用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌MB4的质粒、培养基和转化方法

摘要

本发明公开了一种腾冲嗜热厌氧杆菌MB4(Thermoanaerobactertengcongensis MB4)的遗传转化方法。本发明还涉及用于该转化方法中的质粒、培养基、以及采用该转化方法筛选的Thermoanaerobactertengcongensis MB4转化子。另外，本发明还涉及上述质粒的构建方法。

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程和发酵工程领域，涉及一种细菌的遗传转 化方法，具体是关于腾冲嗜热厌氧杆菌MB4(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4，以下简称为T.tengcongensis MB4)的遗传转化方法。 本发明还涉及用于该转化方法中的质粒、培养基、以及采用该转化方法筛 选的转化子。另外，本发明还涉及上述质粒的构建方法。

背景技术

嗜热厌氧菌的生境与原始地球的高温无氧环境较为接近，对其环境适 应性机制和生理特征的研究对于研究生命进化乃至生命的起源都有重要 的意义。

T.tengcongensis MB4是从我国云南腾冲温泉中分离到的一株嗜热、厌 氧、革兰氏阴性、杆状真细菌，其可在50～80℃下生长，最适生长温度为 75℃(Xue等人，2001，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，51：1335-1341)。T.tengcongensis MB4也是我国自主完成 基因组测序的第一个微生物基因组，其基因组中大多数基因的功能已得到 注释(Bao等人，2002，Genome Res.，12：689-700)。基因组测序及基因 功能注释极大地促进了对T.tengcongensis MB4的研究，目前已有60余篇 与T.tengcongensis MB4相关的研究得以发表(Zhang等人，2007，Archives of Biochemistry and Biophysics，466：211-220；Zhang等人，2010，Nucleic Acids Research，38：3709-3720；Qian等人，2010，J Bacteriol.，192： 4311-4316)。然而，纵观已发表的研究结果，可以发现相关的研究都集中 于T.tengcongensis MB4相关基因用大肠杆菌系统进行克隆、异源表达和 蛋白纯化，进而研究相关蛋白的体外生化功能。迄今为止，世界上还没有 T.tengcongensis MB4体内遗传学研究的任何报道，究其主因是因为到目前 为止还未能建立该菌株的遗传操作系统。实际上，只有从生理功能水平上 对相关蛋白进行研究才能揭示T.tengcongensis MB4环境适应的机制，这 也使得建立该菌的遗传操作系统是相当迫切和必要的。目前来看，以下几 方面问题的存在致使建立该菌遗传操作系统变得相当困难：1)T. tengcongensis MB4菌株本身不含内源性质粒，从而需要寻找或构建能在 T.tengcongensis MB4中自主复制的质粒；2)建立遗传操作系统往往采用 含有抗生素的环境来筛选转化子，但T.tengcongensis MB4的最适生长温 度为75℃，仅有少数几种抗生素能在此温度下不失活；3)只有极少数抗 生素抗性基因能在75℃下有效表达，也就使得筛选转化子的筛选标记相当 匮乏；4)培养T.tengcongensis MB4所需要的严格厌氧环境也进一步加大 了操作的难度。因此，要建立T.tengcongensis MB4的遗传操作系统就必 须克服上述问题，简而言之就是：构建能在T.tengcongensis MB4中复制 和表达抗生素抗性的质粒、设计将构建好的质粒转入细胞内的遗传转化方 法和转化子筛选条件。

对于转化方法而言，电击转化由于其制备感受态细胞简单和转化率高 的特点，对未知特性的菌株的转化来说一直都是首选的方法。但自然界也 存在自然感受态的菌株，如Thermus thermophilus HB27(Friedrich等人， 2001，Applied and Environmental Microbiology，67：3140-3148)和 Acinetobacter calcoaceticus(Juni等人，1969，J.Bacteriol.，98：281-288)， 这些菌株不需要特殊处理(如制备感受态和电击等)就能吸收体外环境中 质粒。这类菌株的自然感受态的存在大大地简便了转化过程。

综上所述，构建T.tengcongensis MB4遗传操作系统存在相当多的难 题，因此本领域中需要构建一种适宜的质粒以及使用该质粒遗传转化T. tengcongensis MB4的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌MB4(T. tengcongensis MB4)的质粒以及使用该质粒遗传转化T.tengcongensis MB4 的方法。另外，本发明中还构建了破坏T.tengcongensis MB4中组氨酸合 成操纵子中的hisG基因的质粒，并利用所建立的转化方法将该质粒转入 T.tengcongensis MB4中，并实现了对hisG基因的破坏。

因此，在本发明的第一个方面，提供了一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆 菌T.tengcongensis MB4的质粒(以下简称为“本发明的质粒”)，所述 质粒包含T.tengcongensis MB4的tte1482的启动子序列，以及与所述启动 子序列可操作地连接的具有编码热稳定性蛋白酶的抗生素抗性基因。

在本发明的质粒的一个实施方案中，所述质粒以质粒pHT3101为骨 架，并包含T.tengcongensis MB4染色体复制起点序列。在本发明的一个 优选实施方案中，该质粒为pBFL01。

在本发明的质粒的另一个实施方案中，本发明的质粒以质粒 pBluescript KSII+为骨架，并包含T.tengcongensis MB4染色体上hisG的 左右相邻的1.0～2.0kb DNA片段。在一个优选实施方案中，所述质粒用 于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌T.tengcongensis MB4中组氨酸合成操纵子中的 hisG基因，例如该质粒为pTTH01。

在本发明的质粒的一个优选实施方案中，所述抗生素抗性基因为卡那 霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因kan^R。

在第二个方面，本发明提供了一种用于转化T.tengcongensis MB4的 TTE培养基，所述TTE培养基的配方为以每升计包含下列成分：酵母浸 出物2.0～2.5g，蛋白胨2.5～7.5g，氯化钠1.5～3.0g，硫酸铵1.0～3.0g，磷酸 二氢钾0.1～0.5g，磷酸氢二钾0.1～0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.8g，可溶 性淀粉7.5～15g，1％刃天青溶液0.8～1.2ml，硫代硫酸钠0.3～0.8g，pH值 为7.5。

在第三个方面，本发明提供了一种转化T.tengcongensis MB4的方法 (以下简称为“本发明的转化方法”)，该方法包括以下步骤：

1)菌种活化：菌种活化：将保存于-70℃的腾冲嗜热厌氧杆菌T. tengcongensis MB4菌体悬液于60℃厌氧滚管培养60～72h；挑取较大的菌 落接入液体TTE培养基中，于75℃培养至OD₆₀₀为0.8～1.2。

2)菌体培养：在液体TTE培养基中以所述液体TTE培养基体积的 1～2％接种步骤1)中活化的密度为10⁶细胞/ml的T.tengcongensis MB4， 并在75℃下培养12～18h至菌体密度为1～2×10⁸细胞/ml；

3)菌体转化：用本发明的质粒对步骤2)中得到的培养物使用电击转 化法或自然感受态法进行转化获得转化子；

4)转化子筛选：将步骤3)中得到的转化子在400～600μg/ml，优选400 μg/ml含具有热稳定性的抗生素(所述抗生素与本发明的质粒中的抗生素 基因相对应，诸如卡那霉素)的固体TTE培养基在55～60℃，优选60℃ 下温育60～72h进行转化子筛选，在所述固体TTE培养基上生长的为T. tengcongensis MB4转化子。

在本发明的转化方法的一个优选实施方案中，当使用电击转化法时， 使用的电击电压为1.8～3.0kv，优选1.8kv；电击时间为：4～6ms。

在本发明的转化方法的另一个优选实施方案中，当使用自然感受态法 时无需厌氧设备来创造厌氧环境。

在第四个方面，本发明提供了T.tengcongensis MB4转化子，所述转 化子是通过本发明的转化方法产生和筛选的。

在本发明的转化株的一个优选实施方案中，所述转化株含有本发明的 质粒，例如含有质粒pTTH01或pBFL01。在一个实施方案中，该转化子 含有质粒pTTH01，并且其hisG基因已被破坏。

在本发明的转化子的另一个优选实施方案中，所述转化子为保藏号为 CGMCC4332的转化子，该转化子于11月15日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该转化子包含本发明的质粒 pTTH01。

本发明的有益效果如下：

1.建立了有效转化T.tengcongensis MB4的方法，并优化电击转化的 条件，在较低电压(如1.8kv)条件下转化效率最高。

2.建立了采用自然感受态转化法转化T.tengcongensis MB4的方法， 该法不需要特殊处理(如制备感受态和电击等)，且其转化效率不 低于电击转化效率。

3.构建了用于转化T.tengcongensis MB4的适宜质粒及其构建方法， 实现了T.tengcongensis MB4遗传转化和体内研究的突破。该质粒 pBFL01含有T.tengcongensis MB4的tte1482启动子(P_tte1482)、编 码热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶的基因(kan^R)、苏云 金芽孢杆菌复制起点(ori B.t)和T.tengcongensis MB4染色体复 制起点(ori Tte)的特征，其能有效地携带耐热抗生素抗性基因， 从而有利于转化子在高温下的筛选。

4.发明了用于本发明的转化方法的改良TTE培养基。

5.制备了用于破坏hisG基因的质粒，利用本发明的转化方法实现了 T.tengcongensis MB4中hisG基因的破坏。

附图说明

图1为T.tengcongensis MB4染色体复制原点(ori Tte)的序列表。

图2为T.tengcongensis MB4磷酸乙酰基转移酶启动子(P_tte1482)(下划 线部分)和卡那霉素抗性基因(Kan^R)(非下划线部分)的序列表。

图3为pHT3101的物理图谱。

图4为本发明的质粒pBFL01的构建示意图。

图5为本发明的质粒pBFL01的电泳图，其中质粒经EcoR I酶切。

图6为T.tengcongensis MB4的tte1482基因的启动子启动卡那霉素 抗性基因表达的验证结果，在图中，A：含有质粒pHT3101的E.coli JM109 在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上能生长；B：含有质粒 pHT3101的E.coli JM109在含有100μg/mL氨苄青霉素和卡那霉素的LB 培养基上不能生长；C：含有质粒pBFL01的E.coli JM109在含有100μg/mL 氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基上能生长。

图7为转化子筛选，在图中，A：质粒pBFL01转化T.tengcongensis MB4后在含有400μg/mL卡那霉素固体TTE培养基中有菌落出现；B：T. tengcongensis MB4在含有400μg/mL卡那霉素固体TTE培养基中无菌落 出现；C：T.tengcongensis MB4在不含400μg/mL卡那霉素固体TTE培养 基中形成菌膜。

图8为菌落PCR方法验证转化子(扩增卡那霉素抗性基因)，其中PCR 的模板分别为：1～12：转化子的总DNA，包括染色体和质粒DNA，13： T.tengcongensis MB4染色体DNA，14：Marker。

图9为显示本发明的转化方法中电击电压与转化效率的图。

图10为利用质粒pTTH01破坏hisG基因示意图。

图11为破坏T.tengcongensis MB4的hisG基因的验证结果，其中1，2， 3，4：hisG破坏菌株染色体作模板的PCR扩增结果；5：野生菌株染色体 作模板的PCR扩增结果；6：质粒pTTH01作模板的PCR扩增结果；7： 1kb ladder。

图12为SEQ ID：3-10的序列，SEQ ID No：3、SEQ ID No：4为进 行PCR扩增T.tengcongensis MB4染色体复制起点相关序列的上下游引 物；SEQ ID No：5、SEQ ID No：6为进行PCR扩增T.tengcongensis MB4 染色体上tte1482的启动子区域的上下游引物；SEQ ID No：7、SEQ ID No： 8为PCR扩增编码热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因(kan^R) 的上下游引物；SEQ ID No：9、SEQ ID No：100为PCR扩增SEQ ID No： 11的上下游引物。

图13为SEQ ID：11-13的序列，SEQ ID：11为T.tengcongensis MB4 染色体上包括hisG及该基因左侧基因的部分序列，即用于破坏hisG的左 端同源序列；SEQ ID：12、SEQ ID：13为PCR扩增SEQ ID No：14的上 下游引物。

图14为SEQ ID：14-16的序列，SEQ ID：14为T.tengcongensis MB4 染色体上包括hisG及该基因右侧基因的部分序列，即用于破坏hisG的右 端同源序列；SEQ ID：15、SEQ ID：16为验证hisG破坏株的上下游引物。

具体实施方式

在本发明的第一个方面，提供了一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌MB4 (T.tengcongensis MB4)的质粒(以下简称为“本发明的质粒”)，所述质 粒包含T.tengcongensis MB4的tte1482的启动子序列，以及与所述启动子 序列可操作地连接的具有编码热稳定性蛋白酶的抗生素抗性基因。

本发明中所述的具有热稳定性的抗生素是指能耐受60℃-75℃左右的 温度的抗生素。在本发明中，用于转化质粒中的抗生素基因不受限制，只 要其能够在适于质粒转化的转化子表达的条件下能够表达能耐受 60℃-75℃温度的抗生素，诸如卡那霉素、氯霉素等，因为只有耐受该温度 才能够达到筛选腾冲嗜热厌氧杆菌转化子的目的。

在本发明的质粒的另一个优选实施方案中，所述抗生素抗性基因为具 有热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因kan^R。由于在众多的抗生 素中，卡那霉素在较高的温度下能有效存在，这也使其成为用于嗜热菌研 究的常用抗生素；加之，与之相应的热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转 移酶基因(kan^R)也开发成功。卡那霉素及其相应的抗性基因也因此成为 研究嗜热菌的理想工具之一(Lasa等人，1992，Mol.Microbiol.，11： 1555-1564；Mather等人，1992，Appl.Environ.Microbiol.，58：421-425)。 同样，卡那霉素及其相应的抗性基因也可用于对T.tengcongensis MB4的 研究工作。

在本文中，“可操作地连接”是指与启动子序列连接的基因可以在适 于表达该基因的条件下表达。另外，根据需要本发明的质粒还可以任选地 包含调控序列以调节该基因的表达。

在本发明的质粒的一个实施方案中，所述质粒以质粒pHT3101为骨 架，并包含T.tengcongensis MB4染色体复制起点序列。在本发明的质粒 中，T.tengcongensis MB4染色体复制起点序列(ori Tte)见序列表中的SEQ ID No：1，T.tengcongensis MB4的tte1482的启动子序列见序列表中SEQ ID No：2中的划线部分。质粒pHT3101的物理图谱已公开，具体参见Yu等 人，2000，Current microbiology，40：123-127。

该质粒的构建方法可以采用以下方式进行：以质粒pHT3101为骨架， 将T.tengcongensis MB4染色体复制起点序列ori Tte插入质粒pHT3101多 克隆位点的EcoR I和Xba I位点之间，再将T.tengcongensis MB4的tte1482 的启动子Ptte1482和卡那霉素抗性基因kan^R构建的融合基因(见SEQ ID No：2)插入质粒pHT3101多克隆位点的Xba I和Pst I位点之间。

作为示例性的实施例，本发明提供了如上所述基于pHT3101构建的 质粒，即pBFL01。在本发明的一个优选实施方案中，还提供了质粒pBFL01 的具体构建步骤：

1)以T.tengcongensis MB4染色体为模板，SEQ ID No：3、SEQ ID No： 4分别为上下游引物进行PCR扩增T.tengcongensis MB4染色体复制起点 相关序列(见SEQ ID No：1)；2)用EcoR I和Xba I分别酶切所扩增的 PCR产物和质粒pHT3101，回收目的片段，将目的片段进行连接而得到质 粒pHT3101O；3)以T.tengcongensis MB4染色体为模板，SEQ ID No：5、 SEQ ID No：6分别为上下游引物进行PCR扩增T.tengcongensis MB4染色 体上tte1482的启动子区域；4)以质粒pMK18为模板，SEQ ID No：7、 SEQ ID No：8为引物扩增编码热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶 基因(kan^R)；5)以上述两个PCR产物为模板，SEQ ID No：5和SEQ ID No：8为上下游引物通过fusion PCR把上述的PCR产物融合成由tte1482 的启动子调控kan^R表达的基因(见SEQ ID No：2)；6)用Xba I和Pst I分别酶切质粒pHT3101O和融合PCR产物，回收目的片段，将两个目的 片段连接而得到能在T.tengcongensis MB4中进行复制和表达抗性基因的 质粒pBFL01。

在本发明的质粒的另一个实施方案中，本发明的质粒以质粒 pBluescript KSII+(购自Stratagene公司，La Jolla，.CA，USA))为骨架，并 包含T.tengcongensis MB4染色体上hisG的左右相邻的1.0～2.0kb DNA 片段，此段DNA的具体大小和片段以能够插入至质粒中并可以整合至T. tengcongensis MB4的基因组中为度，根据本发明的介绍其选择是显而易见 的。该质粒可用于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌T.tengcongensis MB4中组氨酸 合成操纵子中的hisG基因，例如该质粒为pTTH01，其构建方法可参见实 施例7。当然，根据本发明的介绍，本领域技术人员能够制备出各种其他 的质粒用于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌T.tengcongensis MB4中的其他目的基 因，诸如海藻糖磷酸化酶基因和海藻糖合成酶基因等与该菌的热适应性相 关基因。

在另一个方面，本发明提供了一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌T. tengcongensis MB4的TTE培养基，所述TTE培养基的配方为以每升计包 含下列成分：酵母浸出物2.0～2.5g，蛋白胨2.5～7.5g，氯化钠1.5～3.0g， 硫酸铵1.0～3.0g，磷酸二氢钾0.1～0.5g，磷酸氢二钾0.1～0.5g，L-半胱氨酸 盐酸盐0.2～0.8g，可溶性淀粉7.5～15g，1％刃天青溶液0.8～1.2ml，硫代硫 酸钠0.3～0.8g，pH值为7.5(具体参见实施例1)。

在实施本发明时，当TTE培养基以液体培养基使用时，通过如下示 例性的步骤制备(溶液总体积以一升计)：1)用适量去离子水将称量好的 酵母浸出物、蛋白胨、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾溶解； 2)将称量好的可溶性淀粉倾入少量的水中并搅拌成糊状后，缓慢地将淀粉 悬液倾入适量的沸水，并继续煮沸5～10分钟后，将淀粉溶液转移至1)所 配的溶液中；3)向上述溶液中加入1ml的1％刃天青溶液，并煮沸至溶液 成无色，将溶液移至无氧环境中，并冷却至60℃以下；4)加入0.5g L-半 胱氨酸盐酸盐并混匀，调pH值至7.5；5)在无氧的环境中，将溶液分装 至厌氧管或厌氧瓶中；6)灭菌(121℃、30min)后，备用。7)在接种之 前，加入50％硫代硫酸盐溶液至其终浓度为0.5wt％。

当本发明的TTE培养基以固体培养基使用时，通过如下示例性的步 骤制备：固体TTE培养基配制步骤与液体TTE培养基的配制步骤基本相 同，区别在液体TTE培养基分装之前，向厌氧管中加入Gelrite Gellum Gum 至终浓度为0.8％～1.2wt％，其它步骤同液体TTE培养基的配制。

在另一个方面，本发明提供了一种转化腾冲嗜热厌氧杆菌T. tengcongensis MB4的方法，该方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将保存于-70℃的T.tengcongensis MB4菌体悬液于60℃ 厌氧滚管培养60～72h；挑取较大的菌落接入液体TTE培养基中，于75℃ 培养至OD₆₀₀为0.8～1.2。

2)菌体培养：在液体TTE培养基中以所述液体TTE培养基体积的 1～2％接种步骤1)中活化的密度为10⁶细胞/ml的T.tengcongensis MB4， 并在75℃下培养12～18h至菌体密度为1～2×10⁸细胞/ml；

3)菌体转化：用本发明的质粒对步骤2)中得到的培养物使用电击转 化法或自然感受态法进行转化获得转化子；

4)转化子筛选：将步骤3)中得到的转化子在400～600μg/ml，优选400 μg/ml含具有热稳定性的抗生素的固体TTE培养基在55～60℃，优选60℃ 下温育60～72h进行转化子筛选，在所述固体TTE培养基上生长的为T. tengcongensis MB4转化子，其中所述具有热稳定性的抗生素与步骤3)中使 用的质粒所包含的抗生素抗性基因相对应，例如当质粒中含有卡那霉素氨 基糖苷磷酸转移酶基因kan^R时，则使用卡那霉素。

在本发明的转化方法中，T.tengcongensis MB4菌种活化的方法是本领 域中公知的，例如可以采用以下的具体步骤：将以20％甘油保存于-70℃ 的菌体悬液用无菌水稀释10⁴倍后，取100μL稀释液加入含有7ml融化后 固体TTE培养基的亨盖特厌氧管中并混匀后，亨盖特厌氧管中培养，于 60℃培养60～72h。挑取较大的菌落接入液体TTE培养基中，于75℃培养 至OD₆₀₀为0.8～1.2。

在本发明的转化方法的一个优选实施方案中，当使用电击转化法时， 使用的电击电压为1.8～3.0kv，优选1.8kv；电击时间为：4～6ms。在本发 明中，从下面的实施例5中可以看出，在较低的电击电压(如1.8kv)的 转化子数明显多于较高电压时的转化子数，即转化效率与电击电压成负相 关性。因此，优选1.8kv的电压来进行转化。

在本发明的转化方法的另一个优选实施方案中，当使用自然感受态法 时无需厌氧设备来创造厌氧环境。令人意外地，从实施例5中，发明人还 发现当不进行电击即电压为0kv时，转化子数最多，这表明T.tengcongensis MB4存在自然感受态的性质。因此提示，自然感受态的存在使得不需要制 备感受态，即实际上不需要电击转化，极大地方便了对T.tengcongensis MB4的转化。这是本发明的一个重要发现和一个有利的优点，其大大地简 化了T.tengcongensis MB4的转化。

另外，本发明还提供了T.tengcongensis MB4转化子，所述转化子是 通过本发明的转化方法产生和筛选的。

在本发明的转化子的一个优选实施方案中，所述转化子含有本发明的 质粒，例如实施例4中的质粒pBFL01，实施例7中的质粒pTTH01。hisG 破坏的菌株自身不能合成组氨酸，需要向培养基加入外源性组氨酸来满足 该菌的生长，即该破坏株为组氨酸营养缺陷株。组氨酸组氨酸营养缺陷可 作为筛选标记，可广泛用于T.tengcongensis MB4转化子的筛选。根据本 发明的方法和质粒筛选的一个转化子作为保藏号CGMCC4332保存，本发 明的质粒pTTH01已定点整合该转化子染色体上，并实现了hisG的破坏。

下面以具体的实施例进一步详细阐述本发明方法。要理解的是，下面 的实施例仅用于说明本发明，并非意在限制本发明的范围。另外，除特殊 说明外，本发明所涉及的原料和试剂都市售可得。

实施例1TTE培养基配方

本发明的TTE培养基的配方如表1中所示，表中的用量按每升的重量 计。

表1TTE培养基的基础配方(以每升计)

实施例2固体TTF培养基的配制

如下制备固体TTE培养基：1)用适量去离子水将称量好的酵母浸出 物、蛋白胨、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾溶解；2)将称量 好的可溶性淀粉倾入少量的水中并搅拌成糊状后，缓慢地将淀粉悬液倾入 适量的沸水，并继续煮沸5～10分钟后，将淀粉溶液转移至1)所配的溶液 中；3)向上述溶液中加入1ml的1％刃天青溶液，并煮沸至溶液成无色， 将溶液移至无氧环境中，并冷却至60℃以下；4)加入0.5g L-半胱氨酸盐 酸盐并混匀，调pH值至7.5；5)在无氧的环境中，将溶液分装至盛有Gelrite Gellum Gum(终浓度为0.8％～1.0wt％)厌氧管中；6)灭菌(121℃、30min) 后，备用。7)在接种之前，加入50％硫代硫酸盐溶液至其终浓度为0.5wt％。 T.实施例3液体TTE培养基的配制

如下步骤配制液体TTE培养基：1)用适量去离子水将称量好的酵母 浸出物、蛋白胨、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾溶解；2)将 称量好的可溶性淀粉倾入少量的水中并搅拌成糊状后，缓慢地将淀粉悬液 倾入适量的沸水，并继续煮沸5～10分钟后，将淀粉溶液转移至1)所配的 溶液中；3)向上述溶液中加入1ml的1％刃天青溶液，并煮沸至溶液成无 色，将溶液移至无氧环境中，并冷却至60℃以下；4)加入0.5g L-半胱氨 酸盐酸盐并混匀，调pH值至7.5；5)在无氧的环境中，将溶液分装至厌 氧管或厌氧瓶中；6)灭菌(121℃、30min)后，备用。7)在接种之前， 加入50％硫代硫酸盐溶液至其终浓度为0.5wt％。

实施例4质粒pBFL01的制备

用构建的质粒pBFL01转化E.coli JM109后，将菌悬液涂布于含有卡 那霉素和氨苄青霉素(终浓度均为100μg/ml)的固体LB培养基上，于 37℃培养12h，挑取菌落转接于含有卡那霉素和氨苄青霉素(终浓度均为 100μg/ml)的液体LB培养基中，37℃振荡培养物较为混浊。采用SDS碱 裂解法制备质粒DNA(分子克隆实验指南第三版，p26～30)的方法提取 质粒pBFL01。

实施例5T.tengcongensis MB4的转化(电击转化法)

以1％比例将活化后的T.tengcongensis MB4接种于100ml新鲜的液 体TTE培养基中，于75℃静置厌氧培养12～16h，离心收集菌体，用270 mM蔗糖溶液洗涤两次后，用1ml蔗糖溶液(270mM)重悬菌体，以100 μL将菌悬液转入电击转化杯中(0.2cm)，加入5μL实施例4制备的质粒 pBFL01(10ng/μL)后，分别以0kv、1.8kv、2.5kv和3.0kv电压进行转化。 电击后迅速向杯中加入0.5ml新鲜的液体TTE培养基，将电击杯中的菌 悬液转入盛有4ml新鲜的液体TTE培养基的厌氧管中，再向厌氧管中加 入50％Na₂SO₃溶液至其终浓度为0.5％。于60℃培养4～8h后，取0.5ml 转移至含有卡那霉素(400μg/mL)的固体TTE培养基中进行培养，于60℃ 培养60～72h后可得到转化子。得到转化子后，在含有400μg/mL卡那霉 素的固体TTE培养基上传代3次后，采用菌落PCR方法验证转化子。

挑取菌落接入含有400μg/mL卡那霉素的液体TTE培养基中进行培养 至菌悬液OD600为0.4～0.8，取1ml菌悬液，离心(10000rpm、2min)收 集菌体并用无菌水洗涤两次后，重悬于0.5ml水中，将菌体悬液与沸水中 温育20min后，离心(10000rpm、10min)。取2μL上清液做模板，以 SEQ ID No：5、SEQ ID No：6为上下游引物进行PCR扩增卡那霉素抗性 基因(约0.76kb)，扩增如图7所示，利用所挑选的菌落均能扩增质粒 pBFL01上的卡那霉素抗性基因，即所挑选的菌落均由转化子生长形成， 也表明本发明所发明的方法能将本发明所构建的质粒pBFL01转入T. tengcongensis MB4中，且本发明所构建的质粒pBFL01能在T. tengcongensis MB4中复制和正确表达。另外由图8可以看到，在较低的电 击电压(如1.8kv)的转化子数明显多于较高电压时的转化子数，即转化 效率与电击电压成负相关性。此外，值得注意的是不进行电击即电压为0kv 时，转化子数最多，这表明T.tengcongensis MB4存在自然感受态的性质。 自然感受态的存在使得不需要制备感受态，极大地方便了对T. tengcongensis MB4的转化。

实施例6T.tengcongensis MB4的转化(自然感受态转化法)

以1％比例将活化后的T.tengcongensis MB4接种于100ml新鲜的液 体TTE培养基中，于75℃静置培养12～16h，取等量的培养物(如4ml) 加入等量的新鲜的液体TTE培养基中，同时加入5μL实施例4制备的质 粒pBFL01(10ng/μL)和50％Na₂SO₃溶液至Na₂SO₃终浓度为0.5％。于 60℃培养4～8h后，取0.5ml转移至含有400μg/ml卡那霉素的固体TTE 培养基中进行培养，于60℃培养60～72h后可得到转化子。

实施例7利用自然感受态转化法破坏T.tengcongensis MB4的hisG基因

为了验证本发明所建立的遗传转化方法可用于T.tengcongensis MB4 的体内遗传操作，另外构建了用于破坏T.tengcongensis MB4的hisG基因 的质粒pTTH01。

首先，如下构建质粒pTTH01：

1)将T.tengcongensis MB4的tte1482的启动子Ptte1482和卡那霉素抗 性基因kan^R构建的融合基因插入质粒pBluescript KSII+的EcoR V位点上 (平末端连接)，得到质粒pTHA；2)以T.tengcongensis MB4染色体作模 板，SEQ ID No：9、SEQ ID No：10为引物扩增SEQ ID No：11后，将 SEQ ID No：11插入质粒pTHA的Not I、spe I位点间，得到质粒pTHB； 3)以T.tengcongensis MB4染色体作模板，SEQ ID No：12、SEQ ID No： 13为引物扩增SEQ ID No：14后，将SEQ ID No：14插入质粒pTHB的 Hind III、Xho I位点之间，得到用于破坏hisG的质粒pTTH01。

以1％比例将活化后的T.tengcongensis MB4接种于100ml新鲜的液 体TTE培养基中，于75℃静置培养12～16h，取等量的培养物(如4ml) 加入等量的新鲜的液体TTE培养基中，同时加入5μL质粒pTTH01(10 ng/μL)和50％Na₂SO₃溶液至Na₂SO₃终浓度为0.5％。于60℃培养4～8h 后，取0.5ml转移至含有400μg/ml卡那霉素的固体TTE培养基中进行培 养，于60℃培养60～72h后可得到转化子。挑取转化子菌落接入含有400 μg/mL卡那霉素的液体TTE培养基中进行培养至菌悬液OD600为0.8～1.0。 提取上述菌体的染色体作为PCR模板，以SEQ ID No：15、SEQ ID No： 16为引物进行PCR。原始菌株的染色体PCR扩增后会出现约3.7kb的目 的带，而hisG破坏菌株的染色体经PCR扩增及电泳会出现4.6kb条带。 PCR及电泳结果如图9所示，结果表明随机挑选的4个突变菌株均为hisG 被破坏的菌株。