂。然而，氢氧化钙没有诱导成牙本质细胞的作用，不能期待促进牙本质形成。目前，作为具有促进牙本质形成作用的物质，报道了牛血液提取物(专利文献1)、N-乙酰-葡萄糖胺等多糖类(专利文献2)、骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein：BMP)等。

氢氧化钙在三个月左右对牙髓内的成牙本质细胞给予刺激，从而促进牙髓腔内的第二牙本质的生成。其结果是，在软化牙本质和牙髓之间形成健全的牙本质，其后软化牙本质被去除。但在该方法中，氢氧化钙没有促进牙髓细胞增殖的作用或诱导成牙本质细胞的作用，因此在与氢氧化钙接触的牙髓面上产生强碱引起的坏死层。另外，在该方法中，使牙髓组织变性坏死，在其后的修复过程中使牙本质再生，因此存在需要时间、效率差、预后不确定等的问题。

牙本质是占牙的大部分的硬组织，其以支持内部的牙髓或周围的牙釉质和牙骨质的形式存在。牙本质通过从成牙本质细胞合成、分泌的有机性基质进行钙化而形成。该有机性基质大部分是胶原，剩余的约10％为非胶原蛋白(noncollagenous protein：NCP)。已知，NCP中最多的是牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphprotein：Dspp，以下简称为“Dspp”。)，其在成牙本质细胞中合成后，由该蛋白质生成牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质糖蛋白(DGP)、牙本质磷蛋白(DPP)。

关于由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法以及牙本质的再生方法，正在进行各种研究。作为代替氢氧化钙的物质，公开了以BMP为有效成分的牙本质形成盖髓剂(材料)(专利文献3)。BMP等骨诱导因子的使用是着眼于形成牙本质的钙化基质的成分与骨非常相似这一点，是在产生牙本质的应用中进行的尝试。然而，如B MP这样的因子虽然在促进已分化的成牙本质细胞产生钙化基质的方面上有效果，但不是促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化的物质，因此在患部组织中诱导成牙本质细胞这一点上效果非常有限。

有人提出了使天然的牙本质再生而用于治疗的方法，并进行研究。例如有下述报道：将在羟基磷灰石和磷酸三钙的复合体的粉体中接种了培养人牙髓细胞的试样移植到裸鼠皮下6周后摘出，由摘出后的苏木精/伊红染色图确认到硬组织的形成(非专利文献1)。还有下述报道：对于由该试样提取的RNA使用RT-PCR进行评价，其结果是表达了成牙本质细胞的分化标志的mRNA、即，得到的硬组织为牙本质样组织。但是，所形成的硬组织的量非常少，在临床应用中需要更大量的牙本质再生。

作为关于牙本质再生的其他技术，公开了含有使胶原固定化的乙烯一醋酸乙烯酯共聚物皂化物(A)以及粘合剂(B)而形成的牙本质再生盖髓剂(材料)(专利文献4)。所述牙本质再生用盖髓剂(材料)，在确保具有再生牙本质能力的细胞增殖的支架的功能方面优异。进而，作为使牙本质再生的方法，公开了如下方法：通过将人牙髓细胞在1，25(二羟基)维生素D3、地塞米松和β-甘油磷酸钠的存在下进行培养而使其分化为成牙本质细胞，将该细胞与载体等一起培养和/或移植，由此使牙本质再生(专利文献5、6)。另外，作为其他的方法，公开了使用多聚磷酸的牙本质形成盖髓剂(材料)(专利文献7)。但是，这些都是示出涉及由成牙本质细胞向牙本质再生的技术，并不是诱导牙髓向成牙本质细胞分化的技术。

已知牙的发育是通过牙源性上皮和牙源性间充质组织的紧密的相互作用而进行的。可以认为，神经嵴来源的间充质细胞接受来自外胚层系的上皮组织的信号而向牙髓细胞分化，且各种生长因子参与该过程。作为与牙的发育有关的信号，已知的有BMP、成纤维细胞生长因子(FGF)、Wnt、音猬因子(Shh)等。另外，还有启示T GF(transforming growth factor、转化生长因子)-β参与成熟牙髓的成牙本质细胞分化的报道。

在上皮和间充质组织之间存在基底膜，该基底膜的构成要素之一为蛋白聚糖。由最近的研究表明，基底膜的蛋白聚糖的糖链在Wnt信号的传导中起着重要的作用(非专利文献2)。有文献报道，在发育的阶段中，Wnt在神经嵴细胞中诱导Dspp的分泌(非专利文献3)。即，在非专利文献3中，虽然对牙的发育阶段中的Wnt进行报道，但是没有在已形成的牙中，Wn参与由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化或再生的报道。

有文献报道，对于小鼠p 14下颌磨牙组织，使用[_α-35S]UTP标记RNA探针，并利用原位杂交(in situ hybridization)进行确认，结果发现Wnt10a在基底膜上表达，并且发现作为成牙本质细胞特异性细胞外基质的Dspp与Wnt10a同样地在基底膜上表达(参见非专利文献4：图1)。另外还有报道，使Wnt10a针对作为未分化间充质系细胞的C310T1/2强制表达，在基质胶(基底膜成分提取物)中进行培养，结果在10天后显示Dspp mRNA的表达。(参见非专利文献4：图2)。

Wnt信号逾越生物种而被保存下来，其控制发育初期时的体轴形成或器官形成、细胞的增殖或分化。已知在Wnt信号传导途径中至少存在如下3种途径：1)通过β-连锁蛋白的细胞内蓄积而控制转录因子的β-连锁蛋白途径、2)藉由作为低分子量G蛋白质的Rho家族而控制平面内细胞极性(planar cell polarity)的P CP途径、3)藉由三聚体G蛋白质在细胞内引起Ca²⁺的动员，激活蛋白激酶C(PKC；proteinkunase C)或CaMK II(Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II、钙调蛋白依赖性蛋白激酶II)等的Ca²⁺途径(非专利文献5)。但是，诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化来形成牙本质的方法尚未阐明。

【现有技术文献】

专利文献

专利文献1：日本特开2002-363084号公报

专利文献2：日本特开平06-256132号公报

专利文献3：日本特开平06-340555号公报

专利文献4：日本特开2004-292433号公报

专利文献5：日本特开2005-341961号公报

专利文献6：日本特开2006-211957号公报

专利文献7：日本特开2005-263681号公报

非专利文献

非专利文献1：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(25)，13625-30(2000)

非专利文献2：J Cell Biol.，162(2)，341-51(2003)

非专利文献3：Differentiation，75(5)，52-62(2007)

非专利文献4：European Cells and Materials，Vol.14，Suppl.2，140(2007)

非专利文献5：蛋白质核酸酵素，Vol.49(10)，1421-1427(2004)

发明内容

本发明的课题在于提供高效的由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法，还提供能够高效地向成牙本质细胞分化诱导的分化诱导剂。

本发明人等为了解决上述课题，着眼于Wnt信号在成牙本质细胞的分化中的参与，反复进行深入研究，结果首次发现，如果使用能够激活Wnt信号传导途径的物质，具体使用选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种培养牙髓细胞，则在培养的牙髓细胞中生成作为成牙本质细胞特异性细胞外基质的Dspp，从而完成本发明。

即，本发明包括以下内容。

1.一种由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法，其特征在于，使用能够激活Wnt信号传导途径的物质。

2.根据前项1所述的分化诱导方法，其中，能够激活Wnt信号传导途径的物质为能够直接或间接激活Wnt信号传导途径的物质。

3.根据前项2所述的分化诱导方法，其中，能够间接激活Wnt信号传导途径的物质为能够调节硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物质。

4.根据前项3所述的分化诱导方法，其中，能够调节硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物质为能够从硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的物质。

5.根据前项1～4中任一项所述的分化诱导方法，其中，能够激活Wnt信号传导途径的物质为选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种。

6.根据前项1～5中任一项所述的分化诱导方法，其中，Wnt为Wnt10a。

7.一种由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂，其包含能够激活Wnt信号传导途径的物质。

8.根据前项7所述的分化诱导剂，其中，能够激活Wnt信号传导途径的物质为选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种。

9.一种盖髓材料，其以前项7或8所述的分化诱导剂为有效成分。

10.根据前项9所述的盖髓材料，其进一步含有纤维连接蛋白。

(发明效果)

如果使用能够激活Wnt信号传导途径的物质，具体使用选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种，则在牙髓来源的细胞株中，作为成牙本质细胞特异性细胞外基质的Dspp的表达有意义地增强。其结果是，能够激活Wnt信号传导途径的物质、具体地说选自氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种可以成为由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂。进而，含有本发明的分化诱导剂作为有效成分的盖髓材料不仅保护露出的牙髓面，而且具有诱导牙髓向成牙本质细胞分化并促进其后的牙本质形成的作用。

附图说明

图1为显示在作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞中添加各浓度的氯酸钠进行培养时的D spp的表达的图。(实施例1)

图2为显示在作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞中添加各浓度的氯化锂进行培养时的Dspp的表达的图。(实施例2)

具体实施方式

本发明涉及的是由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法，其特征在于，使用能够激活Wnt信号传导途径的物质。

本发明人等确认到，Dspp的诱导仅限于将Wnt10a表达细胞在由基底膜成分提取的成分制备的基质胶上培养时的情况，并发现了向成牙本质细胞的分化需要基于Wnt信号、以及同时包含在基底膜中的某些成分的控制。本发明人等基于该发现，对作为硫酸基转移酶的Sulf1和Sulf2双基因敲除小鼠牙的表型进行观察，结果确认到，与野生型相比，双基因敲除小鼠的牙本质的形成被有效地抑制。

基于上述发现，本发明人等使能够激活Wnt信号传导途径的物质作用于牙髓来源细胞株，而首次确认到向成牙本质细胞的分化诱导作用。其结果确认到，在使能够激活Wnt信号传导途径的物质起作用的牙髓来源细胞株中生成Dspp，该Dspp作为非胶原蛋白在由成牙本质细胞合成、分泌的有机性基质中发现最多。

在本发明中，能够激活Wnt信号传导途径的物质，既可以是能够直接激活Wnt信号传导途径的物质，也可以是能够间接激活Wnt信号传导途径的物质。作为能够直接激活的物质，例如可以举出选自氯化锂、Norrin和R-Spondin2中的任一种，作为能够间接激活的物质，例如可以举出氯酸钠、高氯酸钠或硫酸基转移酶。

在此，能够直接激活Wnt信号传导途径的物质，是指直接作用于经典的Wnt信号传导途径中起作用的物质，而激活Wnt信号传导途径的物质。经典的Wnt信号传导途径、具体地说Wnt/β-连锁蛋白途径调节脊椎动物和无脊椎动物发育中的细胞命运决定。Wnt配体是与分泌性Frizzled受体结合的糖蛋白，由此引起信号级联，结果是使多功能激酶：GSK-3β从APC/Axin/GSK-3β复合体中解离。在此，GSK-3在Wnt信号传导途径中具有抑制性作用是公知的(Cell Research，15(1)：28-32(2005))。氯化锂被认为具有抑制GSK-3的作用(J BiolChem.，275(21)：15765-72(2000))。从上述的观点考虑，作为能够直接激活Wnt信号传导途径的物质，具体可以举出氯化锂。GSK-3在Wnt信号传导途径中具有抑制性作用，因此通过加入氯化锂，能够激活Wnt信号传导途径。Norrin和R-Spondin2都被认为是能够直接激活Wnt信号传导途径的蛋白质。

在此，能够间接激活Wnt信号传导途径的物质，可以举出能够调节硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物质。由最近的研究表明，基底膜的蛋白聚糖的糖链在Wnt信号的传导中起着重要的作用。Wnt与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的糖链非常紧密地结合，但在硫酸基转移酶的作用下硫酸乙酰肝素的硫酸基解离时糖链对于Wnt的亲和性下降，Wnt从与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合中解离而传递到Wnt受体，其结果是Wnt信号被激活。在本发明中，能够调节硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Wnt的相互作用的物质，可以举出能够使硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Wnt的亲和性下降的物质。作为这样的物质，可以举出能够从硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的物质。具体地说，可以举出氯酸钠、高氯酸钠或硫酸基转移酶等，优选为氯酸钠、高氯酸钠。氯酸钠具有能够从硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基的作用(J Biol Chem.，263(26)：12886-92(1988))。通过从硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中去除硫酸基，糖链对于Wnt的亲和性下降，其结果是Wnt从与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合中解离而传递到Wnt受体，从而Wnt信号传导途径被激活。

Wnt是细胞间信号分子之一，作为Wnt家族，目前已知的有17种以上。发现Wnt10a在基底膜上表达，在Wnt10a以外的Wnt分子中，发现Wnt5a和Wnt10b在成釉质细胞或成牙骨质细胞中表达。在本发明中，在Wnt信号传导途径中被激活的Wnt的种类没有特别限定，但是为了诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化，特别适合的是激活包含Wnt10a的途径。

牙是由牙胚形成，经过蕾状期、帽状期、钟状期这样的过程进行生长，而在口腔内萌出。牙胚是牙及牙周组织的原基，来源于外胚层间充质组织。另外，牙胚分为成釉器、牙乳头、牙囊的三个组织。牙由牙釉质、牙本质、牙骨质的3大硬组织构成。在这些硬组织的内部(牙髓腔)有牙髓，在牙髓的外侧存在有牙本质。牙髓的来源与牙囊细胞相同。在此，牙囊细胞是来源于发育期中可见的牙乳头的间充质组织，认为其分化成牙周膜、牙骨质、牙槽骨等的牙周组织细胞。成牙本质细胞存在于牙髓的最外层，成牙本质细胞的分化仅在上皮和间充质组织的边界部产生。

在所有的组织或器官的上皮中存在支持它们的被称为基底膜的特殊的细胞外基质(ECM)。基底膜存在于牙釉质等的上皮细胞层和间质细胞层(牙髓细胞层)等之间。作为构成基底膜的物质，可以举出IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以在被称为核心蛋白质的成为核的蛋白质，例如在基底膜蛋白聚糖、多配体聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、集聚蛋白等的蛋白聚糖上加成有硫酸乙酰肝素的形式存在。硫酸乙酰肝素具有N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的二糖单元的重复结构，根据糖链上的硫酸基的数量，显示多样性。在本发明中，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是指这样的加成有硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖的总称，并没有特别限定。

本发明还涉及包含能够激化Wnt信号传导途径的物质的由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂。如上述说明，能够激化Wnt信号传导途径的物质，具体可以举出氯酸钠、高氯酸钠、氯化锂、硫酸基转移酶、Norrin或R-Spondin2等，优选为氯酸钠、高氯酸钠或氯化锂。

本发明还涉及以上述分化诱导剂为有效成分的盖髓材料。本发明的盖髓材料不仅保护所露出的牙髓面，而且具有诱导牙髓向成牙本质细胞分化并促进牙本质形成的作用。本发明的盖髓材料可以通过通常的龋齿治疗，例如通过在开髓、拔髓后的空洞部牙髓切断面上涂敷或充填而使用。本发明的盖髓材料可以与直接盖髓材料或间接盖髓材料并用，其可以在使用直接盖髓材料或间接盖髓材料之前或之后使用，也可以与直接盖髓材料或间接盖髓材料混合使用。在本说明书中，“直接盖髓材料”是指在牙髓的一部分露出时保护牙髓组织的药剂，例如可以使用氢氧化钙制剂等。“间接盖髓材料”是指在牙本质虽然变薄但牙髓未露出时以阻断外来刺激、杀菌等为目的而使用的药剂，例如可以使用氧化锌丁香酚制剂、氧化锌杂酚油制剂等。

本发明的盖髓材料中的分化诱导剂、例如氯酸钠、高氯酸钠或氯化锂的含量没有特别限定。在氯酸钠或高氯酸钠的情况下，例如以5～500mM为宜，优选为50～100mM。另外，在氯化锂的情况下，例如以2～200mM为宜，优选为5～50mM，更优选为约50mM。

本发明的盖髓材料中的分化诱导剂、例如氯酸钠、高氯酸钠或氯化锂可以以其单质制成各种制剂，或者与药理学以及制剂学上可允许的添加物混合制成各种制剂，其形态适于患部使用。作为适于本发明的盖髓材料的制剂形态，例如可以举出注射剂、外用液剂(注入剂、涂敷剂)、固体制剂(颗粒剂、细粒剂、散剂、软膏剂、片剂)、软膏剂等。本发明的分化诱导剂例如可以含有纤维连接蛋白(FN)。

作为药理学以及制剂学上可允许的添加物，例如可以使用赋形剂、崩解剂或崩解助剂、粘结剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂或溶解助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、保存剂、分散剂、乳化剂、胶凝剂、增粘剂、粘合剂、矫味剂等。

胶凝剂可以是例如吸收牙的溢出液进行凝胶化的物质。另外，作为由粉剂和液剂形成的形态，可以临用时混合以及混炼后使用。本发明的盖髓材料可以进一步含有杀菌剂、抗生物质、抗炎剂等其他的有效成分。

在能够使药剂的有效成分容易用于患部、在充分地向成牙本质细胞分化诱导的期间内使有效成分保留在患部的方面，本发明的盖髓材料可以负载于载体上。因此，本发明的盖髓材料可以是将本发明的分化诱导剂、例如氯酸钠、高氯酸钠或氯化锂与适当的助剂一起固定或浸渍在具有单丝、膜、纤维集合体、海绵、微粒等形状的结构体上的牙科材料的形态。

本发明的盖髓材料的用量没有特别限定，可根据患者的症状(龋齿的进展率)、年齢、剂型等来适当调节。

实施例

以下，基于实施例更具体说明本发明，但本发明并不限于下述实施例的范围。

(实施例1)使用氯酸钠(NaClO₃)时的向成牙本质细胞的分化诱导

在本实施例中，确认了将作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞在含有NaCl0₃的体系中培养时的细胞中的DsPP的表达。Dspp的表达是利用PCR来确认的。

MEDP细胞使用含有10％v/v胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM培养基进行培养。将细胞按照细胞数为3.7×10⁵cells/ml的方式悬浮于上述培养基中，并将5ml细胞悬液加入到直径6cm的培养容器内，进行培养。培养使用涂覆有纤维连接蛋白(FN)的培养容器，在37±0.5℃下进行。培养第一天，添加NaClO₄直至最终浓度为50mM或100mM，进一步培养7天。

使用RNeasy Mini Kit(商标)(QIAGEN制)，由上述培养的细胞提取mRNA后，使用PrimeScript(商标)Reverse Transcriptase(TAKARA制)进行反转录而得到cDNA，并将其作为PCR用试样。mRNA的提取以及cDNA的制备按照各公司的说明书进行。作为DSPP扩增用引物，使用由序列表的序列编号1和2所示的碱基序列形成的引物，作为对照基因的GADPH的扩增用引物，使用由同序列编号3和4所示的碱基序列形成的引物。PCR使用Light Cycler(商标)(ライトサイクラ一(商标))(Roche制)来进行。DSPP的表达量以DSPP的扩增产物与GADPH的扩增产物的相对比来确认。

A.DSPP扩增用引物

(序列编号1)正向5′-AGCCGTGGAGATGCTTCTTA-3′

(序列编号2)反向5′-TCACTCTGGCTGTCACCATC-3′

B.GADPH扩增用引物

(序列编号3)正向5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′

(序列编号4)反向5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′

由上述结果确认到，在含有NaClO₃的体系中进行培养时，Dspp的表达有意义地增强，诱导未分化牙髓细胞向成牙本质细胞分化。NaClO₃的加入能够阻止硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸化，将Wnt从细胞膜或基底膜解离，并与Wnt受体结合，而能够间接激活Wnt信号传导途径。其结果是，可以认为促进未分化的牙髓细胞向成牙本质细胞分化(图1)。

(实施例2)使用氯化锂(LiCl)时的向成牙本质细胞的分化诱导

在本实施例中，确认了将作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞在含有LiCl的体系中培养时的细胞中的Dspp的表达。Dspp的表达是利用PCR来确认的。

使用Li Cl来代替NaClO₃，培养第一天，添加LiCl直至最终浓度为5mM或50mM，除此以外，利用与实施例1同样的方法进行分化诱导处理，并确认了Dspp的表达。

由上述结果确认到，在含有LiCl的体系中培养牙髓细胞时，Dspp的表达有意义地增强，诱导未分化牙髓细胞向成牙本质细胞分化。LiCl被认为具有抑制GSK-3的作用。GSK-3虽然在Wnt信号传导途径中具有抑制性作用，但是LiCl通过抑制GSK-3，能够直接激活Wnt信号传导途径。其结果是，可以认为促进未分化的牙髓细胞向成牙本质细胞分化(图2)。

(实施例3)使用高氯酸钠(NaClO₄)时的向成牙本质细胞的分化诱导

在本实施例中，确认了将作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞在含NaClO₄的体系中培养时的细胞中的D spp的表达。D spp的表达是利用PCR来确认的。

使用NaClO₄来代替NaClO₃，除此以外，利用与实施例1同样的方法进行分化诱导处理，并确认了Dspp的表达。

(实施例4)使用Norrin时的向成牙本质细胞的分化诱导

在本实施例中，确认了将作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞在含Norrin的体系中培养时的细胞中的Dspp的表达。Dspp的表达是利用PCR来确认的。

使用Norrin(R&D systems公司：商品编号：3014-NR)来代替NaClO₃，除此以外，利用与实施例1同样的方法进行分化诱导处理，并确认了D spp的表达。对Norrin的添加浓度进行研究。

(实施例5)使用R-Spondin2时的向成牙本质细胞的分化诱导

在本实施例中，确认了将作为牙髓来源细胞株的MEDP细胞在含有R-Spondin2的体系中培养时的细胞中的Dspp的表达。Dspp的表达是利用PCR来确认的。

使用R-Spondin2(R&D systems公司：商品编号：3266-RS/CF)来代替NaClO₃，除此以外，利用与实施例1同样的方法进行分化诱导处理，并确认了Dspp的表达。对R-Spondin2的添加浓度进行研究。

(工业应用性)

如以上详细说明，使用本发明的能够激活Wnt信号传导途径的物质，具体使用氯酸钠、高氯酸钠或氯化锂，则在牙髓来源的细胞株中，确认到作为成牙本质细胞特异性细胞外基质的Dspp的表达有意义地增强。其结果是，能够激活Wnt信号传导途径的物质可以成为由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂。进而，含有本发明的分化诱导剂作为有效成分的盖髓材料不仅保护露出的牙髓面，而且具有诱导牙髓向成牙本质细胞分化并促进牙本质形成的作用。

本发明的由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导剂直接作用于牙髓而具有促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化诱导的效果。因此，在临床上，通过将该分化诱导剂直接涂敷在龋齿的患部，或者通过将含有该分化诱导剂的糊剂充填到龋齿的患部，可以期待在龋齿的正下面牙本质活跃再生。在确认形成足够的继发性(修复)牙本质后，消除龋齿部位，进行利用树脂或金属的修复治疗。