全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法及其用途

摘要

全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法及其用途本发明涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。所述新方法能在全基因组范围内更精确、更敏感地定位染色质转录调控区。这种方法可以用来寻找真核细胞转录调控的染色质区域，是功能基因组研究的有效手段。

说明书

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。

背景技术

染色质是真核细胞遗传信息的载体，它的高级结构是以核小体为基本结构单位的一级结构经过进一步的盘绕、折叠而形成。真核基因的表达调控与核小体的定位及染色质的空间结构密切相关，研究染色质的结构及其在基因表达调控中的作用，对于揭示真核生物基因表达调控的机理有重要意义[1-3]。真核基因的表达调控主要发生在转录过程中，转录因子(TF)与靶基因调控区的启动子、增强子、沉默子等顺式作用元件(cis-acting elemeat)相互作用，引起染色质构象变化并影响聚合酶作用，从而调节基因表达的强度，控制靶基因的时空特异性表达[4]。鉴别转录因子结合的靶基因调控区，确定转录因子与靶基因间的调控关系是理解转录调控机制的核心问题[5，6]。。

染色质上的DNase I高敏感位点(DNase I hypersensitive sites，DHSs)区域可以反映大段染色质的密集程度，而高敏感区域通常是潜在的转录调控区或与染色质变构相关的调控元件结合的区域，这些区域的重要特点是无核小体结合，已经证实活性染色质DHSs区包括核小体空缺区(NFR)[7-10]。真核生物基因组DNA序列本身为我们鉴别转录因子结合的靶基因提供了比较少的信息。然而，DNase I高敏感位点(DHSs)可以作为特殊标志，帮助我们识别染色质上特定基因的调控序列-顺式反应元件，为研究转录因子与结合位点间的相互作用、以及各种活性基因的顺式反应元件在染色质上的分布特征提供有力的支持[11，12]。随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，Crawford等人将DNase I高敏感位点检测与生物芯片和高通量测序技术相结合，开发了DNase-Chip[13]和DNase-seq技术[14]。两种技术都是先将活性染色质的DNase I酶切产物进行纯化，构建全基因组DHSs文库；然后将富集得到的DNA片段与芯片杂交或进行高通量测序。通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内转录因子的靶基因分布情况信息。活性染色质在合适浓度的DNase I酶切反应后得到大量的DNA片段，其中长片段产物占了很大的比例。而目前高通量单端测序的读长一般为20-75bp，DNase I酶切产物中的长片段DNA不能直接用于高通量测序，还需要进一步酶切或超声打断成短片段然后进行相应的PCR扩增构建文库。本研究以人HeLaS3细胞为模型，应用本发明全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，选择活性染色质上DNase I(10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建的DHSs文库，可以直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质高敏感位点区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域、染色质变构相关的调控元件结合区域的研究提供新的方法。可以用来研究真核细胞转录调控的染色质区域，为基因组学研究提供了一个有效方法。

发明内容

本发明提供一种全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。

本发明中使用的细胞HeLa S3是本领域技术人员熟知的人宫颈癌细胞系。在优选的实施方案中，使用的工具酶是脱氧核糖核酸酶I(DNase I)。最优选的方法是本发明中的采用DNaseI酶切细胞核内染色质得到的100-300bp的短DNA片段构建文库的方法，以及通过该方法构建的HeLa S3细胞活性染色质DHSs文库。

本发明涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法。它在基因组相关研究中有潜在的用途。

附图表说明

图1为DNase I酶切细胞核染色质DNA琼脂糖凝胶电泳

Mr1 1kb DNA ladder

Mr2 100bp DNA ladder

1、DNase I酶切的基因组DNA

2、10U/ml DNase I酶切的细胞核DNA

3、5U/ml DNase I酶切的细胞核DNA

4、无DNase I酶切的细胞核DNA.

图2为DHSs文库DNA加PE接头电泳图

Mr 100bp DNA Ladder

1-4DHSs文库DNA加PE接头

图3为PE接头引物PCR扩增DHSs文库DNA电泳图

Mr 100bp DNA Ladder

1、DHSs文库未加PE接头对照

2-4加PE接头的DHSs文库

5、PCR无引物阴性对照

6、PCR无模板阴性对照

图4为DHSs文库验证PCR电泳图

Mr 100bp DNA Ladder

1-5DHSs文库DNA PCR产物1、N8引物2、N9引物3、S10引物4、S115、S12引物6-10无PE接头DHSs文库DNA PCR产物6、N8引物7、N9引物8、S10引物9、S11引物10、S12引物

11、PCR无引物阴性对照

12、PCR无模板阴性对照

图5为全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法

A.DNase I酶切染色质转录调控区示意图

B.全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法示意图

图6为胶回收DNase I酶切100-300bp DNA电泳图

Mr 100bP DNA Ladder

1-3 DNase I酶切100-300bp DNA

图7为高通量测序结果进行生物信息学分析流程

图8为Peak在基因功能元件上的分布特征比较

图9为Peak相关基因GO功能聚类分析比较

图10为三个样品与peak相关基因进行差异分析文氏图

图11为Peak特有基因Reads在基因功能元件上的分布特征

图12为Real time PCR验证DHSs文库构建方法特异性

具体实施方式

在本发明的具体实施方案中，以人HeLaS3细胞为模型，应用本发明的全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，捕捉活性染色质经DNase I(10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建DHSs文库，直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质高敏感位点区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域、染色质变构相关的调控元件结合区域的研究建立了新的方法。

通过多聚酶链式反应(PCR)对DHSs文库构建方法进行了可靠性验证。将活性染色质经DNase I(10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建的DHSs文库，送华大基因公司，Illumina公司的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)进行高通量测序。通过高通量测序获得HeLaS3细胞染色质高敏感位点相关序列14284385条(Reads)，其中有10505670条高质量序列能精确比对到人类基因组上的唯一位置(Unique mapped reads)。利用本发明的方法构建的HeLa S3 DHSs文库捕捉到的Peak(Unique mapped reads富集区)通过全基因组信息统计和分布分析，在基因功能元件coding，5’UTR，upstream20k区的分布比例；Peak相关基因的GO功能聚类基因数量；HeLaS3 DHSs Reads在全基因组不同染色体上的分布比例等方面的指标均优于发表在UCSC网站(http://genome.ucsc.Edu/cgi-bin/hgTrackUi？Db＝hg19&g＝wgEncodeUwDNase)上的两个独立HeLaS3细胞全基因组DHSs分析结果(使用Crawford等人的文库构建方法构建文库)。进一步通过Real time PCR验证本发明捕获细胞活性染色质上DNase I酶切产物中100-300bp短DNA片段构建文库方法的特异性和灵敏性。

本发明所述全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，包括DNase I酶切细胞核中染色质DNA、DNase I酶切基因组DNA、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、琼脂糖凝胶回收、PCR反应等6个步骤。

以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式，而不是以任何方式限定本申请的范围。

实施例1

步骤一、裂解细胞，提取细胞核

培养HeLa S3细胞生长达80％融合后换无血清培养基，血清饥饿24小时[15，16]后，弃培养液。用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加1ml PBS在冰上用细胞刮刮细胞，4℃，3000rpm离心3分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并对细胞进行计数。再次离心收集细胞。加入含0.2％NP-40的RSB裂解液，轻柔混匀，使细胞终浓度为5×10⁶/ml，冰浴10分钟。4℃，3000rpm离心10分钟，收集细胞核。用无NP40的RSB缓冲液洗涤细胞核，洗去多余的NP40，4℃，3000rpm离心10分钟。上述实验均4℃完成。

步骤二、DNase I酶切细胞核中染色质DNA

1、将细胞核悬浮于1×DNase I消化缓冲液中，使其终体积为400μl。加入DNase I(5U/ml、10U/ml、20U/ml)，37℃反应10min，EDTA灭活。同时做无DNase I酶切的对照。

2、基因组DNA纯化(酚/氯仿抽提，乙醇沉淀)

上述反应终止后，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，50℃反应过夜。加入等体积酚，冰上放置10min，10000rpm离心10min。取上清，加入等体积酚/氯仿(1∶1)，冰上放置10min，10000rpm离心10min。再次取上清，加入等体积氯仿，冰上放置10min，10000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1h以上，4℃，12000rpm离心15min，沉淀用70％乙醇洗一遍，室温放置待乙醇挥发干净后，加入50μl ddH₂O溶解，用紫外分光光度计检测DNA样品的浓度，DNA于-20℃保存备用。

步骤三、DNase I酶切基因组DNA

取纯化后的无DNase I酶切样品提取的基因组DNA，加1×DNase I消化缓冲液中，使其终体积为400μl。加入DNase I(10U/ml)，37℃反应10min，EDTA灭活。酶切产物乙醇沉淀回收，加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1h以上，4℃，12000rpm离心15min，沉淀用70％乙醇洗一遍，室温放置待乙醇挥发干净后，加入50μl ddH₂O溶解，用紫外分光光度计检测DNA样品的浓度，DNA于-20℃保存备用。作为DNase I酶切基因组DNA对照。

步骤四、胶回收DNase I酶切产物

1、配制1.5％琼脂糖凝胶

称取0.3g琼脂糖，加0.5×TBE 20ml，微波炉内融化，冷却至65℃，加入Goldview 0.7μl灌入制胶槽，避光室温放置30min。

2、电泳

用扩口枪头吸取DNA样品，包括：DNase I酶切的细胞核染色质DNA；未经DNase I酶切的细胞核染色质DNA对照；DNase I酶切的细胞基因组DNA对照，上样。5V/cm的电压，进行DNA琼脂糖胶分离，电泳结果如(图1)所示，切取100-300bp范围的片段，置于1.5ml EP管内。同时从胶上切取＞300bp的所有片段，置于1.5ml EP管内作为对照。

3、DNase I酶切产物的胶回收纯化

采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，称量胶重量，加入3倍体积QG结合液，55℃，10min将胶融化；将试剂盒中的硅胶膜型离心纯化管柱放入2ml的收集管；将样品分次转移至离心管柱中，13,000×g离心1min；弃去离心得到的液体，再将柱子放回原收集管；在柱内加入750μl PE buffer，13,000×g离心1min洗涤柱子；弃去离心得到的液体，再将柱子放回原收集管，13,000×g离心2min，尽量除去残余的乙醇；将离心管柱放入1.5ml的干净Eppendorf管中；在柱子中央加入60μl H₂O，静置2min，13,000×g离心1min洗脱DNA。

步骤五、DHSs文库扩增

1、DNase I酶切产物末端修复

混匀上述反应物，20℃，30min。加ddH₂O，将反应液体积补足至500μl，酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀(方法同上)，用42μl ddH₂O溶解DNA。

2、DNA片段3’末端加A

37℃，温浴30min。75℃，灭活2min。

3、加接头，用于DHSs文库扩增

16℃水浴，连接过夜。此步骤，做不加接头的对照。反应结束，加ddH₂O，将反应液体积补足至500μl，酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀(方法同上)，用35μl ddH₂O溶解DNA。

4、胶回收加接头DNA样品

配制1.5％琼脂糖凝胶，上样，电泳，电泳结果如(图2)所示。从胶上切取150-350bp的DNA片段，采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit回收DNA样品(方法同上)。

5、DHSs文库扩增

94℃，3min预变性；94℃，30sec；64℃，30sec；72℃，30sec；30次循环；72℃，10min；4℃。取10μl PCR产物，加6×上样缓冲液，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图3)所示。

步骤六、DHSs文库的验证

选取五对引物对DNase I文库实验操作进行可靠性验证。选取随机引物2对(N8，N9)和具有DNase I高敏感区域的2对引物(S10，S11)以及本实验室筛选到的一对egfr启动子区的DNase I高敏感区域的引物(S12)进行验证。以不加接头的样品为对照。取10μl PCR产物，加6×上样缓冲液，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图4)所示。PCR引物及接头序列如表1所示。

表1PCR引物及接头序列

  Primer  Sequence(5’→3’)  PE adapter1-s  ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT  PE adapter1-as  GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-NH2  PE adapter2-s  CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT  PE adapter2-as  GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG-NH2  PE primer1  ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT  PE primer2  CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT  N8 primer1  CCAGCATTGGCACCATACCTACC  N8 primer2  CCTCCATAACAGGCACTGATAACACTT

  N9 primer1  GGAAAGAGCAGGAGAAAGGGAATCTTGG  N9 primer2  CTCGTTTGTTCCCACAAGCTGAAGAGAC  S10 primer1  CTCTGACGTAGTGTGACCTTGCTCAT  S10 primer2  CCAACAGTCCTAGCAGAGCTGAATT  S11 primer1  GCTCTTTGCATCGCTCTCTGTCGG  S11 primer2  TTACCGCTCCGCGTAAGTGCGAAG  S12 primer1  AGAAGGAACAGTGGGGATGGGGT  S12 primer2  GTTTCCCCGTCGGTGCCATTAT

实施例2

步骤一、DHSs文库高通量测序

1、测序样品的制备

DHSs文库制备方法同上如(图5A，B)所示，提取HeLaS3细胞核；DNase I(10U/ml)酶切；酚/氯仿抽提，乙醇沉淀；1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如(图6)所示，胶回收DNaseI酶切中100-300bp的短DNA片段；用NanoDrop1000分光光度计测定胶回收产物浓度为30ng/μl，260/280比值为2.1。将样品送华大基因公司，Illumina公司的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)进行高通量测序，。无DNaseI酶切对照样品，和DNaseI酶切的裸基因组对照样品保存备用。

2、高通量测序结果进行生物信息学分析

对测序结果进行图像识别，去污染，去接头；将clean data与人类基因组序列进行比对，允许不超过2个碱基的错配，其中比对到基因组上唯一位置的reads(Unique mapped reads)将用于后续的信息分析。比对软件：eland，参考序列：HUMAN_refseq_eland，参考基因组版本：hg18。将测序结果与参考基因组比对，比对得到唯一位置的序列用于后续标准信息分析。信息分析流程如(图7)所示。高通量测序共检测到2343479个测序标签(sequence tags)，与人类基因组序列进行比对的结果包括read长度和read数量，数据产量，见表2。

表2高通量测序基本生物信息学分析

表中Mapped reads代表比对结果中，能map到基因组的reads数目；Unique mapped reads代表比对结果中，能map到基因组唯一位置的reads数目；Mapped rate代表Mapped reads与total reads的比值；Unique mappedrate代表Unique mapped reads与total reads的比值。

3、使用UCSC已知信息对Sequencing数据进行注释，计算外显子、内含子和保守非编码区域占Sequencing全部数据的比例，并与全基因组数据进行比较，得到Sequencing reads的分布信息，展现reads富集区与这些区域的相互关系如表3所示。富集程度＝(该区域中Sequencing碱基数/Sequencing碱基总数)/(全基因组中该区域的碱基数/全基因组碱基数))

表3比对reads在全基因组上的分布比例

Genome-wide为参考序列的相关信息。Coding exons指的是全部的外显子或比例，或是指被翻译的外显子的比例。

步骤二、全基因组Peak扫描

基于一定的分析模型在全基因范围进行Peak(Unique mapped reads富集区域)扫描，得到Peak在基因组上的位置信息、peak区域序列信息等。Peak在全基因组上的分布可以代表与DHSs相关的基因位置信息。具体方法：将基因组上的候选Peak区延伸，得到一定长度的建模区域，根据此区域中所有Unique mapped reads的情况，使用Poisson分布模型进行检验，计算候选Peak区域的p-value，若p-value＜10e-04，则认为该区域是一个Peak。分析软件：MACS 1.4.0，Peak扫描分析结果见表4。

表4Peak信息统计结果

步骤三、Peak在基因功能元件上的分布特征

Peak在全基因组上的分布可以代表与DHSs相关的基因位置信息。全基因组上Peak的分布情况，包括：intergenic，intron，downstream20K，upstream20K，coding，5’UTR，3’UTR等不同基因功能元件的分布特征。以发表在UCSC网站(http://genome.ucsc.Edu/cgi-bin/hgTrackUi？Db＝hg19&g＝wgEncodeUwDNase)，两个独立的HeLaS3细胞DHSs分析(使用Crawford等人的文库构建方法构建文库)中peak分布为对照，分析了本发明捕获peak在不同基因功能元件的分布特征，其中peak在coding，5’UTR，upstream20K区的分布比例明显高于两个对照样品中peak分布比例，如(图8)所示。

步骤四、Peak相关基因筛选与GO功能聚类分析

GO是一种整合性、统一化、动态开放实时更新的分类系统。它包括三大独立的本体(Ontology)：基因参与的生命过程(biological process)，所处的细胞组份和元件(cellularcomponent)及发挥的分子生物学功能(molecular function)。这三个ontology下面又可以独立出不同的亚层次，层层向下构成一个ontologies的树型分支结构。通过GO功能富集分析，可以知道peak相关基因涉及到哪些生物学功能的改变。图9中横轴代表GO项，左纵轴代表与GO相关的基因比例，右纵轴代表与GO相关的基因数量。结果显示Peak相关基因与GO相关基因比例三个样品相同，本发明捕获的Peak相关基因的GO相关基因数量比两个对照样品明显高。

步骤五、基于peak相关基因数量的差异分析

以发表在UCSC网站(http://genome.ucsc.Edu/cgi-bin/hgTrackUi？Db＝hg19&g＝wgEncodeUwDNase)，两个独立的HeLaS3细胞DHSs分析中Peak相关基因为对照，与本发明方法制备样品的peak相关基因进行差异分析，依据基因ID寻找出三个样品间的特有基因数与共有基因数。图10是三个样品与peak相关基因进行差异分析的文氏图，相关数据是各部分去重复后的Gene ID的数目。基于三个样品的Peak相关基因的差异分析中，本发明捕获的Peak相关基因与两个对照样品相比特有基因4600个，共有基因数约23506个。

步骤六、Peak特有基因Reads在基因功能元件上的分布特征

1、分析三个样品Peak特有基因Reads在基因功能元件上的分布特征，结果如(图11)所示，本发明方法制备样品的Peak特有基因Reads分布比例在upstream20K，coding，5’UTR，3’UTR区明显高于两个对照样品。提示我们的DHSs文库构建方法与两个对照相比，在upstream20K，coding，5’UTR，3’UTR区捕获了染色质上更多的与DHSs相关的基因。

2、Peak特有基因的GO功能聚类分析

将三个样品Peak特有基因进行GO功能聚类分析，结果如表5所示，样品的Peak特有基因GO功能聚类分析的分布与两个对照样品一致，GO功能聚类分析的基因数量显著高于两个对照样品，提示本发明捕获了染色质上更多的与DHSs相关的基因。

表5三个样品Peak相关基因的GO功能聚类分析

实施例3

PCR验证高通量测序结果

随机选取6个高通量测序检测到的DHSs，根据DHSs上下游序列设计引物，通过Real time PCR验证在HeLaS3细胞活性染色质上DNase I(10U/ml)酶切产物中，富集100-300bp短DNA片段构建文库的方法的灵敏性、特异性。

以DNase I酶切的HelaS3细胞核产物、无DNase I酶切的HelaS3细胞核产物、DNase I酶切的HelaS3细胞基因组DNA为模板，以上模板在纯化过程中又分为两组：100-300bp组和＞300bp组，模板浓度为10ng/μl。根据引物的Tm值选择合适的退火温度，进行PCR反应。每个反应3个重复，用2^-ΔCt方法[17，18]，以无DNase I酶切的HelaS3细胞核产物为模板扩增的Ct值为1，进行数据分析，分析结果如(图12)所示。

94℃，3min预变性；94℃，30sec；64℃，30sec；72℃，30sec；30次循环；72℃，10min；4℃。PCR引物及接头序列如表6所示。

表6Real-time PCR引物

实验结果证明，应用本发明全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，选择活性染色质上DNase I(10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建DHSs文库，具有较高的灵敏性、特异性。可以直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质高敏感位点区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域、染色质变构相关的调控元件结合区域的研究提供新的方法。

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