传统普洱茶微生物群种子的制备及其在普洱茶发酵中的应用

摘要

本发明公开了一种传统普洱茶微生物群种子的制备方法及其在普洱茶发酵中的应用，本发明的方法包括，从刚刚经过天然发酵生产的优质普洱茶中分离所有种类微生物菌落，鉴别相同菌和有害菌；除去有害菌，选取有害菌以外的菌落分别在灭菌过的等重量的茶或者小麦米培养基中培养，得到纯菌种培养物，将其在原料青茶中接种发酵、阴凉干燥得到优质的普洱茶。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种制备新型的传统普洱茶微生物群种子的方法，并将其普洱茶微生物 群种子接种于原料青茶中进行发酵，稳定地生产优质普洱茶。

背景技术：

普洱茶(Pu-Er tea)原产于我国云南，目前推广到广西、四川等地，以大叶茶， 野生茶，大理茶和苦茶的晒青茶为原料，堆积自然发酵生产的。普洱茶的品质特点为外 形色泽棕褐、条索粗壮、内质滋味醇厚、陈香显著、汤色红浓、叶底红褐，具有降脂减 肥、抗衰老、防癌等多种生理功能。并且对于防治心脑血管疾病，抗氧化，增强免疫力， 缓解烟瘾危害等也有一定功效。

目前，优质的传统普洱茶生产方法是生晒的青茶，加水、堆积、利用自然界微生物 天然发酵、发酵温度到60℃，翻堆降温、一般发酵40～60天左右，自然风干、陈化得到 普洱茶。但其传统方法盲目性大，有时能产优质产品，但有时出现劣质产品，产品质量 不稳定，易感染杂菌，难以实现现代化稳定生产。

曾报道的《云南普洱茶人工接种发酵研究》一文(彭翠珍等，云南大学学报，2008，30 (S1)：351～355)，从自然发酵生产的普洱茶中分离筛选黑曲霉、青霉、毛霉、根霉、 酵母等微生物；并将其单独菌、或者黑曲霉与酵母、或毛霉与黑曲霉、或青霉与酵母微 生物组合，人工接种于青茶原料中、进行普洱茶发酵，尝试了普洱茶生产；其中(黑曲 霉+酵母)及(青霉+酵母)的菌种组合的接种、发酵生产的普洱茶主要生化成分及感观指 标，接近传统普洱茶

亦有、发明专利号为200610010958.4公开了一种茶叶的后发酵生产方法：从自然 发酵生产的普洱茶中分离筛选了温特曲霉烟色变种、帚状曲霉、具黄曲霉、埃及曲霉、 臭曲霉、日本曲霉原变种、局限灰曲霉等7种曲霉属的微生物，并在其7种曲霉菌中选用 一种或者几种曲霉菌、制成“普洱茶曲”、接种于预先灭菌过的青茶原料中，在30-50 ℃发酵生产普洱茶。(陈可可等，云南植物研究，2008，30(5)：624～628)

但是，我国固有的传统普洱茶天然发酵时，至少几十种微生物协同发酵，生产出特 有风味的传统普洱茶；上述方法(现有技术)的选用一种或者两种或者几种的、从传统 普洱茶筛选的微生物、人工接种于青茶原料，发酵生产普洱茶，均不能代表传统普洱茶 天然发酵的微生物菌群的发酵，其生产的普洱茶品质和风味与传统普洱茶相比仍有差 距。

为了克服上述现有技术的缺点，本发明，从刚发酵生产的优质传统天然普洱茶中分 离筛选所有微生物菌群，按照原传统天然普洱茶的微生物种群比例，制备“传统普洱茶 微生物群种子”，将其微生物群种子人工接种于原料青茶，发酵生产品质与传统普洱茶 相当的优质普洱茶。

发明内容：

本发明为了克服现有发酵工艺中所存在的技术问题，提出一种制备新型的“传统普 洱茶微生物群种子”的方法，并将其普洱茶微生物群种子接种于原料青茶中进行发酵， 稳定的生产优质的传统普洱茶；由于“传统普洱茶微生物群种子”含有传统普洱茶发酵 所有微生物菌群，由它发酵的普洱茶品质与传统普洱茶相同，生产好控制，每批质量相 同、稳定，缩短传统普洱茶发酵时间，克服了传统普洱茶发酵中发酵周期长，产品质量 不稳定，杂菌多，盲目性大等缺点；也克服了人工接种一种或者两种或者几种微生物发 酵制备的普洱茶、与传统普洱茶比较、风味不全的缺点。

本发明的技术解决方案：

一种制备优质普洱茶发酵的方法，以下步骤：

1)从天然发酵生产的优质普洱茶中分离微生物菌落，

2)除去有害菌，

3)菌落在茶或者小麦米培养基中培养；

4)将其在原料青茶中接种发酵得到优质的普洱茶。

其中，步骤1中所述分离微生物菌落是从刚经过天然发酵生产的优质普洱茶中分 离所有种微生物菌落。

其中，步骤2中所述除去有害菌是经过鉴别相同菌和有害菌；除去有害菌，

其中，步骤3中所述培养是选取有害菌以外的菌落分别在灭菌过的等重量的茶或 者小麦米培养基中培养；菌落中若有相同菌，其中选一个最茁壮的菌、在菌落数倍数重 量的茶或者小麦米培养基中培养、得到多种纯菌种培养物。

其中，步骤4中所述接种发酵是将干燥后的含有传统普洱茶天然发酵所有微生物 菌群的微生物群种子在青茶中接种发酵、阴凉干燥得到优质的普洱茶，步骤4中传统普 洱茶微生物群种子人工接种发酵普洱茶时，传统普洱茶微生物群种子直接混合到原料青 茶中进行发酵；接种量为原料青茶的0.05～1.5％；普洱茶发酵温度为40～60℃之间。

步骤1，2，3，4具体如下：刚经过天然发酵生产的优质普洱茶，用预先灭菌过的 生理盐水稀释制成10^-3～10^-8倍微生物稀释液，分别涂布于盛有固体土豆培养基或者5％ 的麦汁固体培养基的培养皿中，在28～35℃培养2～4天，得到20～40个单菌落的培 养皿；其所有菌落进一步分离纯化成纯微生物菌种，保存备用，检查所有新分离的菌， 鉴别有害菌和相同菌，具体鉴别方法是：酵母菌按照C.P.Kurtzman & J.F.Fell.编著的 《The Yeasts，a Taxonomic study，4th ed，Elsever，Amsterdam，1997》规定进行；霉菌按照 P.M.Kirk，J.C.David and J.A.Stablers编著的《Ainsworth and Bisby’s Dictionary of Fungi， CAB International，England，2001》规定进行；细菌或放线菌按照John G.Holt主编的 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，2nd ed，vol.1-5，Spriner-Verlag，2001-》规定 进行。

确定菌的种类数；去掉有害菌，有益菌分别接种到按照菌落数量比例制备的茶叶培 养基或者碾压小麦米中，在28～35℃培养3～6天，全部混合、在30℃以下干燥到水分 14％以下，得到含所有传统普洱茶天然发酵微生物菌群的传统普洱茶微生物群种子，晒 干大叶茶中加入上述传统普洱茶微生物群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌 过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵5天，温度上升到58℃，翻堆、在40℃～60 ℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆；发酵21天结束，通风阴凉处干燥，陈化得 普洱茶。

所述优质普洱茶是大叶茶[Camellia sinersis(L.)O.Kuntze  var.assamica(Masters)Kitamura]、大理茶[C.taliensis(W.Smith)Melchior]和苦 茶[C.sinensis var.kucha Chang et Wang]，其山茶、野生茶。

本发明还包括一种含有传统普洱茶天然发酵所有微生物菌群的微生物群种子的制 备方法，步骤如下：刚经过天然发酵生产的优质普洱茶，用预先灭菌过的生理盐水稀释 制成10^-3～10^-8倍微生物稀释液，分别涂布于盛有固体土豆培养基或者5％的麦汁固体培 养基的培养皿中，在28～35℃培养2～4天，得到20～40个单菌落的培养皿；其所有 菌落进一步分离纯化成纯微生物菌种，保存备用，检查所有新分离的菌，鉴别有害菌和 相同菌，确定菌的种类数；去掉有害菌，有益菌分别接种到按照菌落数量比例制备的茶 叶培养基或者碾压小麦米中，在28～35℃培养3～6天，全部混合、在30℃以下干燥到 水分14％以下，得到含所有传统普洱茶天然发酵微生物菌群的微生物群种子。

本发明同现有技术相比，最大的特点是“传统普洱茶微生物群种子”中传统普洱茶 发酵所需的有益微生物菌群俱全，由它发酵的普洱茶品质与传统普洱茶相同，生产好控 制，每批质量相同、稳定，缩短传统普洱茶发酵时间等；克服了传统普洱茶发酵中发酵 周期长，产品质量不稳定，杂菌多，盲目性大等缺点；也克服了人工接种一种或者两种 或者几种微生物制备的普洱茶的风味不全的缺点。

具体实施方式：

以下用实施例进一步说明本发明。

实施例1：

传统天然发酵的优质大叶茶[Camellia sinersis(L.)O.Kuntze var.assamica (Masters)Kitamura]普洱茶中分离其微生物群、制备“传统普洱茶微生物群种子”及 其普洱茶的发酵。

A)普洱茶菌群的分离：取2g左右的刚天然发酵生产的大叶茶的传统优质普洱茶， 加入到盛有18mL预先灭菌过的生理盐水的三角瓶中，振荡20分钟、制成10^-1微生物稀释 液；取1毫升上述10^-1微生物稀释液上清、加入于9毫升预先灭菌过的生理盐水中摇匀制 成10^-2稀释液；再取取1毫升上述10^-2微生物稀释液、加入于9毫升预先灭菌过的生理盐水 中摇匀制成10^-3稀释液；以此类推，配制成10^-1到10^-8的天然发酵的传统普洱茶微生物菌 群稀释液。

分别取0.1～0.2毫升的各浓度的微生物稀释液，分别注入到盛有固体土豆培养基或 者5％的麦汁固体培养基的直径9～15厘米的培养皿中、将稀释液涂布均匀，在28～35℃ 培养2-3天(此过程均在无菌室内进行无菌操作；其固体土豆培养基：优质马铃薯200g， 葡萄糖20g，琼脂20克，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，蛋白胨4g，加水至1000ml，灭菌前 调pH至5.5；麦汁固体培养基：含2％琼脂的5％的麦汁)。其中，传统普洱茶微生物菌群 10^-6稀释液培养的培养皿中出现了27个单菌落、一个两种菌的菌落连接的菌落；其27个 单菌落分别在盛有固体培养基的培养皿中划线培养分离得到纯菌种，保存备用；其一个 两种菌的菌落连接的菌落也在盛有固体培养基的培养皿中划线培养分离得到两个纯菌 种，分别保存备用；共得到29个菌。其各菌落显微镜的形态观察和生理生化试验，29个 菌中28种菌为有益菌、其中9个菌是相同菌，其余1个菌为产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的有 害菌；也就是得到了19种普洱茶发酵微生物菌群。

B)传统普洱茶微生物群种子的制备：

1)茶叶的传统普洱茶微生物种子制备：250毫升三角瓶中加入25克晒干原料青茶， 再加入12.5毫升的水，在121℃下灭菌20分钟，制备18瓶；2000毫升三角瓶中加入225克 晒干原料青茶，再加入125毫升的水；在121℃下灭菌20分钟，得到三角瓶培养基。2000 毫升三角瓶培养基中接入9个相同菌中最茁壮的菌，其余18瓶250毫升三角瓶培养基中分 别接其余18种单菌落菌，在放置于30～35℃培养、每12小时摇匀一次、3～5天制成纯菌 种培养物；其19种纯种菌培养物全部混合、30℃以下干燥得到700克左右的传统普洱茶 微生物俱全的“传统普洱茶微生物群种子”。其“传统普洱茶微生物群种子”水分14％ 以下，在4～16℃保存一年也活力不降低，照样用于普洱茶发酵。

2)小麦的传统普洱茶微生物种子制备：制备过程与茶叶的传统普洱茶微生物种子 制备过程完全一样，只是原料青茶换成碾压的小麦米即可。可以重复制备，在4～15℃ 可保存一年，活力不降低，照常可以使用；不同的是用于普洱茶发酵时不能直接混合到 原料青茶中，而是将小麦的传统普洱茶微生物群种子中加入5倍的灭菌过的水，纱布过 滤，其过滤液混合到原料青茶中发酵生产普洱茶。

C)“传统普洱茶微生物群种子”的普洱茶发酵：

发酵1：100公斤晒干大叶茶(青茶)中加入0.1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物 群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵 5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵21天结束，通风阴凉处干燥，陈化得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然 发酵传统普洱茶相当。

发酵2：100公斤晒干大叶茶(青茶)中加入500毫升的0.1公斤上述小麦的传统普洱 茶微生物群种子的浸出液混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽 内堆积发酵，发酵5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接 近60℃立即翻堆；发酵21天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分 与原分离菌的天然发酵传统普洱茶相当。

发酵3：100公斤晒干大叶茶(青茶)中加入1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物群 种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵4 天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆；发 酵17天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然发 酵传统普洱茶相当。

发酵4：100公斤晒干大叶茶(山茶)中加入0.1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物 群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵 5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵21天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与天然发酵传统普 洱茶相当。

发酵5：100公斤晒干大理茶(青茶)中加入0.1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物 群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵 5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵22天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与天然发酵传统普 洱茶相当。

实施例2：

传统天然发酵的优质大理茶[C.taliensis(W.W.Smith)Melchior]普洱茶中分离其 微生物群、制备“传统普洱茶微生物群种子”及其普洱茶的发酵。

A)普洱茶菌群的分离：完全按照实施例1中从传统天然发酵的优质大叶茶普洱茶中 分离其微生物菌群方法，从传统天然发酵的优质大理茶普洱茶中分离其微生物菌群结 果，传统大理茶普洱茶微生物菌群10^-6稀释液培养的培养皿中出现了22个单菌落；其22 个单菌落分别在盛有固体培养基的培养皿中划线培养分离得到纯菌种，保存备用；其各 菌落显微镜的形态观察和生理生化试验表明，其中1个菌落是有害的大肠杆菌，其余21 个菌落为有益菌；也就是得到了21种普洱茶发酵微生物菌群。

B)传统普洱茶微生物群种子的制备：

1)茶叶的传统普洱茶微生物群种子制备：250毫升三角瓶中加入25克晒干原料青茶， 再加入12.5毫升的水，在121℃下灭菌20分钟，制备21瓶；分别接其余21种单菌落菌， 放置于30～35℃培养、每12小时摇匀一次、3～5天制成纯菌种培养物；其纯种菌培养物 全部混合、30℃以下干燥得到350～410克的传统普洱茶微生物俱全的“传统普洱茶微生 物群种子”。其微生物种子在4～16℃保存一年活力不降低、照常用于普洱产发酵。

2)小麦的传统普洱茶微生物群种子制备：制备过程与茶叶的传统普洱茶微生物种 子制备过程完全一样，只是原料青茶换成碾压的小麦米即可。可以重复制备，在4～15 ℃可保存一年内使用；普洱茶发酵时不能直接混合到原料青茶中发酵普洱茶，而是小麦 的传统普洱茶微生物种子中加入5倍灭菌过的水，纱布过滤，其过滤液混合到原料青茶 中发酵生产普洱茶。

C)普洱茶发酵：

发酵1：100公斤晒干大理茶(青茶)中加入0.1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物 群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵 5～6天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵25天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然 发酵传统普洱茶相当。

发酵2：100公斤晒干大理茶(青茶)中加入500毫升的0.1公斤上述小麦的传统普洱 茶微生物群种子的浸出液混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽 内堆积发酵，发酵5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接 近60℃立即翻堆；发酵24天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分 与原分离菌的天然发酵传统普洱茶相当。

发酵3：100公斤晒干大理茶(青茶)中加入0.5公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物 群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵 4～5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵17天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然 发酵传统普洱茶相当。

实施例3：

传统天然发酵的优质山茶(野生茶)普洱茶中分离其微生物群、制备“传统普洱茶 微生物群种子”及其普洱茶的发酵。

A)苦茶普洱茶菌群的分离：完全按照实施例1中从传统天然发酵的优质大叶茶普洱 茶中分离其微生物菌群方法，从传统天然发酵的优质山茶普洱茶中分离其微生物菌群结 果，传统山茶普洱茶微生物菌群10^-5稀释液培养的培养皿中出现了33个单菌落和一个两 个菌落连结体；其33个单菌落和菌落连结体分别在盛有固体培养基的培养皿中划线培养 分离得到35个纯菌种，保存备用；其各菌落显微镜的形态观察和生理生化试验表明，其 中无有害菌落，11个菌落为相同的臭曲霉菌，6个菌落为相同的日本曲霉菌；也就是得 到了20种普洱茶发酵微生物菌群。

B)传统普洱茶微生物群种子的制备：

2000毫升三角瓶中加入225克晒干原料青茶，再加入125毫升的水，准备用于11个相 同的臭曲霉菌落；1000毫升三角瓶中加入125克晒干原料青茶，再加入61.5毫升的水， 准备用于6个相同的日本曲霉菌落；250毫升三角瓶中加入25克晒干原料青茶，在加入 12.5毫升的水，准备18瓶用于接其余18种菌落。其培养基在121℃下灭菌20分钟、冷却、 分别接种20种单菌落菌，在放置于28～35℃培养、每12小时摇匀一次、4～6天制成纯菌 种培养物；将其纯种菌培养物全部混合、在30℃以下干燥到水分14％以下、得到700～810 克的传统普洱茶微生物俱全的“传统普洱茶微生物群种子”，其微生物种子在4～16℃保 存一年活力不降低、照常用于普洱茶发酵。

C)普洱茶发酵：

发酵1：100公斤晒干山茶(青茶)中加入0.1公斤上述茶叶的传统普洱茶微生物群 种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵5～ 6天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆； 发酵25天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然 发酵传统普洱茶相当。

发酵2：100公斤晒干大叶茶(青茶)中加入500毫升的0.5公斤上述普洱茶微生物群 种子，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合，在发酵槽内堆积发酵，发酵4～5天 其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发酵，温度接近60℃立即翻堆；发酵 18天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官指标和成分与原分离菌的天然发酵 传统普洱茶相当。

发酵3：100公斤晒干苦茶[C.sinensis var.kucha Chang et Wang](青茶)中加入 0.2公斤上述普洱茶微生物群种子混合，再加入35℃的45升预先加热灭菌过的水混合， 在发酵槽内堆积发酵，发酵4～5天其品温上升到58℃，翻堆、在40℃～60℃之间进行发 酵，温度接近60℃立即翻堆；发酵17天发酵结束，通风阴凉处干燥，得普洱茶；其感官 指标和成分与天然发酵传统普洱茶相当。

参考文献：

1.陈可可等，发明专利号为200610010958.4

2.陈可可等：曲霉属真菌在普洱茶后发酵中的作用，云南植物研究，2008，30(5)： 624～628。

3.彭翠珍等：云南普洱茶人工接种发酵研究，云南大学学报(自然科学版)，2008， 30(S1)：351～355。