利用微生物的肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗

摘要

本发明涉及一种肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗，特别是，通过肠内菌群变化来预防和治疗肥胖。本发明中确认，通过游离脂肪酸吸收能力改善的微生物制剂的摄取，并且利用小肠内细菌的特性改善和移植，能够减少在胃肠道内的脂肪酸吸收。本发明中基于这样的实验结果，提供了肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗方法、预防和治疗用药物组合物和功能性食品、以及能够以这样的目的使用的改良乳酸菌株。本发明具有与目前最广泛用作抗肥胖治疗剂的奥利司他相同水平的体重减少效果。本发明表示，通过小肠内细菌的特性改善和移植，阻断在胃肠道内的脂肪酸吸收，从而能够治疗肥胖。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗，特别是，利用微生物的预防和治疗。

背景技术

作为一种成全球性问题的慢性疾病，肥胖是无有效的治疗方法且具有继续增加趋势的严重疾病。此外，肥胖会引发其他多种严重的慢性疾病。肥胖所引起的代谢性疾病中，有如下疾病：高血压、糖尿病、高脂血症、动脉硬化症、缺血性心脏疾病、脂肪肝、胆石病、关节炎、肺功能障碍、生殖器异常等。

目前用作肥胖治疗剂的处方药是西布曲明(雅培的诺美婷)和奥利司他(罗氏的赛尼可)。西布曲明阻断去甲肾上腺素和羟色胺的再吸收，从而调节食欲，减少饮食物的摄取量。但是，西布曲明是作用于中枢神经系统的物质的这一特性，由此具有影响心跳和血压等的副作用。与西布曲明相反，奥利司他作用于局部。作为胃和小肠的脂肪分解酶脂肪酶(lipase)的抑制剂，奥利司他起着阻碍脂肪水解的作用，从而以饮食物方式摄取的脂肪的30％左右未向体内吸收且排出，由此具有体重调节效果。但是，未消化的脂肪沿着胃肠道(gastrointestinal track)移动的同时引发腹泻、脂肪泻这样的副作用，这些副作用不仅不舒服，而且难以进行正常社会生活的程度。因此，现有的肥胖治疗剂所具有的这样的问题，由此期待着新概念的肥胖治疗剂。

参考文献

1.B.S.Drew，A.F.Dixon，J.B.Dixon，Vasc.Health Risk Manag.3，817(2007)

2.P.G.Kopelman，Nature 404，635(2000)

3.Must et al.，J.Am.Med.Assoc.282，1523(1999)

4.R.Padwal，SK Li，DC Lau，Cochrane DatabaseSyst.Rev.3，CD004094(2003)

5.R.S.Padwal，S.R.Majumdar，Lancet 369，71(2007)

6.J.Rolls，D.J.Shide，M.L.Thorwart，J.S.Ulbrecht，Obes.Res.6，1(1998)

7.G.A.Bray etal.，Obes.Res.7，189(1999)

8.R.Guercolini，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.21，S12(1997)

9.J.B.Hauptman，F.S.Jeunet，D.Hartmann，Am.J.Clin.Nutr.55，309S(1992)

10.J.O.Hill，et al.，Am.J.Clin.Nutr.69，1108(1999)

11.R.E.Ley，P.J.Turnbaugh，S.Klein，J.I.Gordon，Nature 444，1022(2006)

12.P.J.Turnbaugh，R.E.Ley，M.A.Mahowald，V.Magrini，E.R.Mardis，J.I.Gordon，Nature 444，1027(2006)

13.P.J.Turnbaugh，F.Backhed，L.Fulton，J.I.Gordon，Cell Host Microbe 3，213(2008)

14.W.H.Lin，C.F.Hwang，et al.，Food Microb.23，74(2006)

15.Appl Environ Microbiol.59，15(1993)

16.R.Leenen et al.，Am.J.Physiol.263，E913(1992)

17.Y.Keno et al.，Int.J.Obes.15，205(1991)

18.Molavi，N.Rasouli，P.A.Kern，Curr.Opin.Cardiol.21，479(2006)

19.R.T Spiotta，G.B.Luma，Am.Fam.Physician78，1052(2008)

20.S.Rand，J.ChronicDis.40，911(1987)

21.National Heart Lung and Blood Institute，Obes.Res.6，51S(1998)

22.J.O.Hill，Endocr.Rev.27，750(2006)23.C.Thompson-Chagoyon，J.Maldonado，A.Gil，Dig.Dis.Sci.52，2069(2007)

23.C.Thompson-Chagoyon，J.Maldonado，A.Gil，Dig.Dis.Sci.52，2069(2007)

24.B.Stecher，W.D.Hardt，Trends.Microbiol.16，107(2008)

25.Isolauri，M.Kalliomaki，K.Laitinen，S.Salminen，Curr Pharm Des.14，1368(2008)

26.W.Jia，H.Li，L.Zao，J.K.Nicholson，Nature Rev.Drug Disc.7，123(2008)

发明内容

本发明人通过将肥胖老鼠和低体重老鼠的肠内菌群移植到无菌老鼠的实验，得到如下结论：变化胃肠道(GI track)内的菌群的组合时，从饮食物的热量摄取效率带来差异，由此导致体重的变化。根据该结果，即使胃肠道中的热量摄取效率稍微变化，体重也会意味深长地增加或减少。因此，本发明人鉴于最主要的热量摄取源、即脂肪在体内以游离脂肪酸的形态进行摄取的事实，如果在胃肠道内栖息可减少游离脂肪酸的微生物，该微生物就会去除体内吸收前的游离脂肪酸，因此能够从饮食物有效地减少脂肪摄取，这会降低热量摄取率，从而判断能成为肥胖治疗剂，并且通过实验来得到证明，从而完成了本发明。

本发明的目的在于，提供新的肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防治疗剂和预防治疗方法。特别是，本发明的目的在于，提供在体内去除脂肪分解物游离脂肪酸，从而减少从饮食物的脂肪摄取的方法以及用于该方法的药物组合物。此外，本发明的目的在于，提供消除了现有的肥胖治疗剂西布曲明或奥利司他的问题、即副作用的肥胖治疗剂。

本发明中，使通常乳酸菌嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)步骤性地进行突变，与通常乳酸菌相比，得到游离脂肪酸吸收能力改善的改良乳酸菌(脂肪酸掠夺微生物(fatty acid robbing microbe)，FARM)，并且实施了使老鼠一定期间摄取该改良乳酸菌并确认影响老鼠体脂肪蓄积和体重增加的效果，其结果可以确认，目前最广泛用作抗肥胖治疗剂的奥利司他(orlistat)相同水平的体重减少效果。即，本发明中确认了通过游离脂肪酸吸收能力改善的微生物制剂的摄取，并且利用小肠内细菌的特性改善和移植，能够减少在胃肠道内的脂肪酸吸收，这意味着利用本发明的微生物制剂和方法能够治疗肥胖。

本发明中，基于这样的实验结果，

提供一种用于肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗的药物组合物，其含有能够栖息于哺乳类胃肠道内且具有游离脂肪酸吸收能力的微生物作为有效成分。作为能够栖息于哺乳类胃肠道内且具有游离脂肪酸吸收能力的微生物，本发明中提供的药物组合物作为有效成分包含的微生物优选为构成人肠内菌群的微生物或者源自人肠道的微生物。进一步优选的是，上述微生物为乳酸菌。本发明的实施例中，作为游离脂肪酸的吸收能力增加的改良乳酸菌株，得到了嗜酸乳杆菌FARM1(KCTC 11513BP)、嗜酸乳杆菌FARM2(KCTC 11514BP)及嗜酸乳杆菌FARM3(KCTC11515BP)。

此外，本发明中，提供了一种用于预防和改善肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的功能性食品，其包含能够栖息于哺乳类胃肠道内且具有游离脂肪酸吸收能力的乳酸菌。本说明书中，作为除了食品原本目的以外添加了特定功能性的食品，功能性食品意指均包含保健食品、保健功能性食品等。本发明的功能性食品意指的功能性为肥胖预防和改善。

此外，本发明中提供了游离脂肪酸吸收能力改善的改良乳酸菌嗜酸乳杆菌FARM1(KCTC 11513BP)、嗜酸乳杆菌FARM2(KCTC 11514BP)及嗜酸乳杆菌FARM3(KCTC 11515BP)。

此外，本发明中提供一种肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗方法，其包含将微生物进行给药而减少在体内的游离脂肪酸吸收的方法，该微生物能够栖息于哺乳类胃肠道内且具有游离脂肪酸吸收能力。

根据本发明，将具有游离脂肪酸吸收能力的微生物进行给药或摄取时，能够在体内减少游离脂肪酸吸收，因此能够成为一种有效的肥胖及肥胖所引起的代谢性疾病的预防和治疗方法。

从饮食物中的热量过多摄取是在肥胖中最重要的决定因素，此外在不发达国家中肥胖也是最快增加的因素。大部分情况下，与体内热量消耗，相比热量摄取仅超过1％时，体脂肪会蓄积，结果这会引发肥胖。本发明的药物组合物将游离脂肪酸摄取能力改善的乳酸菌移植到宿主的小肠道内，从而限制宿主的热量摄取，带来抗肥胖效果，其程度是与最广泛用作抗肥胖治疗剂的奥利司他相似的水平。而且，与现有的肥胖治疗剂相比，含有具有游离脂肪酸吸收能力的微生物作为有效成分的本发明的药物组合物，具有如下非常优异的优点。第一，未作用于中枢神经系统，所以西布曲明这样作用于中枢神经系统的药物相比，具有非常优异的长期安全性。第二，未参与脂肪分解，所以在小肠道内不会引发腹泻或脂肪泻这样的副作用。第三，将乳酸菌等对人体有益的微生物作为有效成分，所以作为医药品原料，确保了非常优异的安全性。

此外，除了肥胖以外，肠菌群还与感染性疾病、癌、过敏疾病这样的多种复合疾病有关。因此，通过活菌移植的治疗具有能够适用于与肠内菌群相关的多种疾病中的可能性。本发明还具有如下意义：将游离脂肪酸摄取能力改善的肠内细菌移植到小肠道内，证明能够有效地变化宿主的肠菌群并治疗宿主的疾病，从而未来对于肠内菌群相关的多种疾病，开启了通过活菌移植的治疗可能性。

附图说明

图1：是测定了乳酸菌的脂肪酸吸收能力的结果。

图2：是乳酸菌定植(colonization)的宿主中测定热量摄取变化的结果。

图3：是测定了实验群的体重变化的结果。

图4：是用磁共振成像装置(MRI)测定实验群的内脏脂肪后，用图像分析程序(Image J，USA)进行分析的结果。

图5：是示出22周的高脂肪饲养群和FARM乳酸菌摄取群的内脏脂肪蓄积图像的图。

图6：是示出实验群的血脂浓度变化的图，其中，TG表示甘油三酯类：TC表示总胆固醇：HDL表示高密度脂蛋白胆固醇：LDL表示低密度脂蛋白胆固醇。

图7：是示出实验群的血液胰岛素和瘦素浓度变化的图。

图8：是示出实验群的血糖变化的图。

图9：是将FARM3乳酸菌的体外(in vitro)脂肪酸吸收能力与3179乳酸菌进行比较的图。

图10：是在FARM乳酸菌定植(colonization)的宿主中表示热量摄取减少的结果。

具体实施方式

游离脂肪酸的吸收能力增加的改良菌株

将存在于人体的一种乳酸菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)KCTC3179利用NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)处理而诱导突变后，找到了游离脂肪酸的吸收能力增加的改良乳酸菌菌株。与通常乳酸菌相比，该改良乳酸菌是从周围环境吸收游离脂肪酸的能力为2.1倍以上的菌株，命名为嗜酸乳杆菌FARM1(脂肪酸掠夺微生物1)，将其于2009年5月19日以委托号KCTC 11513BP委托在韩国生命工学研究院生物资源中心。本发明中将其简称为FARM1。并且，利用FARM1以4NQO(4-硝基喹啉1-氧化物)诱导2次突变，结果得到了游离脂肪酸的吸收能力非常增加的改良菌株FARM2，将其于2009年5月19以委托号KCTC11514BP委托在韩国生命工学研究院生物资源中心。本发明中将其简称为FARM2。根据放射性标记实验，与通常菌株相比，FARM2具有3.1倍以上迅速吸收游离脂肪酸的特性。

食用乳酸菌的最重要的特征是摄取后在宿主的小肠道内形成集群并成长的特性，即定植能力(colonization)。为了调查作为乳酸菌的特性，利用改良菌株FARM1和FARM2，调查在小肠道内的集群形成和成长能力。FARM1和FARM2在发酵为酸乳酪的过程中维持正常成长和酸化能力，在宿主中以酸乳酪形态摄取后，也在老鼠小肠道内成功地成为定植(colonization)。这样的结果表示脂肪酸吸收能力提高的FARM1和FARM2维持着乳酸菌的特性。

确认游离脂肪酸的吸收能力增加的乳酸菌去除小肠道的游离脂肪酸而实际上是否减少宿主的热量摄取

我们摄取乳酸菌时，乳酸菌在小肠暂时形成菌群，其中，小肠是在体内脂肪分解物脂肪酸主要被吸收的地方。在大部分的脂肪酸被摄取的小肠，FARM消耗游离脂肪酸时，这会减少可向人体吸收的游离脂肪酸，因此起着一种生物螯合剂(bio-sequestrant)的作用，这会减少宿主的热量摄取量。为了实验FARM去除小肠道的游离脂肪酸而是否实际上减少宿主的热量摄取，将用FARM菌株发酵的酸乳酪使老鼠摄取8周。确认FARM乳酸菌在老鼠小肠道内定植(colonization)后，供给放射性标记的三油酸甘油酯(triolein)后测定血清内的放射性值。其结果，表示总之放射性标记三油酸甘油酯的消化物、即放射性标记游离脂肪酸的吸收减少了多少。定植了(colonization)FARM的老鼠的情况下，表现出固着于胃肠道(GItrack)的改良菌株从周围摄取游离脂肪酸的能力显著提高，与此正比，宿主的游离脂肪酸摄取减少。定植了FARM1和FARM2的老鼠的情况下，能够发现通常用乳酸菌进行定植的老鼠相比，宿主的游离脂肪酸摄取分别减少35％和47％。这意味着如下结果：FARM1和FARM2在老鼠小肠道内减少可吸收的游离脂肪酸，从而总之减少向宿主摄取的饮食物热量值。

游离脂肪酸的吸收能力增加的小肠道内乳酸菌导致的热量摄取减少影响肥胖的效果

为了查看小肠道内的FARM导致的热量摄取减少影响肥胖的效果，将用FARM发酵的酸乳酪使肥胖老鼠摄取22周。通常每天摄取进行发酵而每1ml含10⁹CFU乳酸菌或FARM乳酸菌的酸乳酪3ml时，4周后在老鼠小肠道内乳酸菌会定植(colonization)。如预料的那样，与摄取了正常乳酸菌的老鼠比较，表现出摄取了FARM1和FARM2乳酸菌的老鼠的体重增加分别减少为15％和19％的效果。哺乳动物中，热量过多摄取会大部分以内脏脂肪的方式蓄积，所以体重增加与内脏脂肪增加两正比。因此，在乳酸菌供给实验结束日，利用开放型0.3 Tesla MRI(open-type 0.3 TeslaMRI)，并用MRI测定了老鼠的内脏脂肪。非处理对照群、摄取了通常乳酸菌的老鼠实验群、摄取了FARM1的老鼠实验群、摄取了FARM2的老鼠实验群的内脏脂肪量分别为27％、24％、14％、及13％。该结果意味着，FARM在宿主的小肠道内定植(colonization)时，FARM会减少小肠道内的游离脂肪酸吸收，总之具有阻断宿主的体重增加和体脂肪蓄积的效果。减少宿主的游离脂肪酸摄取/吸收量，从而根据热量摄取减少，会减少内脏脂肪和体重。

与代谢性综合症相关的血清内生化学分析

肥胖与胰岛素抵抗、葡萄糖耐性、高脂血症、心血管疾病等代谢性综合症(syndrome)密切相关密切。因此，在乳酸菌供给实验结束日进行了代谢性综合症相关的血清内生化学分析。完全未摄取乳酸菌的对照群和摄取了通常乳酸菌的老鼠中的TG、TC和LDL-胆固醇量在摄取了FARM1和FARM2的老鼠中相比高。相反，与预料的那样，HDL胆固醇值在对照群中较低，但是在FARM组中较高。表现出抗肥胖效果的FARM乳酸菌，与预料的那样在糖尿病也表现出了优异的效果。摄取FARM1和FARM2时，与完全未摄取乳酸菌的对照群相比，血清胰岛素值分别减少了23％和30％。血清瘦素(leptin)值也与完全未摄取乳酸菌的对照群相比，FARM1和FARM2分别减少了20％和45％。血清糖值也是完全未摄取乳酸菌的对照群和摄取了通常乳酸菌的老鼠的情况下，是122.1mg/dl和123.4mg/dl，与此相反，表现出摄取了FARM1和FARM2的老鼠中分别减少了107.6mg/dl和108.4mg/dl左右。随着体重的增加，人体对瘦素和胰岛素的灵敏度会减少的同时血脂谱会恶化，由此瘦素(leptin)、胰岛素、葡萄糖、LDL胆固醇、总胆固醇(total cholesterol)的血液中的浓度会增加。这样的结果表现，FARM乳酸菌阻断体重增加，从而在改善血脂谱并阻碍胰岛素和瘦素的耐性的方面非常有效。此外表现出，作为肥胖治疗剂，FARM乳酸菌具有优异的性质。

游离脂肪酸的吸收能力增加的乳酸菌的作为一种抗肥胖治疗剂的可能性

定植(colonization)FARM的老鼠会减少游离脂肪酸的摄取，其结果具有阻断体重增加和内脏脂肪蓄积的优异特性，所以实验了游离脂肪酸摄取能力改善的FARM乳酸菌的作为一种抗肥胖治疗剂的可能性。利用FARM2乳酸菌以EMS(乙基甲烷磺酸)进行3次突变，由此发掘出游离脂肪酸摄取能力更加提高的乳酸菌株。发掘的3次突变株FARM3与通常乳酸菌相比，作为游离脂肪酸摄取能力改善了5.0倍以上的菌株，命名为嗜酸乳杆菌FARM3(脂肪酸掠夺微生物3)，将其于2009年5月19日以委托号KCTC 11515BP委托在韩国生命工学研究院生物资源中心。本发明中将其简称为FARM3。将用FARM3发酵的酸乳酪对老鼠每天各3ml摄取4周时，与摄取通常乳酸菌的对照群相比，表现出体重减少18％以上的结果。这样的FARM3的体重减少程度与目前用作医药品的奥利司他相似的水平。并且，与奥利司他不同，FARM3的情况下，摄取时除了体重的有效地减少以外，没有表现出脂肪泻那样的副作用。这意味着，FARM3安全的同时是一种可开发作有效的肥胖治疗剂的医药品原料。本发明中，用乳酸菌FARM3进行了实验，但本发明的技术思想并不限于FARM3或乳酸菌。关于肥胖治疗的本发明的技术思想只要是能够栖息于哺乳类、特别是人胃肠道内且具有游离脂肪酸吸收能力的微生物，就均能适用，这是本领域技术人员众所周知的。

[实施例]

下面，通过具体实施例更详细说明本发明。但是，这些实施例只是为了更具体说明本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。

试剂

除了以下试剂以外，试剂是从西格玛(Sigma)购买后使用的。

[1-14C]-棕榈酸：PerkinElmer Life Sciences

液体闪烁鸡尾酒(liquid scintillation cocktail，LSC)：PerkinElmer LifeSciences

[羧基-14C]-三油酸甘油酯：Research Products International

Man-Rogosa-Sharpe(MRS)：Difco

奥利司他(赛尼可(Xenical))：Roche

稳定化的384孔板和384针复制器(replicator)：Nunc

膜半干系统(Membrane semi-dry system)：Bio-Rad

X-射线胶片：Kodak

Gel-Pro分析软件：Media cybernetics.

厌氧培养：BBL Gas-Pack厌氧系统的厌氧罐(anaerobic jar)中进行。

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠：Dae Han Biolink Co.，Ltd.

MRI图像用Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla仪(Bruker)得到，用ImageJ(NIH)进行分析。

血清：分别用大鼠/小鼠ELISA试剂盒(LINCO research)、瘦素ELISA试剂盒(R D System)、血糖计(Accu-Chek)和胆固醇ELISA试剂盒(AsanPharm.Co)进行分析。

通过突变的脂肪酸吸收能力改善乳酸菌的开发

MRS培养基中接种L.acidophilus KCTC3179乳酸菌，BBL Gas-Pack中以pH 7.2、37℃进行厌氧培养。为了得到游离脂肪酸吸收能力改善的FARM菌株的突变实验是如下进行的。精制并培养L.acidophilusKCTC3179乳酸菌24小时后，液相培养液中以2mg/ml的浓度添加NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)。在25℃培养30分钟后，用MRS肉汤洗3次，再次悬浮于MRS肉汤。连续稀释(serial dilution)后，将处理的细胞铺在MRS琼脂平板(agar plate)，以厌氧状态在37℃培养48小时后，接种在有50μl的MRS肉汤的384-孔板(well plate)，在37℃厌氧培养12小时。培养结束后，用仅有MRS肉汤培养液的384-孔板和装有包含0.1nCi/ml的¹⁴C-棕榈酸(palmitic acid)的MRS肉汤培养液的384-孔板，利用384-针复制器(pin replicator)进行复制(replica)。复制的板用石蜡膜(parafilm)包裹后，在37℃轻轻摇晃的同时培养30分钟培养后，将用¹⁴C放射性标记的培养液各2μl分别移至尼龙膜后，用半干燥系统(semi-dry system)进行干燥干燥。干燥的膜用MRS肉汤洗3次而去除残留的¹⁴C-棕榈酸后，在-80℃在X射线胶片(X-ray film)曝光3天。从X射线胶片得到的放射性程度用Gel-Pro分析软件进行分析，筛选信号强的集群，由此最终找到脂肪酸吸收能力改善的乳酸菌株，并将其命名为FARM1(脂肪酸掠夺微生物1)。其次，对FARM1用如上所述的方法处理4NQO(4-硝基喹啉1-氧化物)得到了FARM2，同样用相同方法对FARM2处理EMS(乙基甲烷磺酸)得到了FARM3。

体外(in vitro)脂肪酸吸收能力的评价

为了评价已发掘的乳酸菌株的脂肪酸吸收能力，将乳酸菌株与放射性标记的¹⁴C棕榈酸(palmitic acid)一同培养后，测定放射性程度。为此，MRS肉汤2ml中接种乳酸菌株后，进行培养，进入到对数生长期后，进行离心分离，以1nCi/ml的浓度接种在含有¹⁴C-棕榈酸的MRS培养基后，在37℃培养1小时。将以¹⁴C标记的细胞用MRS肉汤洗3次后，悬浮于MRS肉汤1ml，其中将0.2ml移至含有2ml的液体闪烁鸡尾酒的闪烁瓶中。混合物涡旋(vortex)1分钟后，利用液体闪烁分光光度法(liquidscintillation spectrophotometry)测定了¹⁴C活性。

乳酸化能力的评价

MRS培养基在37℃厌氧培养乳酸菌株，达到对数生长期后，将1ml的细胞培养液接种于含有无菌条件的脱脂牛奶(10％)和葡萄糖(2％)的100ml后，在37进行培养的同时每隔24小时测定pH变化。为了测定细胞生长曲线，将发酵48小时后制造的酸乳酪5ml移至15ml锥形管(conicaltube)后，进行涡旋。将均化的混合物1ml用PBS稀释后将稀释液50μl涂抹于MRS平板，厌氧培养48小时后，数集群数。

动物实验

所有动物实验是按照动物管理和利用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)的规定进行的。将体重为200-220g左右的SD雄性老鼠在笼子中各放入两只，最初1周自由供给一般饲料和水。实验期间每隔12小时改变昼夜照明，温度恒定维持为22±1℃，湿度恒定维持为40～50％。一周后随即分离老鼠以使每组成为14只，并且分为对照群(高脂肪饲料)、3179组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus KCTC3179乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、FARM组(高脂肪饲料中含有L.acidophilusFARM乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)。该实验中使用的高脂肪饲料是通常老鼠饲料(复合碳水化合物(complex-carbohydrate)60％、蛋白质22％、脂肪3.5％、纤维5％、粗灰分(crudeash)8％、钙0.6％、和磷1.2％)中添加了猪油20％的特殊饲料，其组成由符合碳水化合物48％、蛋白质17.6％、脂肪22.8％、纤维素4％、灰6.4％、钙0.48％、磷0.96％构成。用于饲养实验的酸乳酪是具有脱脂奶粉10％、砂糖2％和10⁹/ml以上的菌体浓度的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)培养液1％。实验期间，老鼠自由摄取各自所属的饲养，并且发酵酸乳酪3ml是直接从口腔供给的。体重是禁食12小时后上午9点到1点之间测定的。

1、胃肠道集群形成能力

对老鼠将各实验群相应的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)发酵酸乳酪供给8周后，从各实验群随即选择4只老鼠，用乙醚(ether)麻醉后将其杀死。从老鼠立即采集胃和小肠那样的胃肠道组织，移至50ml锥形管后，用无菌生理盐水稀释。其次，为了排出胃肠道组织的内容物，利用均质机(homogenizer)均化后，涂抹于乳酸菌筛选琼脂平板(lactobacillus selectiveagar plates)，厌氧培养48小时。数乳酸菌筛选培养基中形成的乳酸菌集群数，计算胃肠道内不同组织的log₁₀CFU/g(湿重)。

2、FARM乳酸菌的肥胖诱导抑制效果

利用具有长链结构的一种甘油三酯(triglyceride)的三油酸甘油酯(triolein)，进行了FARM乳酸菌的肥胖诱导抑制效果实验。将以[¹⁴C]放射性标记的三油酸甘油酯配制为苯溶液，在-70℃保管并使用。将以[¹⁴C]放射性标记的三油酸甘油酯1μCi与未放射性标记的三油酸甘油酯混合后，在室温利用氮气使溶剂挥发。对摄取乳酸菌22周的老鼠，将三油酸甘油酯混合物每老鼠体重100g供给0.5mmol后，10小时期间每隔2小时用心脏穿刺(cardiac puncture)采集老鼠的血液样品。从各血清在1.8ml的LSC添加0.1ml后，液体闪烁分光光度法测定¹⁴C活性。FARM乳酸菌的肥胖诱导抑制是通过测定在各乳酸菌发酵酸乳酪摄取老鼠中的脂肪酸摄取能力差异所导致的血清内放射性程度差异来进行判断。

3、内脏脂肪的磁共振图像的测定

为了用磁共振图像(MRI)装置分析内脏脂肪部位的体脂肪，使用了Bruker Biospec 47/40 4.7-Tesla装置。实验中使用的老鼠是用舒泰(zoletil)(25mg/kg)和伦品(rompun)(10mg/kg)麻醉的。为了得到图像，将老鼠置于磁铁板并将体线圈(body coil)用作发射器和接收器进行记录。为了测定内脏脂肪和皮下脂肪部位，以T1加权图像的方式得到第4-5腰椎之间往上8cm、往下8cm的部位。内脏脂肪和皮下脂肪部位是用图像J程序(Image J program)分析的。

4、血清生化学分析

实验老鼠的血液是在实验开始日和结束日、即22周后进行采集后用于生化学分析中。血液采集前，所有实验动物是绝食的，并且用乙醚麻醉的状态下用心脏穿刺(cardiac puncture)得到全部血液。将血液以2,000xg在4℃离心分离10分钟后得到的血清是在70℃保管直到进行分析。为了血清生化学分析，使用了大鼠/小鼠ELISA试剂盒(胰岛素)、瘦素ELISA试剂盒(瘦素)、血糖仪(blood glucose meter)、ELISA试剂盒(血清总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、甘油三酯)等。

5、FARM3乳酸菌的抗肥胖效果

将3个月的SD雄性老鼠高脂肪饲养8周，并诱导肥胖以使平均体重成为425g。随即分离该老鼠以使每组成为14只，并且分为3179组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus KCTC3179乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、FARM3组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus FARM3乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、奥利司他组(高脂肪饲料中添加赛尼可(Xenical)200mg/kg作为节食(diet)后进行摄取的群)。其后，4周期间老鼠自由摄取各自所属的饲养，并且体重是禁食12小时后上午9点到1点之间测定的。

6、统计处理

所有数据以平均值±标准偏差表示，并且根据ANOVA(方差分析)测试，判断为p＜0.05的情况下，统计上有意义。

结果

1、乳酸菌的脂肪酸吸收能力和乳酸菌定植(colonization)的宿主的热量摄取变化

图1是测定了乳酸菌的脂肪酸吸收能力的结果。将嗜酸乳杆菌KCTC3179(以3179表示)乳酸菌，用NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)进行突变而发掘的FARM1乳酸菌的脂肪酸吸收能力是增加的。将FARM1乳酸菌用4NQO(4-硝基喹啉1-氧化物)进行2次突变而得到的FARM2，与FARM1相比具有更改善的脂肪酸吸收能力。从外部吸收脂肪酸的能力差异是，将以1nCi/ml浓度¹⁴C放射性标记的棕榈酸和乳酸菌培养1小时后用液体闪烁分光光度法测定乳酸菌的放射性程度的，并且以标准偏差(n＝4)表示。

图2是乳酸菌定植(colonization)的宿主中测定热量摄取变化的结果。确认了FARM乳酸菌定植(colonization)的宿主中热量摄取的减少。对SD老鼠将FARM乳酸菌或者通常乳酸菌L.acidophilus KCTC3179供给8周，胃肠道(GI tracks)中定植(colonization)乳酸菌后，使其摄取¹⁴C-标记的三油酸甘油酯，采集血液，测定血清内放射性程度，从而测定了宿主的热量摄取变化。

从图1和2的结果，表现出FARM乳酸菌的脂肪酸吸收能力和FARM乳酸菌定植(colonization)的宿主的胃肠道中脂肪吸收成反比。

2、乳酸化能力

含有无菌条件的葡萄糖(glucose)(2％)的脱脂牛奶(10％)100ml中接种乳酸菌株，在37℃发酵为酸乳酪。为了在发酵为酸乳酪的过程中测定乳酸菌的乳酸化能力，在24小时后、48小时后、72小时后测定了pH变化。10个试样的测定值以平均值±标准偏差表示。结果如下表1所示。

表1

数值为平均值+每10个样品的SEM

3、胃肠道内集群形成(colonization)能力

对老鼠将各实验群相应的L.acidophilus(KCTC3179或FARM)发酵酸乳酪供给8周后，采集胃和小肠那样的胃肠道组织，得到胃肠道内不同组织部位的log₁₀CFU/g(湿重)。对照群为乳酸菌未处理群，并且5个试样的测定值以平均值±标准偏差表示。结果如下表2所示。

表2

数值为平均值+每5个样品的SEM

4、以饲养的方式诱导肥胖的期间L.acidophilus KCTC3179、FARM1、FARM2的胃肠道内集群形成(colonization)能力

对老鼠将各实验群相应的L.acidophilus(KCTC3179或FARM)发酵酸乳酪供给4周后，采集胃和小肠那样的胃肠道组织，得到胃肠道内不同组织部位的log₁₀CFU/g(湿重)。对照群为乳酸菌未处理群，并且5个试样的测定值以平均值±标准偏差。结果如下表3所示。

表3

数值为平均值+每5个样品的SEM

5、对于以高脂肪饲养的方式诱导的肥胖的FARM的热量摄取减少效果

结果如图3～5所示。图3是测定了实验群的体重变化的结果。随即分离体重为200-220g左右的3个月SD雄性老鼠以使每组成为14只，并且分为对照群(高脂肪饲料)、3179组(高脂肪饲料中含有L.acidophilusKCTC3179乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、FARM组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus FARM乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)。其后，22周期间老鼠自由摄取各自所属的饲养，并且体重变化以平均值±标准偏差表示。

图4是用磁共振成像装置(MRI)测定实验群的内脏脂肪后，用图像分析程序(Image J，USA)进行分析的结果。内脏脂肪量的变化以平均值±标准偏差表示。

图5是示出22周的高脂肪饲养群和FARM乳酸菌摄取群的内脏脂肪蓄积图像的图。

6、通常乳酸菌KCTC3179和FARM乳酸菌供给后的血清值比较结果

结果如图6～8所示。随即分离体重为200-220g左右的3个月SD雄性老鼠以使每组成为14只，并且分为对照群(高脂肪饲料)、3179组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus KCTC3179乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、FARM组(高脂肪饲料中含有L.acidophilus FARM乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)。分析了在实验开始日和结束日所采集的血液中得到血清值的结果以标准偏差表示。图6表示血脂浓度变化，其中，TG表示甘油三酯类；TC表示总胆固醇；HDL表示高密度脂蛋白胆固醇；LDL表示低密度脂蛋白胆固醇。图7是示出血液胰岛素和瘦素浓度变化的图，图8是示出血糖变化的图。

7、对于以饲养的方式诱导的肥胖的FARM3的抗肥胖效果

结果如图9和10所示。图9是将FARM3乳酸菌的体外(in vitro)脂肪酸吸收能力与3179乳酸菌进行比较的图。将FARM2乳酸菌用EMS(乙基甲烷磺酸)进行3次突变所得到的FARM3与FARM2相比具有改善的脂肪酸吸收能力。从外部吸收脂肪酸的能力差异是，将以1nCi/ml浓度¹⁴C放射性标记的棕榈酸和乳酸菌培养1小时后，用液体闪烁分光光度法测定乳酸菌的放射性程度，并且以标准偏差(n＝4)表示。

图10是在FARM乳酸菌定植(colonization)的宿主中表示热量摄取减少的结果。对SD老鼠将FARM乳酸菌或通常乳酸菌L.acidophilusKCTC3179供给8周，胃肠道(GI tracks)中定植(colonization)乳酸菌后，使其摄取¹⁴C-标记的三油酸甘油酯，采集血液，测定血清内放射性程度，从而测定了宿主的热量摄取变化。首先，将3个月的SD雄性老鼠高脂肪饲养8周，并诱导肥胖以使平均体重成为425g。

随即分离该老鼠以使每组成为14只，并且分为3179组(○、高脂肪饲料中含有L.acidophilus KCTC3179乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、FARM3组(●、高脂肪饲料中含有L.acidophilus FARM3乳酸菌发酵酸乳酪的摄取群)、奥利司他组(△、高脂肪饲料中添加赛尼可(Xenical)200mg/kg作为节食(diet)后进行摄取的群)。其后，4周期间老鼠自由摄取各自所属的饲养，并且体重变化以平均值±标准偏差表示。

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

保藏证明

依据第7.1条的规定公布

致：JINIS

948-9 Doonsan-ri，Bongdong-eup，Wanju-gun，Jeollabuk-do 565-902

韩国

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

保藏证明

依据第7.1条的规定公布

致：JINIS

948-9 Doonsan-ri，Bongdong-eup，Wanju-gun，Jeollabuk-do 565-902

韩国

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

保藏证明

依据第7.1条的规定公布

致：JINIS

948-9 Doonsan-ri，Bongdong-eup，Wanju-gun，Jeollabuk-do 565-902

韩国