一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式及其建立方法和应用

摘要

本发明的目的在于公开了一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式及其建立方法和应用。该模式把药材中的化学成分群/库作为位数众多的自变量，把各批药材的特定活性指标作为函变量，采用偏最小二乘法，获得各批样品各个共有峰与活性的回归方程系数，基于此提炼出YZL值，然后采用正态拟合法，获得YZL值的可信区间，计算得到可用于判断或评价药材质量优劣的YZL区间值，建立起“基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式”。该模式将药材的质量标准评价和判断与活性直接相关联；使药材的质量标准评价和判断实行数字化。

说明书

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价 新模式及其建立方法和应用。

背景技术

中药成分复杂，一味药可以称之为一个“化学成分群”，以单一化合物或多个化合物为 指标评价药材质量的优劣，不能体现中药多成分的特点；以化学成分指纹图谱的相似度来评 价药材质量的优劣，脱离了与活性的相关性，存在缺陷；以普通的“化-效相关性分析”来 评价药材质量的优劣，缺少直接判定的量化值。因此，需要设计一种中药质量评价新模式。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式。

本发明的另一目的在于提供一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模 式的建立方法。

本发明的又一目的在于提供一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模 式的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式，该评价新模式采用以下 方法建立：

(1).建立中药饮片生品和制品的活性数据库：该数据库的活性指标为成骨细胞增殖率；

(2).建立中药饮片生品和制品的化学成分群数据库：该数据库的化学成分群指标为各批 样品相关共有峰的峰面积；

(3).采用偏最小二乘法分析中药饮片生品和制品的化-药相关性，经离异值排除、数据预 处理、最优主成分数的确定，运用Matlab 17.0的PLS工具包软件系统，计算各共有峰的标 准化回归系数；

(4).提炼化学成分群与药效相关性规律：分别计算每批图谱中，各共有峰峰面积与相应 回归系数绝对值的乘积；根据峰面积与回归系数绝对值的乘积，分别计算每批图谱中，正系 数相关峰峰面积之和(A值)，负系数相关峰峰面积之和(B值)，峰面积总和(C值)以及正系 数相关峰峰面积之和/负系数相关峰峰面积之和(YZL值)；分别对中药饮片生品和制品的A 值、B值、C值、YZL值及增殖率的大小进行排序；由排序可以归纳出，正、负系数相关峰 峰面积和之比值(YZL值)和成骨细胞增殖活性具有相对较好的对应关系；且由此得出， YZL值与活性的相关性最强；

(5).采用正态拟合法确定YZL值评价中药饮片生品和制品优劣的合理区间：以Q-Q图和 频数分布图分析YZL值的分布情况，并分别计算中药饮片生品和制品YZL值标准差和平均 值；根据中药饮片生品和制品YZL值与活性的排序，筛选出活性强的优品药材与活性弱的劣 品药材，分别计算中药饮片生品和制品中优质品和劣质品的概率；

采用Norminv函数计算药材质量优劣的区间值，建立起“基于整体观模式中药质量 优劣YZL值数字化评价新模式”；

(6).采用多批样品对上述YZL区间值进行验证，证明“基于整体观模式中药质量优劣 YZL值数字化评价新模式”成立。

上述的基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式，所述实验分析的样品 数量大于10。

一种基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式的建立方法，包括以下步 骤：

(1).建立中药饮片生品和制品的活性数据库：该数据库的活性指标为成骨细胞增殖率；

(2).建立中药饮片生品和制品的化学成分群数据库：该数据库的化学成分群指标为各批 样品相关共有峰的峰面积；

(3).采用偏最小二乘法分析中药饮片生品和制品的化-药相关性，经离异值排除、数据预 处理、最优主成分数的确定，运用Matlab 17.0的PLS工具包软件系统，计算各共有峰的标 准化回归系数；

(4).提炼化学成分群与药效相关性规律：分别计算每批图谱中，各共有峰峰面积与相应 回归系数绝对值的乘积；根据峰面积与回归系数绝对值的乘积，分别计算每批图谱中，正系 数相关峰峰面积之和(A值)，负系数相关峰峰面积之和(B值)，峰面积总和(C值)以及正系 数相关峰峰面积之和/负系数相关峰峰面积之和(YZL值)；分别对中药饮片生品和制品的A 值、B值、C值、YZL值及增殖率的大小进行排序；由排序可以归纳出，正、负系数相关峰 峰面积和之比值(YZL值)和成骨细胞增殖活性具有相对较好的对应关系；且由此得出， YZL值与活性的相关性最强；

(5).采用正态拟合法确定YZL值评价中药饮片生品和制品优劣的合理区间：以Q-Q图和 频数分布图分析YZL值的分布情况，并分别计算中药饮片生品和制品YZL值标准差和平均 值；根据中药饮片生品和制品YZL值与活性的排序，筛选出活性强的优品药材与活性弱的劣 品药材，分别计算中药饮片生品和制品中优质品和劣质品的概率；

采用Norminv函数计算药材质量优劣的区间值，建立起“基于整体观模式中药质量 优劣YZL值数字化评价新模式”；

(6).采用多批样品对上述YZL区间值进行验证，证明“基于整体观模式中药质量优劣 YZL值数字化评价新模式”成立。

上述的基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式的建立方法，所述实验 分析的样品数量大于10。

上述的基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式在评价中药材、茶叶、 食品、饮品或保健品质量中的应用。

上述的基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式的应用，该模式可用于 中药材生品质量优劣、制品质量优劣、药对/方的质量优劣和药材提取、分离、纯化、精制 工艺研究过程当中的质量的评价和判断。

上述的基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式在其他行业或领域当中 多个波动的自变量样品和函变量优劣相关性的评价和判断中的应用。

以我们研究创立的药材质量评价的新方法“基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字 化评价新模式的建立方法”，为整体观模式，把药材中的化学成分群/库作为位数众多的自变 量，把各批药材的特定活性指标作为函变量，采用偏最小二乘法，获得各批样品各个共有峰 与活性的回归方程系数，基于此提炼出YZL值，然后采用正态拟合法，获得YZL值的可信 区间，计算得到可用于判断或评价药材质量优劣的YZL区间值，建立起“基于整体观模式 中药质量优劣YZL值数字化评价新模式的建立方法”。

在研究建立该模式的时候，我们以中药材牛膝(Achyranthes bidentata)的生品和盐炙品 为研究对象；采用HPLC法建立各样品的化学成分群数据库；采用MC3T3-E1成骨细胞增 殖率为活性指标，建立各样品的活性数据库。研究过程中，建立判断评价方法使用的药材样 本生品和盐炙品均为18批；对我们建立起来的判断评价方法进行验证时使用的药材样本生 品和盐炙品均为10批。

目前，研究“化-效相关性”的方法很多，其中常见的有多元线性回归、主成分回归、 灰色关联度分析、偏最小二乘回归等，每种分析方法都有一定的数据特征要求和一定的适用 范围。根据前期对各分析方法的筛选和评价，我们最终选定偏最小二乘法(PLS)作为“化 学成分群数据库”和“活性数据库”的分析方法，获得各批样品各个共有峰与活性的回归方 程系数，基于此提炼出YZL值，然后采用正态拟合法，获得YZL值的可信区间，计算得到 可用于判断或评价药材质量优劣的YZL区间值，建立起“基于整体观模式中药质量优劣 YZL值数字化评价新模式的建立方法”。

本发明的有益效果：

本发明模式的基本特点：(1)该模式可用于N多个自变量样品的质量控制，N＞2；(2) 该模式可用于N多个波动的自变量样品的质量控制，样品的N个自变量具有一定波动性； (3)该模式对于N多个波动的自变量样品的质量控制的基本点，是与样品的活性直接相 关；(4)该模式对N多个可波动的自变量样品与活性相关性的分析，直接为数字化，故称 为“YZL值数字化质量控制新模式”；(5)该模式不但可用于药材质量优劣的评价和判断， 可用于炮制品质量优劣的评价和判断，可用于药对/方的质量优劣的评价和判断，也可用于 药材提取、分离、纯化、精制工艺研究过程当中的质量评价和判断，同样也可用于其他行业 或领域当中多个波动的自变量样品和函变量优劣相关性的评价和判断。

本发明的创新点：(1)药材的质量标准评价和判断与活性直接相关联；(2)药材的质 量标准评价和判断实行数字化。采用该模式使药材质量的评价和判断数字化，使药材质量的 评价和判断更为准确，可重复性高；且该模式的应用范围广。

附图说明

图1为96孔板加药详图。

其中，●为加药孔，○为加D-Hank′s溶液孔。

图2为18批牛膝生品HPLC色谱图重叠谱(离横坐标由近及远分别为1到18号生品图 谱)。

图3为18批牛膝炙品HPLC色谱图重叠谱(离横坐标由近及远分别为1到18号炙品图 谱)。

图4为牛膝生、炙品36张色谱图的16个共有峰。

图5为18批牛膝生品样本离异值的判断。

图6为18批牛膝炙品样本离异值的判断。

图7为18批牛膝生品不同主成分数对应的交叉验证均方差(RMSECV)。

图8为18批牛膝炙品不同主成分数对应的交叉验证均方差(RMSECV)。

图9为牛膝生品YZL值频数分布图。

图10为牛膝炙品YZL值频数分布图。

图11为牛膝生品YZL值的正态Q-Q图。

图12为牛膝炙品YZL值的正态Q-Q图。

具体实施方式

1.牛膝生品和盐炙品活性(成骨细胞增殖率)数据库建立

1.1.牛膝生品与盐炙品细胞给药液的制备方法

分别精密称取18批牛膝(Achyranthes bidentata)生品与盐炙品药材粗粉(过40目筛) 1.0000g，置于100mL烧瓶中，加入10mL 60％乙醇，浸泡1h，分别以10mL、8mL、8 mL的60％乙醇，各水浴回流提取一次，时间分别为1.5h、1h、0.5h，合并三次滤液，石油 醚萃取至石油醚层无色，减压回收乙醇部位至无醇味，经脱脂处理后的药液转移至10mL容 量瓶，以纯净水定容至刻度(100mg/mL)，摇匀。取2mL该药液消毒后移入超净台内， 0.22μm滤过除菌，作为储备液。

加药时，精密吸取上述储备液22μL至每孔原有200μL培养液的96孔培养板中，即得 10mg/mL牛膝生、炙品细胞给药液。

1.2.牛膝生品与盐炙品的活性(成骨细胞增殖率)测定方法

取培养瓶中处于指数生长期的MC3T3-E1成骨细胞，消化后，加入一定体积10％FBS (胎牛血清)的DMEM培养液，将细胞浓度调整至2×10⁴个/mL，每孔200μL接种于96孔 培养板中，将培养板放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中。24h后取出培养板，在超净台 内用移液器向安排好的孔中加入拟定的药液(22μL/孔)，每种药液设3个平行孔；空白加 10％FBS的DMEM培养液(22μL/孔)(加药情况见下图1、表1)，加好药液以后，继续 置于培养箱内培养。48h后再次取出96孔板，用移液器向每孔中加入5mg/mL的MTT溶液 20μL，37℃孵化4h，有蓝紫色沉淀生成。吸去每孔中的液体，加入150μL/孔DMSO，于 minishaker上微振10min，待沉淀完全溶解后，以不加药的细胞孔测得的吸光度值为空白， 于570nm用酶标仪测定培养板中每孔的OD值。如上述方法，平行做两块板，得到两块板 的OD值。

表1 96孔板加药详表(以生品为例)

注：表格中D代表D-Hank′s溶液，S1代表编号为1号的牛膝生品；依此类推。

1.3.评价指标

以成骨细胞活性增殖率为指标考察药物对MC3T3-E1成骨细胞增殖作用的强弱。

其中，为各样品两块板的6个OD值的平均值；为两块板12个OD值的平均 值。

1.4.牛膝生品与盐炙品的成骨细胞增殖率测定结果

表2 18批牛膝药材生品促成骨细胞增殖活性数据

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表3 18批牛膝药材炙品促成骨细胞增殖活性数据

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

2.牛膝生品和盐炙品化学成分群数据建立

2.1.样品的制备方法

2.1.1.供试品溶液的制备方法

为保证所测的化学成分群图谱与活性的对应关系，HPLC供试品溶液的提取方法同1.1. 项下的细胞给药液提取方法，药液过0.45μm滤膜后，作为供试品溶液。

2.2.色谱条件

色谱柱为Phenomenex ODS-BP(250mm×4.60mm，5μm)；流速：1.0mE·min^-1；检测波 长：210nm；进样量：20μL；柱温：30℃。流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，梯度洗脱： 0～5min，95％B；5～95min，95％～20％B；95～96min，20％～0％B；96～106min，0％B。

2.3.牛膝生品和盐炙品化学成分群图谱的测定结果

按照2.1.1项下药材提取方法和2.2项下色谱条件，对不同产地18批药材的生品、盐炙 品分别进样，得到共36张指纹图谱，见图2，3。

2.4.牛膝生品和盐炙品共有峰的建立

将18个不同产地批次的生品和盐炙品的色谱图从ChemStation工作站中导出，以相同 或相近保留时间为选择依据，选择共有峰，选择了共有峰16个。选择生品活性最好的1号 药材为载体，将16个共有峰标记命名在色谱图上，详见图4。18个批次牛膝生品和盐炙品 色谱图共有峰原始数据见表4、5、6、7。

表4 18批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中1-8号共有峰峰面积原始数据

表5 18批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中9-16号共有峰峰面积原始数据

表6 18批牛膝药材炙品化学成分群指纹图谱中1-8号共有峰峰面积原始数据

表7 18批牛膝药材炙品化学成分群指纹图谱中9-16号共有峰峰面积原始数据

3.牛膝生品和盐炙品的“化-效相关性”分析和评价

通过对经典的计量学方法进行摸索，发现多元线性回归分析方法(该法不适用于样本数 小于自变量数且存在多重相关性的数据)、主成分回归分析法(该法能解决多重共线性问 题，但它却无法辨识噪音信息，当自变量系统中存在大量噪音时，往往得不到理想的回归模 型)、灰色关联度(可确定诸指纹特征对药效贡献的大小，但是关联度没有正负之分，无法 判断共有峰峰面积对活性的影响，不能实现我们的分析目标)等均不适合于我们的数据分 析；最终发现PLS法是相对适合本数据特征的一种分析方法。

3.1.偏最小二乘法简介

偏最小二乘法(PLS)是一种新型的多元统计数据分析方法，该方法集多元线性回归分 析、典型相关分析和主成分分析的基本功能于一体，通过在变量系统中提取若干个对系统具 有最佳解释功能的综合信息变量，实现对高维数据空间的降维处理；能够在自变量存在严重 多重相关性和样本点个数少于变量个数的条件下进行回归建模，在最终模型中将包含原有的 所有自变量，PLS回归模型更易于辨识系统信息与噪音；与普通多元线性回归和主成分回归 相比，具有简单稳健、计算量小、预测精度高、无需剔除任何解释变量。

3.2.偏最小二乘回归分析过程

3.2.1.离异值的排除

偏最小二乘法的降维方法是通过主成分分析法对自变量和因变量提取主成分来实现的； 采用主成分分析法提取主成分时，主成分1代表了自变量的最多信息，主成分2次之，主成 分3再次之，依此类推。因此，可以采用主成分分析法获取得分，绘制主成分1和2的得分 图。从图中可以看出18个牛膝生、炙品样本中均没有离异值，见图5、图6。注：若该点落 在椭圆之外则说明，此点为离异值，应当舍去。

3.2.2.数据预处理

PLS法对待分析数据有一定要求，由于化学成分群共有峰峰面积大小与成骨细胞增殖率 大小有着较大的数量级差异，因此需要对自变量(16个共有峰面积)和因变量(成骨细胞 增殖率)进行预处理。Matlab 17.0中偏最小二乘法的数据预处理方法为正规标准化变换，变 换后使各组变量的均值为0，方差为1。具体算法如下：

${X^{*}}_{\mathrm{ik}}=\frac{X_{\mathrm{ik}}-{\bar{X}}_k}{S_k};$

X为自变量，也就是同一峰号的各批样品的峰面积；k表达16个共有峰的某一个峰的 峰号；表达18批样品k号共有峰在标准化处理之前的平均值；S_k表达18批样品k号共 有峰在标准化处理之前的方差。

X_ik中k表达16个共有峰的某一个峰的峰号，i表达18批样品的某个批号。

X^*_ik为相应标准化后的变量值。

获得化学成分群和细胞活性数据库经标准化处理后数据结果见表8、9、10、11、12。

表8 18批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中1-8号共有峰峰面积标准化数据

表9 18批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中9-16号共有峰峰面积标准化数据

表10 18批牛膝药材炙品化学成分群指纹图谱中1-8号共有峰峰面积标准化数据

表11 18批牛膝药材炙品化学成分群指纹图谱中9-16号共有峰峰面积标准化数据

表12 18批牛膝药材生、炙品成骨细胞增殖率标准化数据

3.2.3.最优主成分数的确定

运用Matlab 17.0采用留一交互验证法(leave-one-out cross-validation)，考察主因子数对 交互验证均方根误差(RMSECV)的影响，当RMSECV值最小的时候，所选的主因子数最 合适。RMSECV的计算方法如下：

$\mathrm{RMSECV}\left(f\right)=\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{n}{\Sigma }}(y_{\mathrm{cv},j}-y_j)}{n}}$

y_j为成骨细胞增殖活性的真实值；y_cv，j为经PLS计算的成骨细胞增殖活性预测值；n为 样本数。

18批牛膝生、炙品相关数据经过计算后得到主成分数与RMSECV关系图，见图7、图 8。

由图7、图8可知，当主成分数为2时，牛膝生、炙品的RMSCV值最小，因此，这两 个分析模型的最适主成分数均为2。

3.2.4.标准化回归系数的计算

运用Matlab 17.0中的PLS工具包对共有峰面积与增殖率进行相关性分析，提取主成分 建立回归模型，计算各共有峰的标准化回归系数。见表13。

表13 18批牛膝生、炙品的标准化数据回归系数

从表13中的回归系数可知，牛膝生品中peak1、2、4、5、6、7、11、13、15、16与活 性呈正系数相关，其余各峰与活性呈负系数相关；牛膝炙品中peak1、5、10、12、14、16 与活性呈正系数相关，其余各峰与活性呈负系数相关。

3.3.化学成分群与药效相关性规律提炼

3.3.1.基于PLS法的正、负系数相关峰峰面积与活性相关关系的规律提炼

分别计算每批图谱中，各共有峰峰面积与相应回归系数绝对值的乘积。根据峰面积与回 归系数绝对值的乘积，分别计算每批图谱中，正系数相关峰峰面积之和(A值)，负系数相关 峰峰面积之和(B值)，峰面积总和(C值)以及正系数相关峰峰面积之和/负系数相关峰峰面 积之和(YZL值)，见表14、15。

表14 18批牛膝生品化学成分群指纹图谱正、负系数相关峰峰面积之和及其比值计算结果

表15 18批牛膝炙品化学成分群指纹图谱正、负系数相关峰峰面积之和及其比值计算结果

表14、表15为18批牛膝生、炙品化学成分群指纹图谱正、负系数相关峰峰面积之和 及其比值计算结果；

(1)对牛膝生品的A值、B值、C值、YZL值及增殖率的大小进行排序，结果如下：

A值：1＞3＞6＞9＞5＞15＞2＞17＞14＞16＞7＞18＞10＞13＞11＞8＞12＞4；

B值：2＜17＜4＜18＜12＜8＜14＜11＜9＜16＜5＜1＜15＜3＜6＜10＜7＜13；

C值：13＞1＞3＞7＞6＞9＞15＞5＞10＞16＞14＞11＞2＞17＞8＞18＞12＞4；

YZL值：2＞1＞17＞18＞3＞9＞6＞5＞15＞14＞4＞16＞11＞8＞12＞10＞＞7＞13；

增殖率：1＞2＞17＞18＞10＞3＞16＞11＞9＞14＞4＞15＞5＞6＞8＞12＞7＞13。

(2)对牛膝炙品的A值、B值、C值、YZL值及增殖率的大小进行排序，结果如下：

A值：1＞16＞17＞18＞5＞15＞6＞2＞3＞4＞14＞9＞10＞12＞13＞7＞11＞8；

B值：17＜6＜4＜2＜8＜1＜12＜18＜9＜14＜3＜15＜10＜7＜11＜13＜16＜5；

C值：5＞16＞1＞15＞13＞18＞10＞7＞11＞3＞14＞9＞12＞2＞17＞4＞6＞8；

YZL值：17＞6＞1＞2＞18＞4＞15＞16＞9＞3＞12＞14＞8＞10＞13＞7＞5＞11；

增殖率：17＞6＞1＞18＞4＞16＞2＞8＞12＞9＞10＞14＞3＞15＞11＞7＞5＞13。

由以上排序可以看出，正、负系数相关峰峰面积和之比值(YZL值)和成批骨细胞增殖 活性的对应关系相对较好，由此可证明，牛膝的成骨细胞增殖活性不仅仅与某类成分(正相 关成分或负相关成分)相关，而是与其化学成分群的整体动态变化相关；且我们推测，当活 性处于最优和最劣范围时，YZL值与活性有很强的相关性；我们可由此入手找到判断牛膝药 材质量优劣的新方法。

同时，药材经盐炙过后，其促进成骨细胞增殖活性增强，但其共有峰峰面积之和有增有 减；即总峰面积下降并不能确定其活性一定下降。即活性的大小与总峰面积的大小并不存在 必然联系，而与代表化学成分群整体动态变化的YZL值关系密切。

3.3.2.基于YZL值的牛膝生品和盐炙品促成骨细胞增殖活性优劣区间划分

3.3.2.1.正态拟合分析法

(1)Q-Q图是一种散点图，可以用于检验数据的分布。对应于正态分布的Q-Q图， 就是由标准正态分布的分位数为横坐标，样本值为纵坐标的散点图。要利用Q-Q图鉴别样 本数据是否近似于正态分布，只需看Q-Q图上的点是否近似地在一条直线附近，而且该直 线的斜率为标准差，截距为均值。因此，可采用Q-Q图检验一组数值的正态性。

注：一股说来，对介于0与1之间的任意实数α，标准正态分布N(0，1)的α分位数 是这样一个数，它的左侧面积恰好为α，它的右侧面积恰好为1-α。

(2)频数分布图是以分组为横轴、以频数为纵轴，用长方形的面积来表示各组相应频数 的统计图。画频数分布图的目的，是为了将频数分布表中的结果直观、形象地表示出来，一 股正态分布的频数分布图高峰位于中部，左右两侧大致对称。

(3)Norminv函数是EXCEL中的常用函数，其用途是返回指定平均值和标准偏差 的正态累积分布函数的反函数，即返回具有给定概率正态分布的区间点。因此，可采用该 函数进行质量优劣区间点的计算。

3.3.2.2.以Q-Q图和频数分布图分析YZL值的分布情况

由3.2.2.1.项下方法可知，可采用Q-Q图和频数分布图检验YZL值的正态性；通过 SPSS11.5软件作出的YZL值Q-Q图(见图9、图10)和频数分布图(见图11、图12)。

由Q-Q图和频数分布图的分析结果可知，牛膝生、炙品的YZL值基本属于正态分布。牛 膝生品YZL值标准差为0.178，平均值为0.83；牛膝炙品YZL值标准差为0.347，平均值为 0.70。

3.3.2.3.牛膝生品和盐炙品质量优劣区间的界定及概率计算

根据YZL值与活性的排序比较可知，18批牛膝生品的第1、2、17、18批活性强，且与 YZL值关系密切，可作为药材优品，以第18批的YZL值为界；第7、13批活性弱，且与YZL 值关系密切，可作为药材劣品，以第7批的YZL值为界。计算其在18批样本中所占概率分 别为22.22％、11.11％。

另外，18批牛膝炙品的第1、6、17批活性强，且与YZL值关系密切，可作为药材优 品，以第1批的YZL值为界；第5、7、11、13批活性弱，且与YZL值关系密切，可作为药 材劣品，以第13批的YZL值为界。计算其在18批样本中所占概率分别为16.67％、 22.22％。

3.3.2.4.评价药材质量优、劣的YZL区间值的计算

有3.3.2.1.项下方法可知，可以Norminv函数计算药材质量优劣的区间点。

(1)牛膝生品YZL值的均值为0.83，标准偏差0.178；优质品的概率定为22.22％，劣 质品的概率定为11.11％。即得到：YZL～N(0.83，0.178²)；

$P(\frac{\mathrm{YZL}-0.83}{0.178}\ge \frac{{\mu }_{1-\alpha }-0.83}{0.178})=0.2222$$P(\frac{\mathrm{YZL}-0.83}{0.178}\le \frac{{\mu }_{\alpha }-0.83}{0.178})=0.1111$

计算得到μ_1-α＝0.9639；μ_α＝0.6112。

即可得出结论，当YZL值≥0.9639时，该牛膝生品为优品；当YZL值≤0.6112时，该牛 膝生品为劣品。以上18批牛膝生品以YZL值进行分类，均符合该结论。

(2)牛膝炙品YZL值的均值为0.70，标准偏差0.347；优质品的概率定为16.67％，劣 质品的概率定为22.22％。即得到：YZL～N(0.70，0.347²)；

$P(\frac{\mathrm{YZL}-0.70}{0.347}\ge \frac{{\mu }_{1-\alpha }-0.70}{0.347})=0.1667$$P(\frac{\mathrm{YZL}-0.70}{0.347}\le \frac{{\mu }_{\alpha }-0.70}{0.347})=0.2222$

计算得到μ_1-α＝1.0403；μ_α＝0.4385。

即可得出结论：当YZL值≥1.0403时，该牛膝炙品为优品；当YZL值≤0.4385时，该牛 膝炙品为劣品；以上18批牛膝炙品以YZL值进行分类，均符合该结论。

3.3.2.5.以YZL值判断药材质量优劣的验证结论

另取10批牛膝药材以1、2项下的方法进行化学成分群图谱和促成骨细胞增殖活性测 定，测定结果见表16、17、18。

表16 10批牛膝药材生品促成骨细胞增殖活性数据

注：与空白组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

表17 10批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中1-8号共有峰峰面积原始数据

表18 10批牛膝药材生品化学成分群指纹图谱中9-16号共有峰峰面积原始数据

以3.2.4.项下分析得到的标准化回归系数，分别计算每批图谱中，各共有峰峰面积与相 应回归系数绝对值的乘积。根据峰面积与回归系数绝对值的乘积，分别计算每批图谱中，正 系数相关峰峰面积之和(A值)，负系数相关峰峰面积之和(B值)，峰面积总和(C值)以及正 系数相关峰峰面积之和/负系数相关峰峰面积之和(YZL值)，见表19。

表1910批牛膝生品化学成分群指纹图谱正、负相关峰峰面积之和及其比值计算结果

对10批牛膝生品的A值、B值、C值、YZL值及增殖率的大小进行排序，结果如下：

A值：3＞8＞6＞10＞9＞7＞1＞2＞5＞4；B值：10＜5＜4＜8＜2＜6＜7＜1＜9＜3；

C值：3＞9＞6＞7＞1＞2＞8＞4＞5＞10；YZL值：10＞5＞8＞3＞4＞6＞7＞9＞2＞1；

增殖率：10＞5＞8＞6＞2＞7＞9＞4＞3＞1。

验证结果显示：YZL值的大小与活性相关性强；按照上述18批牛膝生品建模得到：当 YZL值≥0.9639时，该牛膝生品为优品，当YZL值≤0.6112时，该牛膝生品为劣品，在本次 验证试验10批药材中YZL值≥0.9639的药材批号为第10批药材，YZL值≤0.6112的药材批 号为第1、2、3、4、6、7、8、9批药材；可以得出结论：第10批药材为优质药材，第5批 药材为合格药材，第1、2、3、4、6、7、8、9批药材为劣质药材。

上述10批药材的活性值数据显示：评价药材质量优劣的新方法有重现性。即YZL值 ≥0.9639的样品，其促成骨细胞增殖活性具有极显著性；YZL值≤0.6112的样品，其促成骨 细胞增殖活性没有显著性差异。

4.对“基于整体观模式中药质量优劣YZL值数字化评价新模式”的讨论

4.1该模式基本特点

特点一：该模式可用于N多个自变量样品的质量控制，N＞2。

特点二：该模式可用于N多个波动的自变量样品的质量控制，样品的N个自变量具有一 定波动性。

特点三：该模式对于N多个波动的自变量样品的质量控制的基本点，是与样品的活性 直接相关。

特点四：该模式对N多个可波动的自变量样品与活性相关性的分析，直接为数字化， 故称为“YZL值数字化质量控制新模式”。

特点五：该模式不但可用于药材质量优劣的评价和判断，可用于炮制品质量优劣的评价 和判断，可用于药对/方的质量优劣的评价和判断，也可用于药材提取、分离、纯化、精制 工艺研究过程当中的质量评价和判断，同样也可用于其他行业或领域当中多个波动的自变量 样品和函变量优劣相关性的评价和判断。

4.2该模式的创新性

创新一：药材的质量标准评价和判断与活性直接相关联，是该模式的创新。

创新二：药材的质量标准评价和判断实行数字化，是该模式的创新。

4.3建立“YZL值数字化质量控制新模式”的相关问题讨论

4.3.1以偏最小二乘法(PLS)作为“化-效相关性分析”方法的确定依据

进行“化-效相关性分析”是一个极其复杂的研究领域，目前化学计量学中多采用多元线 性回归分析方法，但该法不适用于样本数小于自变量数且存在多重相关性数据的“化-效相关 性分析”，而通过相关分析看出各指纹图谱的色谱峰之间常常存在着严重的多重相关性，若 采用普通多元回归分析建立模型将很难进行，且模型也不够稳定。故我们未采用该方法进行 “化-效相关性分析”。

“化-效相关性分析”也有采用主成分回归分析的报道，主成分回归是建立在主成分分析 基础上的多参数拟合和多组分分析方法。该方法虽然解决了多重共线性问题，但它却无法辨 识噪音与信息，当自变量系统中存在大量噪音时，往往得不到理想的回归模型，因此，主成 分回归分析不适用于本实验数据。

同时，灰色关联度分析也常用于“化-效相关性分析”。灰色关联度法来自灰色系统理 论，其研究思路是设有n个中药样品，每个样品有m项指纹特征量化指标(如共有峰峰面 积)，这样构成了m个子序列。以样品药效学指标作为母序列，依据母序列与子序列关联度 的大小，可确定诸指纹特征对药效贡献的大小。但是关联度没有正负之分，无法判断共有峰 峰面积对活性的影响，不能实现我们的分析目标，所以该法不适用于本实验的“化-效相关性 分析”。

偏最小二乘法(PLS)是一种新型的多元统计数据分析方法，能够在自变量存在严重多重 相关性和样本点个数少于变量个数的条件下进行回归建模，在最终模型中将包含原有的所有 自变量，PLS回归模型更易于辨识系统信息与噪音，每一个自变量x_i的回归系数将更容易解 释。与普通多元线性回归和主成分回归相比，具有简单稳健、计算量小、预测精度高、无需 剔除任何解释变量。因而适合于本数据的“化-效相关性分析”。

4.3.2.建立客观可信的“化学成分群图谱、相关活性的数据库”是该模式建立的基础

为了构建客观可信具有代表性的单味药/药对指纹图谱，我们选择了18个不同批次的牛 膝样品作为研究对象；为了使构建的指纹图谱能全面有效的反映单味药/药对中与成骨细胞 增殖活性相关的化学成分特点，我们以单味药/药对的成骨细胞增殖活性为指标，对构建的 指纹图谱的单味药/药对样品液的提取纯化条件做了系统的研究；同时，我们进行了系统的 色谱条件摸索和方法学考察(精密度、重复性和稳定性实验)。因此，本实验中单味药/药对 化学成分群图谱能够全面的反映化学成分群信息，具有可信性。

在进行成骨细胞增殖活性测定的实验中，我们系统的进行了药材提取方法、纯化方法的 研究；系统的进行了细胞最佳生长周期、最佳上样浓度、最佳加药时间的研究，获得了相对 稳定的实验条件，在该条件下所进行的实验重复性好、灵敏度高，所获得的活性数据库稳定 客观，可与相应的化学成分群图谱进行“化-效相关性分析”。

4.3.3.该模型的YZL值可以反映药材质量的优劣

采用偏最小二乘法对共有峰峰面积和成骨细胞增殖活性进行了相关性分析，建立了回归 模型，得到了回归系数，确定了正系数相关峰和负系数相关峰。通过计算正系数相关峰峰面 积之和、负系数相关峰峰面积之和及两者的比值，从中提炼出以下规律：正、负相关峰峰面 积和之比值(YZL值)与活性有一定的相关性；且当活性处于最优和最劣的范围时，YZL 值与活性有很强的相关性。

4.3.4.采用正态拟和法确定和计算可判断药材质量的优劣的“YZL区间值”-即建立“YZL值 数字化质量控制新模式”

根据提炼的规律“正、负相关峰峰面积和之比值(YZL值)与活性有一定的相关性；且当活 性处于最优和最劣的范围时，YZL值与活性有很强的相关性。”发现确定“YZL值”的范围十 分重要，即找到药材最优和最劣时“YZL值”的区间范围，便可以判断药材的质量优劣。通过 Q-Q图和频数分布图分析得到YZL值的分布基本为正态分布，并通过YZL值和活性的排序 情况综合考虑，划分药材质量优劣区间并计算概率，然后运用Norm.inv函数计算药材质量 最优和最劣时YZL值的波动范围，即单味药/药对化学成分群(库)的波动范围。