一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒

摘要

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1 mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1 mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。 

背景技术

E2A-PBX1基因融合是由t(1；19)(q23；p13.3)易位而形成的，产生的融合蛋白含有结合到PBX1同源结构域蛋白的DNA结合域上的E2A氨基端转录活化域，是急性淋巴细胞白血病(ALL)中常见的染色体畸变及基因异常，大约5％的儿童ALL和3.3％的成人ALL携带这种异常染色体。携带有该易位的病人，其临床症状都比较凶险。早期的研究认为，t(1；19)易位与治疗早期的复发相关，更为强烈的化疗能够抵消这种效应。最近的研究证明，治疗方案的改进已使携带t(1；19)易位的儿童ALL预后极大改善，5年无白血病活存率已达89.5％。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。 

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光PCR的一种(Yuqi Z，Min Y，Johann WM，et al.2002.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1Proviral DNA by Using TaqMan Technology.J Cli Microbiol.40(2)：675-678；Drosten C，Seifried E，Roth WK，et al.2001，TaqMan 5_-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening.J Clin Microbiol，39：4302-4308；Schuurman R，Descamps D，Weverling GJ，et al.1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.J Clin Microbiol，34：3016-3022；Christopherson C，Kidane Y，Conway B et al.2000.PCR-based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral  blood mononuclear cells.J Clin Microbiol，38：630-634.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。 

本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因E2A-PBX1及内参基因TBP为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。由于内参TBP基因在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。通过简单易操作的核酸提取系统，结合实时荧光PCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高效率、高灵敏和高特异。 

发明内容

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1的mRNA试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因E2A-PBX1 mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。其基本原理是利用荧光PCR技术，以融合基因E2A-PBX1及内参基因TBP为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过含有逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的一步法RT-PCR对E2A-PBX1基因的mRNA进行快速定量检测。 

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案： 

1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的融合基因E2A-PBX1基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于E2A-PBX1基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了融合基因E2A-PBX1检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了内参TBP基因作为相对定量标准，用于整个反应体系的质量控制，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量 进行校正。 

2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。 

3)适宜于一步法RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。 

4)从待测样本中提取核酸mRNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线对未知样本的核酸mRNA进行定量检测。 

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1)RNA提取试剂、E2A-PBX1反应液、TBP反应液、RT PCR酶系、E2A-PBX1阳性定量参考品1-4、TBP阳性定量参考品1-4、阴性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR反应体系包括E2A-PBX1反应液、TBP反应液、RT PCR酶系。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中E2A-PBX1反应液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液等组成，其特征在E2A-PBX1反应液中正向和反向引物分别是5’-ACCCTCCCTGACCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCCTTCCGCTAACAGCATG-3’(SEQ ID NO：2)。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于E2A-PBX1反应液中寡核苷酸探针是5，-X-ACTCAAAACACTGTAGGAGTCGGGAGG-Y-3’(SEQ ID NO：3)，其中X/Y表示荧光标记基团。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的引物探针浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为2.5pmol/人份。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中TBP反应液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液等组成，其特征在于用于TBP反应液中正向和反向引物分别是5’-CGTGGCTCTCTTATCCTCATGA-3’(SEQ ID NO：4)和5’-GCCCGAAACGCCGAATATA-3’(SEQ ID NO：5)，寡核苷酸探针是5’-X-CCGCAGCAAACCGCTTGGG-Y-3’(SEQ ID NO：6)，其中X/Y表示荧光 标记基团。以上引物探针浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为2.5pmol/人份。 

根据本发明的另一个优选实施方案，RT PCR酶系由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀释液组成。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于c-MMLV酶用量为1.5～3.5U/人份、热启动Taq酶用量为3～7U/人份、RNasin用量为15～25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmol/L，酶稀释液为一般市售的酶稀释液。 

根据本发明的另一个优选实施方案，E2A-PBX1反应液和TBP反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、50mmol/L KCl、3.0mmol/L MgCl₂。 

根据本发明的一个优选实施方案，阴性质控品为DEPC水，E2A-PBX1阳性定量参考品1-4均为含有E2A-PBX1目的片段的重组质粒，浓度为2×10⁶copies/μl-2×10³copies/μl；TBP阳性定量参考品1-4均为含有TBP目的片段的重组质粒，浓度为2×10⁶copies/μl-2×10³copies/μl；质粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50℃逆转录15min，1个循环；95℃ 15min，1个循环；最后94℃ 15s，55℃ 45s，40个循环收集荧光信号。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是外周血或骨髓。 

本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出融合基因E2A-PBX1的灵敏度为50copies/μl，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。 

本发明针对融合基因E2A-PBX1基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为1×10⁸copies/μl-1×10³copies/μl。 

特别值得说明的是，为了确保本发明的基因mRNA检测方法的准确性，我们还使用携带有基因(cDNA)序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。 

与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，实时定量聚合酶链反应试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完 整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。 

利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体实现包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点： 

(1)通过检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。 

(2)全封闭反应，提取RNA以后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生。 

(3)由于内参基因TBP在细胞中的表达相对恒定，因此，本试剂盒中选择TBP作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。 

(4)同时使用携带有E2A-PBX1基因和内参TBP基因序列的重组质粒作为阳性定量参考品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行相对定量的平行检测，从而确保检测结果的可靠性。 

附图说明

图1显示E2A-PBX1阳性定量参考品1-4、阴性质控品的检测结果。E2A-PBX1阳性定量参考品1-4有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R²≥0.97；可明确判定为阳性，阴性质控品的E2A-PBX1及TBP无荧光信号增长，无明显S形扩增曲线，可明确判定为阴性。检测结果均符合质量控制判断标准。 

图2显示TBP阳性定量参考品1-4和阴性质控品的检测结果TBP阳性定量参考品1-4有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R²≥0.97；可明确判定为阳性，阴性质控品的 E2A-PBX1及TBP无荧光信号增长，无明显S形扩增曲线，可明确判定为阴性。检测结果均符合质量控制判断标准。 

图3显示E2A-PBX1基因的特异性实验结果。针对8例包括再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血等其他非白血病患者样品进行实时荧光RT-PCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判为阴性。 

图4显示4份白血病患者的样本的检测结果。4个标本的Ct值分别是29.41、24.19、28.45、32.21，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。 

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 

实施例1：融合基因E2A-PBX1试剂盒的检测方法 

(1)标本采集、运送和保存 

标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3-5ml，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。 

标本保存和运送：标本最好立即用于测试，在2-8℃条件下保存不应超过48小时；或者保存在-20±5℃待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓，获得有核细胞沉淀后加入1ml RNA提取液，振荡混匀，于-70±10℃保存1个月；避免反复冻融。样本运输：0℃左右。 

(2)核酸提取 

1).在5×红细胞裂解液瓶中加入24ml的无菌纯化水稀释成1×红细胞裂解液； 

2).取5ml洁净离心管，加入抗凝血2ml； 

3).加入2ml 1×红细胞裂解液，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，室温放置3分钟； 

4).室温下，6000rpm离心5分钟，去上清，保留沉淀； 

5).重复步骤3～4一次，尽可能吸除残存液体； 

6).加入1ml RNA提取液，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，再将其转移至1.5ml离心管并静置5分钟； 

7).加入200μl氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15秒(小心液体泄漏，有腐蚀性)，静置3分钟(15-30℃)，4℃下12,000rpm离心15分钟，离心后反应管分三层，底层(酚-氯仿层)，中间层及无色水相上层。 

8).小心吸取400ul上层水相(勿吸出中间层及管壁上的白色絮状物)，转移到另一干净离心管中，加入500ul异丙醇，盖紧管盖，上下颠倒3次，静置10分钟(15-30℃)。然后4℃， 12,000rpm离心10分钟(注意固定离心管方向)，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见白色胶状沉淀，去上清。 

9).加入1ml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃，12,000rpm离心5分钟(注意固定离心管方向)，小心吸去大部分乙醇。短暂离心，再吸去剩余乙醇。将沉淀在室温空气中干燥5分钟(打开离心管盖)以使痕量乙醇挥发(但过度干燥可能使RNA沉淀难以溶解)。 

10).用50μl DEPC H₂O溶解沉淀，室温静置2分钟。RNA溶液可立即进行PCR或存于-70±10℃备用。提取后的核酸RNA溶液建议立即使用，如需保存，置于-70±10℃。 

(3)PCR检测 

a)配制体系 

E2A-PBX1反应体系：将3μl RT PCR酶系A，17μl E2A-PBX1反应液，充分混合，然后分装20μl至每个PCR反应管。 

TBP反应体系：将3μl RT PCR酶系A，17μl TBP反应液，充分混合，然后分装20μl至每个PCR反应管。 

b)加样 

往上述E2A-PBX1及TBP反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、直接加入阴性质控品和分别加入对应的阳性定量参考品5μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至PCR扩增仪。 

c)扩增程序设置 

ABI7300/7500荧光PCR扩增仪的参数设置如下： 

Reporter Dye1：FAM 

Quencher Dye：none 

Passive Reference：none 

LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下： 

“Customizes”模块中选择FAM(483-533)滤片， 

扩增温度参数统一设置如下： 

50℃ 15分钟； 

95℃ 15分钟；40个循环(94℃ 15秒→55℃ 45秒)，荧光检测选择在55℃ 45秒这一环节；保存文件，运行。 

d)结果分析 

反应结束后保存检测数据文件。按对应顺序设置E2A-PBX1的4个阳性定量参考品(Task中设为Standard，Quantity中设为对应的拷贝数)。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1～10、stop 值可以在5～20、Threshold值可以在5K～50K范围选择)，使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值(correlation数值)≥0.97。最后到“Report”窗口下记录仪器自动分析计算出的E2A-PBX1未知标本的拷贝数(E2A-PBX1-Qty)，将该结果导出。重新按对应顺序设置TBP的4个阳性定量参考品，步骤同前，将TBP未知标本的拷贝数(TBP-Qty)导出。 

(4)结果判定 

如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限度。 

如果增长曲线呈S型曲线且TBP的Ct值＜35，则样品的E2A-PBX1/TBP表达量为(E2A-PBX1-Qty/TBP-Qty)。 

实施例2：融合基因E2A-PBX1试剂盒中阳性定量参考品及质控品的使用 

融合基因E2A-PBX1试剂盒中阳性定量参考品及质控品包括E2A-PBX1阳性定量参考品1-4，TBP阳性定量参考品1-4和阴性质控品，用于临床试验中质量控制。 

阴性质控品：E2A-PBX1及TBP无荧光信号增长，无明显S形扩增曲线。 

阳性定量参考品：E2A-PBX1及TBP有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R²≥0.97。 

未知标本的TBP的Ct值必须＜35。 

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 

检测结果(见附图1和图2)：阴性质控品的E2A-PBX1及TBP均无荧光信号增长；E2A-PBX1阳性定量参考品1-4 FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R²≥0.97；TBP阳性定量参考品1-4FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R²≥0.97；均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。