自组装多肽及其在促进肿瘤细胞形成多细胞球体中的应用

摘要

本发明公开了一种自组装多肽及其在促进肿瘤细胞形成多细胞球体中的应用。本发明的自组装多肽包含一段由3-20个连续的疏水氨基酸组成的氨基酸片段，在该氨基酸片段的N末端或C末端或同时在N末端和C末端连接特定多肽；所述特定多肽的序列为GYRGDS、GYRGDSPRGDS、YRGDS、PFSSTKT、SKPPGTSS、YRGDSPRGDS或PRGDS。本发明的自组装多肽可以促进肿瘤细胞迁移并形成多细胞球体。本发明的多肽形成水凝胶后能模拟体内肿瘤组织因缺乏氧和营养造成的组织中心坏死及与胞外基质的相互作用的微环境，使培养的肿瘤细胞形成多细胞球体，从而更真实地模拟肿瘤在体内的生长情况，为有关肿瘤的各种基础或临床研究提供可靠的实验材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可自组装形成水凝胶的多肽及其在促进肿瘤细胞形成多细 胞球体中的应用。

背景技术

多肽具有独特的生物学活性。1999年，美国国家卫生研究院(National  Institutes of Health，NIH)公布了两种人类免疫缺陷病毒(HIV-I)多肽疫苗对人 体进行的I期临床试验结果，证实这两种多肽疫苗能刺激机体产生特异性抗体 和特异性免疫细胞，并有较好的安全性。清华大学也证实HIV-I膜蛋白内一段多 肽具有很强的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也显示有良好的发展前景，国外学 者从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一段多肽，它可刺激机体产生保护 性抗体。总所周知，病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖其 自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。因此，如果从肽库内筛选能与宿 主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽，那么这些多 肽就可用于抗病毒的治疗。此外，多肽还能够模拟细胞因子，具有细胞因子活 性的多肽可开发成新型药物。

综上所述，多肽存在独特的生物学活性，具有多方面的用途，因此，近些 年来，生命科学与材料科学领域对多肽的研究也越来越多。其中，自组装多肽 纳米纤维材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold，SAPNS)更是因其具 有良好的材料——细胞界面相容性和生物学活性越来越受关注。

在生命科学研究领域，对于细胞的体外培养，关注的不仅仅是细胞的分裂 生长，更为重要的是它们经过传代后能否维持体内生长时的性状。在很多情况 下，常规单层细胞培养技术(二维细胞培养，Two-dimensional，2D)所取得的 研究成果和体内的情况并不符合。细胞在体外二维环境下增殖，细胞的基因表 达、信号传导和形态学特征都与体内的有异，细胞会逐渐丧失原有的性状，导 致科研人员无法获得可靠的实验数据。

体外细胞培养的一个重要原则是模拟细胞体内生长的环境，该环境不仅能 让细胞生长传代，还能最大程度地维持细胞在体内生长时的性状，并分化产生 新的组织结构，以便全面研究发育过程。

人体组织为三维(Three-dimensional，3D)结构，但是目前科学界对人体组织 结构、功能、病理等方面进行研究时却往往依赖体外的2D细胞培养或动物模型。 由于体外2D细胞培养所创造的细胞培养环境与细胞体内生长环境有很大不同， 如细胞与细胞、细胞与基质的相互作用等，因此利用体外2D细胞培养不足以反 映细胞真实的生长状况。动物模型由于与人体存在种属差异，同样不能真实地 反映体内细胞生长特征。在此情况下，三维细胞培养技术应运而生。三维细胞 培养技术(three dismensional cell culture，TDCC)是将具有三维结构的载体与各 种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中 迁移、生长，构成三维的“细胞——载体复合物”体系。

目前，国内市场销售的三维细胞培养材料虽然在一定程度上提高了细胞培 养效果，但由于其中多数产品是采用非生物降解材料或化学材料制成，其降解 产物和残留有机溶剂往往对细胞有一定的毒副作用，常引起细胞无菌性炎症， 影响实验结果和数据的可靠性；部分产品虽然是采用生物可降解材料制成，但 一些生物材料含有大量未鉴定成分，这为临床研究带来巨大风险；此外，一部 分生物材料制成的三维细胞培养产品具有保质期短，不易保存和应用的特点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可自组 装形成水凝胶的多肽。

本发明的另一目的在于提供上述自组装多肽在促进肿瘤细胞形成多细胞球 体中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种自组装多肽，包含一段由3-20个连续的疏水氨基酸组成的氨基酸片段， 在该氨基酸片段的N末端或C末端或同时在N末端和C末端连接特定多肽；

所述特定多肽的序列为GYRGDS(SEQ ID NO.1)、GYRGDSPRGDS(SEQ  ID NO.2)、YRGDS(SEQ ID NO.3)、PFSSTKT(SEQ ID NO.4)、SKPPGTSS(SEQ  ID NO.5)、YRGDSPRGDS(SEQ ID NO.6)或PRGDS(SEQ ID NO.7)；

所述的疏水氨基酸为丙氨酸(单字母缩写A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、 亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)；

所述的氨基酸片段优选AAAAAA(SEQ ID NO.8)、VVVVVV(SEQ ID  NO.9)、IIIIII(SEQ ID NO.10)、LLLLLL(SEQ ID NO.11)、FFFFFF(SEQ ID  NO.12)、PPGPPGPPG(SEQ ID NO.13)、FYGFYGFYG(SEQ ID NO.14)或AVILF (SEQ ID NO.15)；

优选地，所述多肽的N末端进行乙酰化处理(ac-处理)，或者对N末端进 行乙酰化处理的同时对其C末端酰胺化处理，即-CONH₂；

所述的自组装多肽优选VVVVVV-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO.16)、 FFFFFF-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO.17)、PPGPPGPPG-YRGDSPRGDS(SEQ  ID NO.18)或FYGFYGFYG-YRGDSPRGDS(SEQ ID NO.19)。

上述多肽的序列是人工设计的，按照现行通用的生物化学方法合成。

上述的多肽可以促进肿瘤细胞形成多细胞球体。往上述多肽加入溶剂溶解 (多肽的质量体积浓度可以小于1％)，形成无色透明的多肽纳米纤维水凝胶溶 液(含水量在99％以上)，在一定盐离子浓度下可自发组装成纳米纤维，并进一 步发生交联，形成多孔网状结构的水凝胶(见图1)，该水凝胶可作为多种人类 细胞，尤其是肿瘤细胞的三维空间组织培养支架。将肿瘤细胞放入上述的多肽 纳米纤维水凝胶中培养，肿瘤细胞能形成多细胞球体，从而更真实地模拟肿瘤 在体内的生长情况，最终目的是使抗肿瘤药物的体外药理药效试验能更准确地 反应其在体内的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的多肽形成水凝胶后能使培养的肿瘤细胞在胶内迁移并形成多细 胞球体，模拟体内肿瘤组织因缺乏氧和营养造成的组织中心坏死及与胞外基质 的相互作用，从而更真实地反映肿瘤在体内的生长情况，为有关肿瘤的各种基 础或临床研究提供可靠的实验材料。

2、本发明的自组装多肽在水相离子环境或生理盐溶液中触发形成三维支架 材料凝胶，这种凝胶具有以下优点：①黏弹性好；②易于运输，可通过注射技 术运送至靶位点；③降解性好，生物利用度高，降解产物为氨基酸单体，可作 为生物体营养物质的来源；④对细胞或组织无毒副反应及免疫反应；⑤具有良 好的表面活性、结构相容性及生物相容性。

附图说明

图1是本发明实施例1的自组装多肽所形成的水凝胶外观形态图。

图2是肿瘤细胞在实施例1的水凝胶中所形成的多细胞球体外观形态图； 其中，A-乳腺癌细胞SK-BR-3在水凝胶中形成多细胞球体，B-转染GFP基因的 293细胞在水凝胶中形成多细胞球体(荧光下拍摄)，C-脑神经瘤细胞Neuro-2a 在水凝胶中形成多细胞球体。

图3是肿瘤细胞在实施例2的水凝胶中所形成的多细胞球体外观形态图； 其中，A-乳腺癌细胞SK-BR-3在水凝胶中形成多细胞球体，B-转染GFP基因的 293细胞在水凝胶中形成多细胞球体(荧光下拍摄)，C-脑神经瘤细胞Neuro-2a 在水凝胶中形成多细胞球体。

图4是肿瘤细胞在实施例3的水凝胶中所形成的多细胞球体外观形态图； 其中，A-乳腺癌细胞SK-BR-3在水凝胶中形成的多细胞球体，B-在水凝胶中形 成的多细胞球体(荧光下拍摄)，C-脑神经瘤Neuro-2a在水凝胶中形成的多细胞 球体。

图5是肿瘤细胞在实施例4的水凝胶中所形成的多细胞球体外观形态图； 其中，A-乳腺癌细胞SK-BR-3在水凝胶中形成的多细胞球体，B转染GFP基因 的293细胞在水凝胶中形成的多细胞球体(荧光下拍摄)，C-脑神经瘤Neuro-2a 在水凝胶中形成的多细胞球体。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

应用本发明的自组装多肽促进肿瘤细胞形成多细胞球体的方法，包括以下 步骤：

(1)按照文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的 固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562)方法合成多肽 VVVVVV-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO.16)。

(2)将步骤(1)的多肽冻干粉末用去离子水溶解(多肽浓度1％)，多肽 随即形成水凝胶溶液，再用22um的滤膜过滤除菌。

(3)将多肽水凝胶溶液超声30分钟，如果有气泡产生，可离心1000rpm， 5min，将气泡去除。

(4)肿瘤细胞(转染GFP(绿色荧光蛋白)基因的293细胞(购自美国 Cell Biolabs Inc.公司，下同)、乳腺癌细胞SK-BR-3(购自上海研晶生物科技有 限公司，下同)和脑神经瘤细胞Neuro-2a(购自上海拜力生物科技有限公司， 下同))，离心去除培养基，用10％无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离心，去除上 清，再加入10％无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液(细胞密度为1×10⁶cells/ml)。

(5)用10％无菌蔗糖溶液将多肽水凝胶溶液稀释到0.5％浓度。

(6)将细胞悬液与稀释好的多肽水凝胶溶液快速混匀后，加入培养板孔中， 然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基(RPMI Medium 1640培养基，购买于 Invitrogen公司)。

(7)在培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜 的培养基，放回培养箱。

(8)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。

(9)最后置于37℃，5％CO₂培养箱中，静置培养。隔日检查细胞生长情 况与培养基颜色，及时换液。

培养一周后，肿瘤细胞在水凝胶中培养逐渐形成多细胞球体(见图2，图2 采用LEICA DMI 3000B倒置显微镜拍摄)，该多细胞球体可以模拟肿瘤细胞在 体内生长的三维环境。

实施例2

应用本发明的自组装多肽促进肿瘤细胞形成多细胞球体的方法，包括以下 步骤：

(1)按照文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的 固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562)方法合成多肽 FFFFFF-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO.17)。

(2)将步骤(1)的多肽冻干粉末用去离子水溶解(多肽浓度1％)，多肽 随即形成水凝胶溶液，再用22um的滤膜过滤除菌。

(3)将多肽水凝胶溶液超声30分钟，如果有气泡产生，可离心1000rpm， 5min，将气泡去除。

(4)肿瘤细胞(转染GFP基因的293细胞、乳腺癌细胞SK-BR-3和脑神 经瘤细胞Neuro-2a)，离心去除培养基，用10％无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离 心，去除上清，再加入10％无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液(细胞密度为1×10⁶cells/ml)。

(5)用10％无菌蔗糖溶液将多肽水凝胶溶液稀释到0.5％浓度。

(6)将细胞悬液与稀释好的多肽水凝胶溶液快速混匀后，加入培养板孔中， 然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基(RPMI Medium 1640培养基，购买于 Invitrogen公司)。

(7)在培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜 的培养基，放回培养箱。

(8)再静置30min，然后重复步骤(7)的操作。

(9)最后置于37℃，5％CO₂培养箱中，静置培养。隔日检查细胞生长情 况与培养基颜色，及时换液。

培养一周后，肿瘤细胞在水凝胶中培养逐渐形成多细胞球体(见图3，图3 采用LEICA DMI 3000B倒置显微镜拍摄)，该多细胞球体可以模拟肿瘤细胞在 体内生长的三维环境。

实施例3

应用本发明的自组装多肽促进肿瘤细胞形成多细胞球体的方法，包括以下 步骤：

(1)按照文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的 固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562)的方法合成多肽 PPGPPGPPG-YRGDSPRGDS(SEQ ID NO.18)。

(2)将步骤(1)的多肽冻干粉末用去离子水溶解(多肽浓度1％)，多肽 随即形成水凝胶溶液，再用22um的滤膜过滤除菌。

(3)多肽水凝胶溶液使用前超声30分钟，如果有气泡产生，可离心 1000rpm，5min，将气泡去除。

(4)用10％无菌蔗糖溶液将多肽水凝胶溶液稀释到0.5％浓度。

(5)将多肽水凝胶溶液加入培养板孔中(这个过程不要产生气泡)，然后 沿着培养板孔壁缓慢加入培养基(RPMI Medium 1640培养基，购买于Invitrogen 公司)。

(6)将步骤(5)的培养板在培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培 养基，再重新补加新鲜的培养基，放回培养箱。

(7)再静置30min，重复step(6)步骤。

(8)将肿瘤细胞(转染GFP基因的293细胞、乳腺癌细胞SK-BR-3和脑 神经瘤细胞Neuro-2a)消化后用培养基(RPMI Medium 1640，购买于Invitrogen 公司)调整为适合的浓度(5×10⁴cells/cm²)，取200-300ul细胞悬液沿孔壁缓慢 加入胶体上。

(9)最后置于37℃，5％CO₂培养箱中，静置培养。隔日检查细胞生长情 况与培养基颜色，及时换液。

培养10天后，肿瘤细胞逐渐迁移进水凝胶并形成多细胞球体(见图4，图 4A、4C采用LEICADMI 3000B倒置显微镜拍摄，图4B采用Olympus 1X71倒 置显微镜拍摄)，该多细胞球体可以模拟肿瘤细胞在体内生长的三维环境。

实施例4

应用本发明的自组装多肽促进肿瘤细胞形成多细胞球体的方法，包括以下 步骤：

(1)按照文献(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鳖甲抗肝纤维化活性多肽的 固相合成.医药导报.2011，30(5)：561-562)的方法合成多肽 FYGFYGFYG-YRGDSPRGDS(SEQ ID NO.19)。

(2)将步骤(1)的多肽冻干粉末用去离子水溶解(多肽浓度1％)，多肽 随即形成水凝胶溶液，再用22um的滤膜过滤除菌。

(3)多肽水凝胶溶液使用前超声30分钟，如果有气泡产生，可离心 1000rpm，5min，将气泡去除。

(4)用10％无菌蔗糖溶液将多肽水凝胶溶液稀释到0.5％浓度。

(5)将多肽水凝胶溶液加入培养板孔中(这个过程不要产生气泡)，然后 沿着培养板孔壁缓慢加入培养基(RPMI Medium 1640培养基，购买于Invitrogen 公司)。

(6)将步骤(5)的培养板在培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培 养基，再重新补加新鲜的培养基，放回培养箱。

(7)再静置30min，重复step(6)步骤。

(8)将肿瘤细胞(转染GFP基因的293细胞、乳腺癌细胞SK-BR-3和脑 神经瘤细胞Neuro-2a)消化后用培养基(RPMI Medium 1640，购买于Invitrogen 公司)调整为适合的浓度(5×10⁴cells/cm²)，取200-300ul细胞悬液沿孔壁缓慢 加入胶体上。

(9)最后置于37℃，5％CO₂培养箱中，静置培养。隔日检查细胞生长情 况与培养基颜色，及时换液。

培养10天后，肿瘤细胞逐渐迁移进水凝胶并形成多细胞球体(见图5，图 5A、5C采用LEICADMI 3000B倒置显微镜拍摄，图5B采用Olympus 1X71倒 置显微镜拍摄)，该多细胞球体可以模拟肿瘤细胞在体内生长的三维环境。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。