羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA及其应用

摘要

本发明公开了羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA。本发明从羊基因组中分离了4个假attP位点，进而能够将φC31整合酶系统应用在转基因羊生产制备中，使外源目的基因高效整合于羊基因组中并高效表达。

说明书

技术领域

本发明属于转基因技术领域，特别涉及一种羊基因组中被噬菌体φC31 整合酶识别的DNA及其应用。

背景技术

动物转基因技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，它是通 过基因工程技术将外源基因整合入宿主动物基因组内，从而使其得以表达和 遗传的生物技术。其中，外源基因转入宿主基因组是其中关键一环。外源基 因转入宿主基因组的方式有两种，随机整合和位点特异整合。前者因为其整 合位置的不确定性和致癌的潜在危险性，影响了其在转基因动物制备中的实 际应用。而位点特异性整合，由于其整合位置的明确性和可操作性，使得其 越来越受到人们的青睐。

目前，转基因技术在哺乳动物中的应用中，位点特异性重组系统有很多， 已得到应用的有Crelox P系统，FLP-FRT系统、R-RS系统以及I-Sce I系统， 应用最多是Crelox P系统。该系统需要首先引入lox P序列，然后通过一定 的途径激活Cre重组酶的活性，以实现在lox P位点的特异整合或重组。

近来，人们发现在链霉菌噬菌体中存在一种φC31整合酶(phiC31 integrase)。该酶可以催化细菌基因组中的attB位点和噬菌体基因组中的attP 位点之间的同源重组(Kuhstoss S.and Rao RN.J.Mol.Biol.1991，222(4)：897- 908)。其中，attB由称为BOB’的序列组成，而attP由POP’组成。O是 核心序列，是attB和attP所共同的。而其两侧的序列是B、B’和P、P’， 被称为臂。噬菌体DNA是环状的，重组时被整合入细菌染色体中，成为线 性序列。整合反应发生后，形成两个新的杂种att位点，左侧称为attL，由 BOP’组成，而右侧为attR，由POB’组成。进一步的研究发现，在动物基 因组中也存在一些位点，可以在整合酶的介导下，将带有attB序列的外源基 因整合入宿主基因组内，这些位点的核心序列与噬菌体基因组中attP位点的 核心序列具有一定的同源性，被称为“假attP位点”。

研究表明，相比较传统的Cre酶或Flp酶，φC31整合酶介导的外源基因 的整合具有三个优点：一、高效整合；二、无需辅助因子；三、单向整合， 不会发生回复切除。这些优点使得φC31整合酶在生物工程上具有重要的利 用价值，被广泛应用于诸多领域，包括转基因动物制备、基因治疗、基因组 修饰等。

目前，已经在人、小鼠、大鼠、果蝇和牛的基因组中分离出多个假attP 位点，并证明了φC31整合酶在这些物种中具有介导外源基因位点特异性整 合的作用。在转基因羊的制备中，同源重组和Cre酶系统的应用报道较多。 而φC31整合酶系统在山羊基因组内的应用尚未见报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的羊细胞转基因技术中还 没有成功的使用φC31整合酶系统转基因技术的不足，提供一种羊(Capra hircus) 基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA及其应用，以及相应的含有该 DNA的载体和转化子。

本发明的第一方面是提供一种羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的 DNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 或者SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二方面是提供所述的羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别 的DNA的应用，用于在羊细胞中整合目的基因。

本发明中，所述在羊细胞中整合目的基因的方法可以是本领域常规的方 法，优选的包括以下步骤：将含有目的基因和attB位点的载体、和含链霉菌 噬菌体ΦC31整合酶基因的载体混合后转染羊细胞，然后筛选阳性克隆细胞 株。所述的attB位点的序列为：GTGCACGGCCCACGTGGCCACTAGTACTTCTCGAGGT CGACGATGTAGGTCACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCG GGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCATCATGATGAACGGGTCGAGGTGGCGGTAGTTGAT CCCGGCGAACGCGCGGCGCACCGGGAAGCCCTCGCCCTCGAAACCGCTGGGCGCGGTGGTCACGG TGAGCACGGGACGTGCGACGGCGTCGGCGGGTGCGGATACGCGGGGCAGCGTCAGCGGGTTCTCG ACGGTCACGGCGGGCATGTCGACGGTATCGATAAG。所述的含有目的基因和attB位点 的载体和含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的载体的质量比可以是1∶3～1 ∶50。所述的转染的方法可以是本领域常规的方法，优选的采用脂质体介导 的细胞转染法。

本发明中，所述的羊细胞可以是本领域的常规羊细胞，优选的为小羊耳 皮肤成纤维细胞。

本发明的第三方面是提供含有所述的DNA的载体。

本发明的第四方面是提供含有所述的载体的转化子。

本发明的第五方面是提供含有所述的DNA的序列的引物。

本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明首次在羊基因组内寻 找到4个假attP位点，这4个位点可被链霉菌噬菌体φC31整合酶识别，因 此可以使含attB位点的外源基因在整合酶的介导下以较高的整合率整合到 羊基因组中的该位点，从而得到携带外源基因的羊细胞，为φC31整合酶系 统在转基因羊生产制备中的应用奠定了基础。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是PCR扩增产物进行电泳图。1：挑选的1号克隆DNA酶切自连 产物；22：挑选的22号克隆DNA酶切自连产物23：挑选的23号克隆DNA 酶切自连产物；B：空白；C1：未转染的正常羊细胞DNA酶切自连产物； C2：pEGFP-N1-attB质粒对照；M：1kb Marker(从上到下为：10k、8k、6k、 5k、4k、3.5k、3k、2.5k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp、250bp)。

图2是PCR产物电泳图。1：1号克隆细胞DNA；B：空白；C：未转 染的正常羊细胞DNA；M：100bp Marker(100bp Marker从上到下顺序为 1k、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100 bp)。

具体实施方式

本发明通过将含有attB序列及外源基因的质粒和含有链霉菌噬菌体 φC31整合酶基因的质粒，按一定比例混合，转染羊皮肤成纤维细胞，然后 筛选阳性克隆株，提取阳性细胞基因组DNA，利用反向PCR技术，将扩增 产物进行测序分析，通过序列比对，寻找羊基因组序列和载体attB序列融合 序列，鉴定得到了羊基因组的4个假attP位点。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为 25℃。

本发明的实施例中所用到的含有目的基因绿色荧光蛋白和attB位点的 质粒pEGFP-N1-attB以及含链霉菌噬菌体φC31整合酶基因的质粒pCMVInt 的构建参考申请号位20051011476.3的中国发明专利申请。

本实施例中所用的细胞，为上海医学遗传研究所松江科研基地提供的小 羊耳皮肤成纤维细胞。

实施例1细胞的转染和筛选

(1)转染前准备羊耳皮肤成纤维细胞培养。待细胞长至60-70％单层 后，弃培养基，用无血清DMEM F12培养液洗2次，在10％FBS(胎牛血 清)条件下连续培养4天。转染前2-3h换培养液一次，以刺激细胞生长。

(2)转染液的制备

A液：各取3μg纯化后的整合酶质粒DNA(质粒pCMVInt)和1μg含 EGFP目的基因的质粒(质粒pEGFP-N1-attB)，用不含血清DMEM F12培 养液定容稀释到400μl，轻轻混匀，室温静置5min。

B液：10μl脂质体2000用不含血清DMEM F12培养液定容稀释到 400μl，轻摇混匀，室温静置5min。

B液加入到A液中，轻轻摇匀，室温(25℃)静置20min，即配得 lipo2000/DNA/DMEM F12混合液，备用。

(3)转染倾去培养液，用3ml不含血清DMEM F12培养液漂洗细胞 二次，倾去培养液。将配制好的lipo2000/DNA/DMEM F12混合液缓慢加入 培养板中，前后摇几次。使培养液完全覆盖细胞。37℃，5％CO₂及饱和湿 度下继续培养6小时，吸除无血清转染液。用无血清DMEM F12彻底清洗4 次，加入2ml含有10％FBS的DMEM F12培养液连续培养24小时。

(4)筛选吸去DMEM F12培养液，加入含有G418(500ng/μl)的DMEM F12培养液，37℃，5％CO₂及饱和湿度下继续培养。

实施例2细胞克隆的挑取和DNA的收集

(1)选择培养持续12天后，显微镜下镜检，可看到独立的细胞克隆。 对G418抗性细胞，在紫外灯下能够发出绿色荧光的细胞克隆进行挑取。吸 去培养液，PBS清洗一遍，在显微镜下，于细胞克隆处加10μl 0.25％的胰 酶(胰蛋白酶)溶液，待细胞逐渐变圆后，用移液枪吸取，转移至6孔板继 续培养。

(2)待细胞长至90％的密度，每孔用1ml胰酶消化细胞。消化后的细 胞用PBS清洗2遍，4000g×10min离心收集细胞。

400μl STE(细胞裂解液)吹匀细胞，加蛋白酶K至终浓度为100μg/ml， 混匀。

将裂解细胞的悬液放置于37℃水浴中过夜。

将溶液冷却至室温，加等体积(400μl)0.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡 的苯酚，缓慢轻柔地来回颠倒离心管10min，使两相最终混合。4℃离心 5000g，15min。

用移液管将上层水相移至一个洁净离心管中。向水相中加入一半体积 (200μl)苯酚和200μl氯仿，4℃离心5000g，10min。

将上层全部的水相移至另一离心管中(1.5ml离心管)，向其中加入等体 积(400μl)的氯仿，4℃离心5000g，5min。

将上层全部的水相移至另一离心管中(1.5ml离心管)，于室温加2倍体 积(800μl)的无水乙醇，转动离心管使溶液充分混合，室温静置15min，4℃ 离心10000g，10min，可见管底胶状DNA沉淀。

70％乙醇清洗DNA，10000g，5min，弃去液体，自然晾干。

100μl TE溶解DNA，得每个细胞克隆的DNA溶液。

实施例3反向PCR鉴定整合位点

(1)断裂点5’端序列鉴定

在载体pEGFP-N1-attB的attB序列上游200～800bp左右设计一对反向 PCR引物G1和G2，序列分别为：

G1：5’-CTGAACCTGAAACATAA-3’；

G2：5’-CACCTTGATGCCGTTCTT-3’。

取10μg细胞DNA，用2μl Hind III酶切，37℃，过夜；酶解反应液用 酚/氯仿抽提后，无水乙醇沉淀，20μl TE溶解；溶解后的DNA片段，加入1μl T4DNA Ligase，200μl体系，16℃反应过夜。

连接产物用酚/氯仿抽提、无水乙醇沉淀后，溶于20μl水，即模板DNA。

PCR反应体系：LA Buffer 2.5μl；d NTP mixture 4μl；引物各1μl；模板 DNA 1μl；LA TaqE 0.25μl；dd H₂O 15.5μl；共25μl。

反应条件：94℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃3min，32cycles， 最后，72℃延长10min。

将PCR扩增产物进行电泳，电泳结果如图1，其中，大于1kb的条带即 为包含基因组的扩增条带。

将反向PCR扩增的产物回收，送测序公司测序。测序结果通过NCBI BLAST与所用的载体pEGFP-N1-attB序列进行比对。比对显示，载体中序 列恰好在理论上的attB断裂区断裂，断裂一端为载体序列，一端为基因组序 列，表明该位置恰为整合酶识别位点。

(2)断裂点3’端序列鉴定：

在载体pEGFP-N1-attB的attB序列下游200bp左右和pEGFP-N1-attB载 体多克隆位点上游400bp左右设计一对反向PCR引物G3和G42，序列分别 为：

G3：5’-TCG CCA CCT CTG ACT TGA GC-3’；

G4：5’-CCG CCT CAG GAC TCT TCC TT-3’。

方法同上，PCR扩增，产物测序，分析测序结果。

通过以上对测序结果的分析，共得到5个假attP位点。通过生物信息学 比对，拼接出羊基因组内假attP位点的序列，分别是序列表中SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4共4个假attP位点。

实施例4外源基因在羊基因组假attP位点处整合的检测

1、PCR扩增：根据羊基因组中的1号克隆的“假attP位点”和载体的 attB序列，设计一对引物：

上游引物序列1F为：5’-TCTGCTCCTGATGACATCTG-3’；

下游引物序列1R为：5’-CTTGTGAATCTCAACTATAA-3’。

PCR反应体系：1×PCR缓冲溶液，1.5mM Mg²⁺，引物各10μM，200μM dNTPs，模板DNA(“假attP位点”和载体的attB序列整合后的序列) 200ng～500ng，2U ex-Taq DNA聚合酶(Takara公司)。

PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，58℃1min，72℃1min，32个 循环；72℃10min。

上述一对引物分别位于假attP位点的左臂和attB位点的右臂，当该位点 的整合发生时，假attP位点的左臂和attB位点的右臂即连接形成attR，因此 可通过PCR检测，并根据引物所在位置，可得知发生整合后PCR产物的大 小。根据理论计算，PCR产物大小应为550bp。

2.将PCR产物进行电泳，结果如图2所示，图2的电泳结果显示：发生 整合后PCR产物大小为550bp，与理论大小一致。

因此在1号克隆细胞中，外源基因在整合酶介导下整合于小羊耳皮肤成 纤维细胞中的假attP位点。