一种动态检测组培苗蒸腾速率和水分利用率的方法

摘要

本发明公开一种动态检测组培苗蒸腾速率和水分利用率的方法，先分别称量含转接的组培苗培养瓶质量及装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶的质量，检测组培苗生物量，将接有组培苗培养瓶与装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶放在同样培养条件下培养后再分别称量，同时检测组培苗此时的生物量；然后计算出组培苗的蒸腾失水量，分别构建蒸腾失水量与培养时间的关系模型、组培苗生物量与培养时间的关系模型及组培苗生物量与蒸腾失水量的关系模型，最后计算出培养期间任一时间的组培苗的蒸腾速率及水分利用率；本发明无需直接接触培养基中小植株的叶片，可以无菌、动态测定植物组织培养过程中组培苗的蒸腾速率及水分利用率的变化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动态检测组培苗蒸腾速率和水分利用率的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

植物经常处于吸水和失水的动态平衡之中。植物一方面从生长基质中吸收水分，另一方面又向大气中蒸发水分。陆生植物在一生中耗水量很大。据估算，一株玉米一生需耗水200 kg 以上。其中只有极少数（约占1.5%～2%）水分是用于体内物质代谢，绝大多数都散失到体外。其散失的方式，除了少量的水分以液体状态通过吐水的方式散失外，大部分水分则以气态、即以蒸腾作用的方式散失。所谓蒸腾作用是指植物体内的水分以气态散失到大气中去的过程。与一般的蒸发不同，蒸腾作用是一个生理过程，受到植物体结构和气孔行为的调节。

蒸腾作用消耗水分，这对陆生植物来说是不可避免的，它既会引起水分亏缺，破坏植物的水分平衡，甚至引起祸害，但同时，它又对植物的生命活动具有重要的意义。蒸腾作用的正常进行有利于CO₂的同化；蒸腾作用产生的蒸腾拉力是植物被动吸水与转运水分的主要动力。植物在发生蒸腾作用时，基质中的矿质盐类和根系合成的物质可随着水分的吸收和集流而被运输和分布到植物体各部分去。蒸腾作用还能降低植物体的温度。

植物组织培养是指在控制的环境条件下，在人工配制的培养基中，将离体的植物细胞、组织或器官进行培养发育再生成完整植株的技术。在植物组织培养过程中，组培苗的生长方式有三种：一种是小植株靠光合作用进行自养生长；二是小植株靠培养基中的糖进行异养生长；三是小植株既靠培养基中的糖又靠人工光照，同时进行异养和自养的兼养生长。现在常规的组织培养快繁技术大多数是以第三种方式进行。组培苗的光合能力的大小影响着植株的生长、发育和分化。而小植株在进行光合作用的过程中，也必须和周围环境发生气体交换；在气体交换的同时，又会引起植物大量丢失水分。因此组培苗的蒸腾作用的大小也与组培苗的自养能力有关，测定组培苗的蒸腾速率和水分利用率，不仅为探讨组培苗的生长规律提供了重要的理论价值，同时还可以为培养基的选择、激素的配比、培养环境的控制、组培苗的转接时间的选择以及驯化提供科学依据。

目前，测定大田植物的蒸腾速率的常用方法有以下几种：

1.植物离体部分的快速称重法。切取植物体的一部分(叶、苗、枝或整个地上部分)迅速称重，2～3min后再次称重，两次重量差即为单位时间内的蒸腾失水量。这个方法的依据是植物离体部分在切割后开始的2～5min内，原有的蒸腾速率无多大改变。称重时可采用扭力天平或电子分析天平。

2.测量重量法。把植株栽在容器中，茎叶外露进行蒸腾作用，容器口适当密封，使容器内的水分不发生散失。在一定间隔的时间里，用电子天平称得容器及植株重量的变化，就可以得到蒸腾速率。

3.量计测定法。这是一种适合于田间条件下测定瞬时蒸腾速率的方法，主要是应用灵敏的湿度敏感元件测定蒸腾室内的空气相对湿度的短期变化，当植物的枝、叶或整株植物放入蒸腾室后，在第一个30s内每隔10s测定一次室内的湿度。蒸腾速率是由绝对湿度增加而得到的，而绝对湿度是由相对湿度的变化速率和同一时刻的空气温度计算出来的。近年来，有一种稳态气孔计，其透明小室的直径仅1～2cm，将叶片夹在小室间，在微电脑控制下向小室内通入干燥空气，流速恰好能使小室内的湿度保持恒定，然后可根据干燥空气流量的大小计算出蒸腾速率。

4.红外线分析仪测定法。红外线对双元素组成的气体有强烈的吸收能力，H₂O是双元素（H和O）组成，因此，用红外线分析仪(IRGA)可测定水的浓度，即湿度，并用来计算蒸腾速率。这种仪器如Li-6400便携式光合仪是测定两种空气流中水浓度（绝对湿度）的差值，且可以作两种类型的测量：一是绝对测量，即测定蒸腾室中水蒸气浓度与封闭在参比管内的隋性气体或含有已知浓度的水蒸气的浓度的差值。二是相对测量，即测定流入蒸腾室前和流出蒸腾室后的两种水蒸气浓度间的差值。

以上诸多方法需要与叶片进行接触才能进行测定。对于常规小容器培养的组培苗来说，显然是不合适的，即使将容器设置较大，仪器能接触到组培苗小植株叶片，这一方面不仅会破坏植株生长的无菌封闭环境，同时也不能长期动态地检测组培苗生长过程中的蒸腾作用和水分利用率。目前，国内外还未见对组织培养过程中植株的蒸腾作用和水分利用率进行动态无菌检测的报道。

常规组织培养过程中，接有组培苗的培养瓶的质量会随着培养时间的变化而变化。这种变化主要是三个方面。一、蒸腾作用的散失；二、培养基中的水分的损失；三、小植株生物量的增加。因此，可以通过各个培养期间培养基中的水分的损失、组培苗生长量的变化以及接有组培苗的培养瓶的质量的变化来无菌、动态获取蒸腾速率，通过蒸腾速率和组培苗生长量的变化来获取水分利用率。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的缺陷而提供一种无菌、动态且长期检测组培苗蒸腾速率和水分利用率的方法。

为实现上述目的，本发明动态检测组培苗蒸腾速率的方法的技术方案是采用以下步骤：              

（1）分别称量含转接t₀天的被考察的组培苗培养瓶质量MPt₀以及装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶的质量MNt₀，检测组培苗生物量Mt₀，将接有被考察的组培苗培养瓶与装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶放在同样的培养条件下培养,到t₁天后，再分别称量所述被考察的组培苗培养瓶质量MPt₁以及所述无组培苗空白培养瓶的质量MNt₁，同时检测组培苗此时的生物量Mt₁；

（2）通过公式TPt₀-t₁= MPt₀ – MPt₁ + MNt₀ – MNt₁ - Mt₀ + Mt₁计算出被考察的组培苗在t₀-t₁时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₁，再以同样的方法依次得到被考察的组培苗在                                                时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₂、TPt₀-t₃、……、TPt₀-t_n；

（3）构建蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为 以及构建组培苗生物量M与培养时间t的关系模型为， A，B均为拟合参数， M₀是对数生长期的起始期组培苗的生物量，a是组培苗的生物量的最大生长量，b是拟合参数中的指数项，T₀是在对数生长量一半时的时间；

（4）构建组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型是，m，n 分别为拟合参数；

（5）先求出TP=At+B的一阶导数得到组培苗蒸腾失水速率TPVt_i=A，再通过所述计算出培养期间任一时间t_i的组培苗的生物量， 最后计算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率 。     

本发明动态检测组培苗水分利用率的方法采用的技术方案是采用如下步骤：（1）分别称量含转接t₀天的被考察的组培苗培养瓶质量MPt₀以及装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶的质量MNt₀，检测组培苗生物量Mt₀，将接有被考察的组培苗培养瓶与装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶放在同样的培养条件下培养,到t₁天后，再分别称量所述被考察的组培苗培养瓶质量MPt₁以及所述无组培苗空白培养瓶的质量MNt₁，同时检测组培苗此时的生物量Mt₁；

（2）通过公式TPt₀-t₁= MPt₀ – MPt₁ + MNt₀ – MNt₁ - Mt₀ + Mt₁计算出被考察的组培苗在t₀-t₁时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₁，再以同样的方法依次得到被考察的组培苗在时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₂、TPt₀-t₃、……、TPt₀-t_n；

（3）构建蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为 以及构建组培苗生物量M与培养时间t的关系模型为， A，B均为拟合参数， M₀是对数生长期的起始期组培苗的生物量，a是组培苗的生物量的最大生长量，b是拟合参数中的指数项，T₀是在对数生长量一半时的时间；

（4）构建组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型是，m，n 分别为拟合参数；

（5）求所述的一阶导数方程得到，再根据所述得出 ，则任意时间段t_i的水分利用率  。

  本发明的优点如下：

1）本发明需要的设备简单，方便、快捷。

2）本发明无需直接接触培养基中小植株的叶片，可以无菌、动态测定植物组织培养过程中组培苗的蒸腾速率的变化。

3）本发明可以动态检测培养期中组培苗水分利用率变化。

具体实施方式

对含转接t₀天的被考察的组培苗的培养瓶称量，得到的质量是MPt₀，同时对组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶称量，得到的质量是MNt₀。利用图像处理法检测，得到组培苗生物量Mt₀。将含转接t₀天的被考察的组培苗的培养瓶装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶放在同样的培养条件下培养，到t₁天结束时，再分别称量含转接t₀天的被考察的组培苗的培养瓶质量，得到的质量是MPt₁，以及称量装有同体积培养基的无组培苗空白培养瓶，得到质量MNt₁；同时利用图像处理法检测组培苗的生物量，得到t₁天结束时的组培苗生物量是Mt₁。

根据上述称量以及检测的结果，计算被考察的组培苗在t₀-t₁这一时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₁，计算公式是：TPt₀-t₁= MPt₀ – MPt₁ + MNt₀ – MNt₁ - Mt₀ + Mt₁。用同样的方法和步骤，可以依次测定并计算出时间段的蒸腾失水量TPt₀-t₂、TPt₀-t₃、……、TPt₀-t_n，以及利用图像处理法得到 时期的组培苗生物量M。依据得到的这些蒸腾失水量TPt₀-t₂、TPt₀-t₃、……、TPt₀-t_n数据以及组培苗生物量M，构建蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型以及组培苗生物量M与培养时间t的关系模型。

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型用线性方程拟合为：

                                                     （1）

其中A，B均为拟合参数。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程拟合为：

                                          （2）

其中M₀，a，T₀为拟合参数。M₀表示对数生长期的起始期组培苗的生物量，a表示组培苗的生物量的最大生长量，b是拟合参数中的指数项，T₀表示在对数生长量一半时的时间。

再构建组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型，以非线性双曲线方程进行拟合，拟合方程如下：

                                                 （3）

其中m，n 分别为拟合参数。

根据式（1）的蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型，求一阶导数得到这瓶组培苗蒸腾失水速率，可知TP′＝A，即这瓶组培苗蒸腾失水速率为TPVt_i=A。

通过组培苗生物量M与培养时间t的关系模型式（2），计算出培养期间任一时间t_i的组培苗的生物量Mt_i为：

                                      （4）

则培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率为：  

         （5）

由此可知，蒸腾失水速率TPVt_i=A 为一常量，而蒸腾速率TRt_i=TPVt_i/Mt_i则是随着生物量Mt_i 的变化而变化，是将蒸腾失水速率除以生物量得来的。

通过组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型式（3），求一阶导数方程，可得：

                                           （6）

将蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型方程TP=At+B，带入式（6）中，得出： 

                                               （7） 

从而可以算出任意时间段t_i的水分利用率，见下式（8）：

                     （8）

    以下提供本发明的6个实施例以进一步说明本发明：

实施例1

样品为继代10代的茅苍术组培苗，基本培养基为无机氮减少到2/3、其他成分不变的MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表1-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法，利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像；在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计；把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程；将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如下表1-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、0-12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率TR与水分利用率WUE如下表1-2所示。

表 1-1 不同培养时间实施例1的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 1-2 不同培养时间实施例1的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-0.6855+0.2210t（R²=0.9912，样品数为6）。                   

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程用来拟合，拟合出的方程为：

 （R²=0.9967，样品数为6）       （9）

根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP=-0.6855+0.2210t，求一阶导数，TP′＝0.2210，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2210。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（9）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（10），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表1-1。

          （10）

组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型用非线性双曲线方程拟合。

拟合的方程为：

 (R²=0.9641，样品数为6)                            （11）

方程（11）的一阶导数方程为： 

                                                       （12）

将TP=-0.6855+0.2210t 带入式（12）中，可得：

                                  (13)

根据方程（13）可求出任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率，结果如表1-2。

实施例2

样品为继代4代的茅苍术组培苗，基本培养基为无机氮减少到2/3、其他成分不变的MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表2-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法。利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如表2-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率TR与水分利用率WUE，如表2-2。

表 2-1 不同培养时间实施例2的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 2-2 不同培养时间实施例2的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-0.9471+0.2323t（决定系数的平方R²=0.9850，样品数为6）。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程用来拟合，拟合出的方程为：

  (R²=0.9988，样品数为6)      （14）

    根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP= -0.9471+0.2323t，求一阶导数，TP′＝0.2323，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2323。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（14）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（15），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表2-2。

               （15）

组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型用非线性双曲线方程拟合。

拟合的方程为：

 （R²=0.9917，样品数为6）                                 （16）

方程（16）的一阶导数方程为： 

                                                                      （17）

将TP=-0.9471+0.2323t带入式（17）中，可得：

                                               （18）

根据方程（18）可求出任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率WUE，结果如表2-2。

实施例3

样品为继代10代的茅苍术组培苗，基本培养基为MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表3-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法。利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如表3-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、0-12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率TR与水分利用率WUE，如下表3-2。

表 3-1 不同培养时间实施例3的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 3-2 不同培养时间实施例3的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-0.7163+0.2045t（R²=0.9764，样品数为6）。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程用来拟合。拟合出的方程为：

  （R²=0.9926，样品数为6）      （19）

根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP=-0.7163+0.2045t，求一阶导数，TP′＝0.2045，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2045。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（19）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（20），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表3-2。

          （20）

组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型用非线性双曲线方程拟合。

拟合的方程为：

 （R²=0.9559，样品数为6）                       （21）

方程（21）的一阶导数方程为： 

                                                             （22）

将TP=-0.7163+0.2045t带入（22）式，可得：

                                         （23）

根据方程（23）可求出任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率，结果如表3-2。

实施例4

样品为继代10代的茅苍术组培苗，基本培养基为无机氮增加到4/3、其他成分不变的MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表4-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法。利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如表4-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、0-12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率TR与水分利用率WUE，如表4-2。

表 4-1 不同培养时间实施例4的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 4-2 不同培养时间实施例4的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-0.7615+0.2330t（,R²=0.9911，样品数为6）。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程用来拟合，拟合出的方程为：

  （R²=0.9982，样品数为6）   （24）

根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP=-0.7615+0.2330t，求一阶导数，TP′＝0.2330，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2330。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（24）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（25），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表4-2。

           （25）

组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型用非线性双曲线方程拟合。

拟合的方程为：

 (R²=0.9793，样品数为6)                            （26）

方程（26）的一阶导数方程为： 

                                                           （27）                  

将TP=-0.7615+0.2330t带入（27）式，可得：

                                       （28）

根据方程（28）可求出任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率WUE，结果如表4-2。

实施例5

样品为继代4代的茅苍术组培苗，基本培养基为无机氮增加到4/3、其他成分不变的MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表5-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法。利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如表5-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、0-12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率TR与水分利用率WUE，如表5-2。

表 5-1 不同培养时间实施例5的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 5-2 不同培养时间实施例5的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

 

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-1.1369+0.2731t（决定系数的平方R²=0.9886，样品数为6）。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程用来拟合，拟合出的方程为：

  （R²=0.9995，样品数为6）   （29）

根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP=-1.1369+0.2731t，求一阶导数，TP′＝0.2731，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2731。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（29）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（30），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表5-2。

            （30）

组培苗生物量M与蒸腾失水TP的关系模型用线性方程进行拟合，由于实施例5中的茅苍术组培苗继代次数少，培养基中的氮素含量较高，茅苍术组培苗处于对数生长期之内，因此可以用线性方程（31）拟合组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型。

                                                              （31）

其中m、n均为拟合参数。

将线性方程（31）组培苗生物量M与蒸腾失水量TP求一阶导数，可得：

                                                                              （32）  

根据蒸腾失水速率与组培苗的生物量拟合的方程为： 

 （R²=0.9903，样品数为6）。             （33）

方程（33）的一阶导数方程为：  

                                                           （34）      

因此由方程（34）可知任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率不变，为195.3 mg FW/ g H₂O。

实施例6

样品为继代10代的茅苍术组培苗，基本培养基为无机氮增加到4/3、其他成分不变的MS培养基，附加糖3%，琼脂0.65%，萘乙酸0.2 mg L^-1、6-卞基嘌呤（6-BA）0.2 mg L^-1。分别在转接后培养0、6、12、16、21、28、38天后进行测定含组培苗的培养瓶质量、无组培苗的装有同体积培养基的空白培养瓶的质量以及组培苗生物量。

分别计算组培苗的t₀-t_n时间段的蒸腾失水量TPt₀-t_n，计算公式是：TPt₀-t_n= MPt₀ – MPt_n + MNt₀ – MNt_n - Mt₀ + Mt_n，t₀为0天，t_n分别为6、12、16、21、28、38天，得到6个蒸腾失水量TP的数据如下表6-1。

组培苗生物量的检测采用图像处理法。利用图像处理法检测组培苗生物量为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以6个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。系列的组培苗生物量数据如表6-1。

由于组培苗对培养基环境的适应需要一定的时间，因此在接种的当天即t₀=0天时组培苗的蒸腾失水量TP与生物量M可以不加以考虑，即拟合蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型、生物量M与时间t的关系模型忽略t₀天的蒸腾失水量TP与生物量M，即在本实施例中只考虑6、0-12、16、21、28、38天的蒸腾失水量TP与生物量M。并计算出第6、12、16、21、25、28、35、38天的蒸腾速率与水分利用率。

表 6-1 不同培养时间实施例6的茅苍术组培苗的蒸腾失水量和组培苗生物量

表 6-2 不同培养时间实施例6的茅苍术组培苗的蒸腾速率和水分利用率

蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型为：TP=-0.7511+0.2232t（R²=0.9894，样品数为6）。

组培苗生物量M与培养时间t的关系模型用四参数Logistic方程拟合，拟合出的方程为：

  （R²=0.9988，样品数为6）    （35）

根据蒸腾失水量TP与培养时间t的关系模型TP=-0.7511+0.2232t，求一阶导数，TP′＝0.2232，可知这瓶组培苗蒸腾失水速率为0.2232。

根据组培苗生物量M与培养时间t的关系模型（35）可求各时间的组培苗生物量即时值。

根据蒸腾失水速率TPVt_i与组培苗的生物量Mt_i的方程（36），算出培养期间任一时间t_i的组培苗的蒸腾速率TRt_i，结果如表6-2。

      （36）

组培苗生物量M与蒸腾失水量TP的关系模型用非线性双曲线方程拟合。

拟合出的方程为：

 （R²=0.9839，样品数为6）                     （37）

方程（37）的一阶导数方程为： 

                                                          （38）

将TP=-0.7511+0.2232t带入（38）式，可得：

                                      （39）

根据方程（39）可求出任一时间t_i的茅苍术组培苗的水分利用率，结果如表6-2。

实施效果

上述所有的样品测定的结果基本趋势是：蒸腾速率和水分利用率都是随培养时间的增加而减小；继代数少的组培苗有着较高的蒸腾速率和水分利用率，如实施例5的蒸腾速率和水分利用率大于实施例4和实施例6的蒸腾速率和水分利用率，实施例2的蒸腾速率和水分利用率大于实施例1的蒸腾速率和水分利用率。这能解释为什么组培苗培养一段时间后，发生退化，需要复壮。培养基中的氮素含量高的，总体上有着较高的蒸腾速率和水分利用率。如实施例4和实施例6的蒸腾速率和水分利用率大于实施例1和实施例3的蒸腾速率和水分利用率，实施例5的蒸腾速率和水分利用率大于实施例2的蒸腾速率和水分利用率。这表明氮素增加，可以增加组培苗的自养能力，在自养能力增加的同时，也增加了蒸腾速率和水分利用率，只是对于茅苍术来说，培养基的无机氮减少到2/3，对蒸腾作用和自养能力影响不显著，与在植物组织培养的实际情况相吻合。