一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法

摘要

本发明公开了一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，将烟叶研磨成粉末，称取50mg，将其置于50mL离心管中，加入25mL甲醇溶液，将离心管置于超声波振动器中超声萃取10min，取2mL萃取液，经0.22μm滤膜过滤得到的清液，用超高效液相色谱进行分析，测定烟叶中茄尼醇含量，本发明具有提取方法简单，检测操作简便，灵敏度高，重现性好，能快速、准确地测定烟叶样品中茄尼醇的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用UPLC技术快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，属于液相色谱分析技术领域。 

背景技术

茄尼醇是一种无环四倍半萜醇，1956年首先从烤烟中提取并进行了结构鉴定。茄尼醇是一种天然化合物，广泛存在于哺乳动物、高等植物和微生物体内，尤其以烟草中含量最高。茄尼醇在生物化学中具有重要作用，具有非常强的吸收自由基的性能，本身可起到抗菌、消炎、止血抗溃疡作用和较强的抗癌活性，因此是药物合成的重要原料和泛醌类药物(如辅酶Q10、维生素K2和抗癌增效剂等)不可替代的关键中间体，具有极重要的医药开发价值。同时，茄尼醇作为烟草类脂组分中含量最高的组分，关于其对烟草品质和安全性影响的研究很早就引起了人们广泛的关注。烟草中的茄尼醇在烟草燃烧过程中，一部分直接转移到主流烟气中，一部分热解产生多种香气成分，有利于烟香味的改善，但另一方面，也会裂解产生多环芳烃(如致癌物PAHs)等有害物质，对烟草制品的安全性具有很大影响。 

目前，关于茄尼醇提取和纯化的研究比较成熟，多已形成专利。近年来，涉及茄尼醇的专利申请件有：201010523040.6号《一种超声 酶法辅助提取茄尼醇的方法》、200910234074.0号《一种高纯度茄尼醇的制备方法》、200810058493.9号《一种利用茄尼醇粗膏精制高纯度茄尼醇的方法》、200710034942.1号《从废次烟草中同时提取高纯天然烟碱和茄尼醇的方法》、200510104279.9号《从霉碎烟末中提取茄尼醇的预处理方法》、200410022233.8号《一种茄尼醇的精制方法》、93106316.7号《用霉烟或碎烟末提取茄尼醇的工艺方法》等。 

茄尼醇是长链半萜烯醇化合物，采用有机合成的手段制备非常困难，目前只能主要依靠从烟草中提取获得。因此，建立一种高效、精确的快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，对于烟叶中茄尼醇的提取纯化和烟叶安全性研究具有非常重要的现实意义。烟叶中的茄尼醇提取方法主要是溶剂萃取，常用的萃取方式有索氏提取、热回流萃取、机械震荡萃取、超声波萃取、超临界流体萃取和微波萃取等。烟叶中的茄尼醇测定方法主要有薄层扫描法、气相色谱法、液相色谱法和库仑滴定法等，其中薄层扫描法常用作定性研究为主，气相色谱法一般需要先对样品进行衍生化处理，步骤繁琐，库仑滴定法一般和薄层分离组合使用，步骤也较繁琐。液相色谱法是测定茄尼醇含量应用较多的一种方法，但多使用乙腈、甲醇、乙醇等两种以上的洗脱剂作为流动相，其与萃取液(丙酮、甲醇等有机溶剂)组成的差异，会对色谱峰形造成影响，影响定量的准确性。 

本发明采用分析速度更快、流动相用量更省的超高效液相色谱(UPLC)技术对茄尼醇进行分析，将常规液相色谱分析需要约20min才能完成的分析时间缩短为5min，大大节约了分析时间和有机试剂 用量；同时，方法对色谱的流动相组成等分析条件进行了优化，将烟草样品用甲醇溶液萃取过滤后，同样使用甲醇作为流动相，直接进行超高效液相色谱分离测定，在与标样进行比对保留时间定性的同时，采用比较标样和样品的质谱图的方式对分析方法共流出的干扰峰进行了检测和排除，建立了烟叶中茄尼醇含量的UPLC分析技术。实践证明，该方法操作简便、快速准确、灵敏度高，重现性好。目前尚无烟叶茄尼醇含量检测方法的技术专利申请。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术之不足，提供一种快速测定烟叶中茄尼醇含量的UPLC分析方法，该方法的提取方法简单，检测操作简便，灵敏度高，重现性好，能准确、快速地测定烟叶样品中茄尼醇的含量。 

实现本发明的技术方案是：一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，将烟叶研磨成粉末，称取50mg，将其置于50mL离心管中，加入25mL甲醇溶液，将离心管置于超声波振动器中超声萃取10min，取2mL萃取液，经0.22μm滤膜过滤得到的清液，用超高效液相色谱进行分析，测定烟叶中茄尼醇含量。 

本发明所述的一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，超高效液相色谱的分析条件为：ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱-二极管阵列检测器，配Empower 2色谱工作站，色谱柱型号：BEH C18，1.7μm，2.1mm×50mm，色谱柱流动相为100％ 甲醇等度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温30℃，进样量：2μL，检测波长为207nm，运行时间5min。 

本发明所述的一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，超高效液相色谱可串联有三重四级杆-飞行时间质谱。 

本发明所述的一种利用UPLC快速测定烟叶中茄尼醇含量的方法，三重四级杆-飞行时间质谱分析条件为：大气压化学电离源，正离子模式检测，电晕电流4μA，电晕针温度500℃，采样锥孔电压30V，提取锥孔电压4V，源温120℃，锥孔气流速50L/Hr，脱溶剂气流速800L/Hr，采用MS模式，全扫描质荷比范围为100-1000，扫描时间5min。 

本发明与现有技术相比，达到的有益效果： 

(1)建立了一个分析方法，此方法具有准确性、灵敏度高及重现性好等特点，可以快速检测烟叶中茄尼醇的含量。 

对茄尼醇标准溶液进行液相色谱分析，对峰面积(Y)与浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得回归方程Y＝2.11×104X+4.12×103，r²＝0.99924。实验结果表明，该方法在0.765～76.5μg/mL浓度范围内有良好的线性关系。以信噪比计算知茄尼醇的检测限为7.65ng/mL，远远低于实际烟草样品中茄尼醇的含量，说明本方法的灵敏度高； 

称取50.0000mg相同初烤烟叶的烟末样品10份，分成两组，每组5份。其中一组按照本发明的实验条件平行测定5次，计算方法的重复性；另外一组样品分别加入0.68mg的茄尼醇标准品，根据标样加入量、加标前后样品的测定量计算回收率。结果表明：茄尼醇的精密度测定 RSD％为2.62％，回收率为91.1％，说明本发明的方法准确性较高，重复性较好。 

(2)本发明前处理方法简单，对样品萃取和分析的流动相采用同一种溶剂，不会对色谱峰造成影响，定量更准确。 

(3)本发明分析方法采用了分析速度更快、流动相用量更省的超高效液相色谱技术，优化了流动相组成等分析条件，将常规液相色谱分析需要约15-20min才能完成的分析时间缩短为5min，大大节约了分析时间和有机试剂用量。 

(4)本发明方法对分析目标采用了超高效液相色谱和三重四级杆-飞行时间质谱进行准确(Q-TOF-MS)定性和定量，排除了共流出杂质的干扰。 

质谱比较定性法：采用定性能力强的三重四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF)对茄尼醇标准品和样品进行了分析。在大气压化学电离源(APCI)、正离子模式下，使用TOF-MS对茄尼醇标准品和样品进行分析，并比较了与二者对应的扣除各自基线背景的质谱图。由图可以看出，标准品和样品质谱图的特征离子峰一致，都是以m/z为613.57的离子峰为基峰，另外还存在丰度较低的m/z为631.58的离子峰。 

采用MassLynx 4.1软件对其分子式进行推测，得到m/z为613.57的离子峰的分子式为C₄₅H₇₃，是茄尼醇(C₄₅H₇₄O)失去一个H₂O分子的加氢离子峰([M-H₂O+H]⁺离子)，m/z为631.58的分子式为C₄₅H₇₅O，即茄尼醇分子的加氢离子([M+H]⁺离子)。可见在APCI正离子分析模式下，茄尼醇上的羟基并不稳定，大部分极易失水脱去， 形成脱水加氢离子峰，只有一小部分形成加氢离子峰。由实施例中的图(2)可以确定本发明的色谱分离条件可以使样品中的茄尼醇完全从基质中分离出来，未受到共流出杂质的干扰，本色谱条件分离效果良好。 

说明书附图 

图1：茄尼醇标准品(a)与烟样提取样品(b)的UPLC色谱图对比图。 

图2：茄尼醇标准品(a)与烟样提取样品(b)的质谱图对比图。 

具体实施方式

本发明通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本发明。 

实施例1 

不同类型烟草样品中茄尼醇含量的快速测定 

一、测定仪器和实施条件： 

1.1色谱仪器及条件：ACQUITYUPLC H-CLASS超高效液相色谱-二极管阵列检测器(PDA)，配Empower 2色谱工作站，UPLC-XEVO Q-TOF，美国Waters公司，配MassLynx 4.1质谱软件，色谱柱型号：BEH C18(1.7μm，2.1mm×50mm)，美国Waters公司制造，色谱柱流动相为100％甲醇等度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温30℃，进样量：2μL，检测波长为207nm，运行时间5min。 

1.2质谱条件：大气压化学电离源(APCI)，正离子模式检测，电晕电流4μA，电晕针温度500℃，采样锥孔电压30V，提取锥孔电压4V，源温120℃，锥孔气流速50L/Hr，脱溶剂气流速800L/Hr，采用MS模式，全扫描质荷比(m/z)范围为100-1000，扫描时间5min。 

1.3辅助类仪器：AB104-S型电子天平，感量0.0001g，瑞士Merrier Toledo公司；T701DH型超声波振荡器，德国Elma公司；KS多用调速摇床振荡器，北京科伟科技仪器有限公司；Milli-Q Element型超纯水系统，美国Millipore公司；0.22μm尼龙针式滤头。 

1.4试剂和样品：乙腈、甲醇、异丙醇为色谱纯，美国默克公司；丙酮、无水乙醇等为分析纯；茄尼醇对照品，纯度为90％，广州百灵威科技有限公司生产；烟叶样品采集于贵州省某产区。 

二、烟叶中茄尼醇含量的分析方法 

2.1样品制备 

将不同类型的初烤烟叶(共7份)、晾晒烟(共3份)和香料烟(共1份)的烟叶各自研磨成粉末，各称取50.0000mg，将其分别置于50mL离心管中，各加入25mL甲醇溶液，将离心管置于超声波振动器中超声萃取10min，取2mL萃取液，经0.22μm滤膜过滤，以清液进样分析。 

2.2茄尼醇标准曲线的制作 

准确称取5-10mg茄尼醇标准品，用甲醇溶解定容至浓度为150.00μg/mL的标准储备液，用甲醇稀释配制成浓度为0.765，1.53，3.825，7.65，15.30，30.60，76.50μg/mL的标准系列溶液。对茄尼醇标准溶液进行液相色谱分析，对峰面积(Y)与浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得回归方程Y＝2.11×104X+4.12×103，r²＝0.99924。实验结果表明，该方法在0.765～76.5μg/mL浓度范围内有良好的线性关系，以信噪比为3计算知茄尼醇的检测限为7.65ng/mL。 

2.3烟叶中茄尼醇的定性分析 

2.3.1色谱保留值定性 

色谱保留值定性法：在相同的色谱条件下，当流速为0.4mL/min，烟叶中分离谱图中组分的色谱保留时间和对应的茄尼醇标准品的保留时间一致，均为2.49min，且色谱柱压较低，利于组分分离，说明烟叶中对应时间的组分为茄尼醇，见附图1。 

2.3.2质谱比较定性 

质谱比较定性法：采用定性能力强的三重四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF)对茄尼醇标准品和样品进行了分析。在大气压化学电离源(APCI)、正离子模式下，使用TOF-MS对茄尼醇标准品和样品进行分析，并比较了与二者对应的扣除各自基线背景的质谱图。 

茄尼醇标准品(a)与烟样提取样品(b)的质谱图对比，标准品和样品质谱图的特征离子峰一致，都是以m/z为613.57的离子峰为基峰，另外还存在丰度较低的m/z为631.58的离子峰。 

2.4烟叶中茄尼醇的定量测定 

在前述定性分析的基础上，精确称取烟叶样品，提取、制备样品溶液，按1.1色谱条件，采用超高效液相色谱外标法定量，以茄尼醇标准品为相应外标物。三种不同类型烟叶样品中茄尼醇含量的检测结果见表1。 

表1三种不同类型烟叶样品中茄尼醇含量的测定结果 

实施例2 

方法的重复性、回收率及稳定性测定 

1.方法的重复性和回收率 

称取50.0000mg相同初烤烟叶的烟末样品10份，分成两组，每组5份。其中一组按照1.1、2.1的实验条件平行测定5次，计算方法的重复性，结果见表2。另外一组样品分别加入0.68mg的茄尼醇标准品，根据标样加入量、加标前后样品的测定量计算回收率，结果见表3。 

结果表明：茄尼醇的精密度测定RSD％为2.62％，回收率为91.1％。 

表2方法的重复性实验结果(n＝5) 

  样品号   样重(g)   茄尼醇含量(mg/g)   1   0.0502   14.42   2   0.0524   14.18   3   0.0515   13.76   4   0.0501   13.54   5   0.0505   14.25   平均值    14.03   RSD％    2.62

表3方法的回收率实验结果(n＝5) 

2.稳定性实验 

取同批次供试品溶液，按上述测定方法在0、1、4、8、12、24h分别测定1次，计算茄尼醇峰面积的RSD为0.6％，表明样品溶液在24h内稳定。