棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉铃虫生长相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白的编码基因及其功能片段。利用本发明Ha-JHBP基因作为目的基因构建dsRNA植物表达载体，在植物中大量表达Ha-JHBP的dsRNA，提高了转基因植株的抗虫能力。本发明对于植食性昆虫的生物防治，植物抗虫基因工程，分子生物学领域发挥重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

虫害是制约农作物高产的重要因素。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失 平均达20％～30％，每年损失约数千亿美元。喷施化学农药、生物杀虫剂是目前主要的 防治方法。由于人类对环境保护和自身健康意识的增强、害虫抗性、农药残留等因素 使大量传统杀虫剂已经不适应现代农业发展的需要。

利用基因工程手段培育抗虫新品种具有保护作用连续性、资源丰富、毒性专一、 对环境污染小、周期短、成本低，目的性强等优点。因此，转基因抗虫植物的出现使 抗虫问题可以在很大程度上解决。如来源于微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)毒蛋白基因已成功地转入各种作物及果树林木，来源于高等 植物的植物凝集素基因也被用来获得转基因抗虫植物。

虽然昆虫对转基因植物的抗性发展缓慢，但也是一个不容忽视的问题。转基因植物 的大田抗性试验证明，经12次繁殖后昆虫便对Bt毒蛋白产生抗性，转单一晶体蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)基因的植物在生产上一般只能用8～10 年。由此看来，昆虫的抗性是抗虫转基因工程中较为严重的潜在问题，迫切需要寻找新 的方法或新的基因来有效或者特异的防治植物病虫害。

RNA干扰(RNA interfefence，RNAi)现象是指利用内源性或外源性双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)介导细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达 沉默，产生相应的功能表型缺失。dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、植 物、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼、大小鼠等多种生物中。大多数昆虫也存在RNAi信号 的系统性传播现象。有研究表明将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织，可 引发远距离靶基因的特异性沉默。此外，除了直接注射dsRNA，还可以通过饲喂dsRNA 的方法诱导昆虫产生RNAi现象。目前已有研究表明饲喂相应靶基因的dsRNA已成功降 低苹浅褐卷蛾(Epiphyas postvittana)幼虫羧酸酯酶表达水平、蜜蜂(Apis mellifera)的雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin，amTOR)的表达水平及棉铃虫 (Helicoverpa armigera)P450基因的表达水平。因而，以RNAi技术为基础开发新 的害虫防治方法，为农业害虫的防治提供了高特异性和环境安全的新策略。

昆虫激素在昆虫的生长发育中起着极其重要的作用。调节昆虫发育的昆虫激素， 其合成、运输和代谢途径中所涉及的关键基因多数具有很强的物种特异性，即与其他 物种的基因同源性低，尤其是与人类基因相比几乎没有同源性，这在很大程度上降低 了RNAi技术的“脱靶效应”，从而为应用安全性方面提供了保障。因此，在植物中表 达昆虫激素相关基因的dsRNA，其优点在于只对植食性的昆虫有抑制作用，同时还可以 根据昆虫激素相关基因的物种特异性，通过表达不同序列的dsRNA对某一种或某一属 昆虫的生长发育产生影响，从而达到精确、安全的控制虫害的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，名称为Ha-JHBP蛋白，获自鳞翅目夜蛾科昆虫棉铃虫 (Helicoverpa armigera)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与棉铃虫生长相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

  标签   残基   序列   Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR   Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH   FLAG   8   DYKDDDDK   Strep-tag II   8   WSHPQFEK   c-myc   10   EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′ 端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因(Ha-JHBP基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第12至740位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在高严谨条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码棉铃虫生长相关蛋白 的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码棉铃虫生长相关蛋白 的DNA分子。

所述高严谨条件为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交 并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。

本发明还保护含有序列表的序列2自5’末端第207-689位核苷酸的DNA片段。

所述DNA片段可为DNA片段甲、DNA片段乙或DNA片段丙；

所述DNA片段甲可如序列表的序列2自5’末端第207-689位核苷酸所示；

所述DNA片段乙可如序列表的序列2自5’末端第204-691位核苷酸所示；

所述DNA片段丙可为含有正向序列和反向序列的DNA，所述正向序列如序列表的 序列4自5’末端第15至497位核苷酸所示，所述反向序列如序列表的序列4自5’ 末端第711至1193位核苷酸所示。所述DNA片段丙优选为序列表的序列4所示DNA。

含有所述DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因或所述DNA片段的的重组表达载体。 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表 达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前 体的3’端。使用所述基因或所述DNA片段构建重组植物表达载体时，在其转录起始 核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的 植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因或DNA片段构建植物表达载体时，还 可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码 子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正 确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是 合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细 胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达 的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化 学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为如下(I)或(II)：

(I)将所述DNA片段丙插入重组质粒pC2300PN的多克隆位点得到的重组质粒； 所述重组质粒pC2300PN为以植物表达载体pCAMBIA2300为骨架载体，在PstI和EcoR I酶切位点之间插入序列表的序列8自5’末端第12至295位核苷酸所示的DNA，在 PstI和HindIII酶切位点之间插入序列表的序列9自5’末端第14至194位核苷酸所 示的DNA，得到的重组质粒；

(II)将所述DNA片段甲或所述DNA片段乙插入L4440质粒的多克隆位点得到的 重组质粒。

所述重组菌具体可为将(II)所述的重组质粒导入大肠杆菌HT115(DE3)得到重组 菌。

上述(I)所述的重组质粒为一种干扰载体，在棉花曲叶病毒(CLCuV)互补链启动 子(PRP)的驱动下在植物中超量表达针对Ha-JHBP基因的干扰RNA，植食性昆虫取食 该植物后降低了Ha-JHBP基因在昆虫体内的表达水平，从而打乱昆虫的激素平衡，影 响其生长发育，达到抗虫的目的。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述的DNA片段丙导入目的植物 中，得到抗棉铃虫能力高于所述目的植物的转基因植物。所述DNA片段具体可通过所 述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述DNA片段的表达载体可通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因 枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述DNA 片段丙具体可通过(I)所述的重组质粒导入所述目的植物。所述目的植物可为单子 叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物优选为烟草(如烟草品种Nicotiana tabacum cv. Xanthi)。

本发明还保护一种双链RNA，其一条链如序列表中序列6自5’端第16至503位 核苷酸所示(其互补链如序列表中序列7自5’端第29至516位核苷酸所示)。所述 双链RNA可用于制备杀死棉铃虫的制剂。所以本发明同时保护一种用于杀死棉铃虫的 制剂，其活性成分为所述双链RNA。

昆虫体内保幼激素的水平在调控昆虫幼虫通过各期蜕变变成成虫的变态过程起关 键作用，像蝗虫一类的昆虫，保幼激素也是一个控制其由静止期向迁移期转变的重要 因素。许多昆虫有着具有不同功能的不同的成虫形式，激素决定着他们要变成何种形 式的成虫。本发明提供的蛋白与从咽侧体分泌到血淋巴的保幼激素(JH)结合，使其免 受非特异性酯酶或保幼激素环氧化酶(JHEH)的降解。

与目前抗虫技术相比，本发明有如下有益效果：首先，本发明所提供的Ha-JHBP 基因是在鳞翅目棉铃虫中分离的基因，其所编码的保幼激素结合蛋白对于棉铃虫咽侧 体所分泌的保幼激素在体内运输免受非特异性酯酶或保幼激素环氧化酶(JHEH)的降解 起着重要的作用，Ha-JHBP基因在昆虫体内表达水平的变化对昆虫的生长发育产生重大 的影响；其次，利用本发明Ha-JHBP基因作为目的基因构建dsRNA植物表达载体，在棉 花曲叶病毒PRP启动子的驱动下在植物中大量表达Ha-JHBP的dsRNA，提高了转基因植株 的抗虫能力。本发明对于植食性昆虫的生物防治，植物抗虫基因工程，分子生物学领 域发挥重要的应用价值。

附图说明

图1为重组质粒pLJP的结构示意图。

图2为实施例2的饲喂试验中两组处理棉铃虫的死亡率分析柱状图。

图3为干扰片段的结构示意图。

图4为植物体内表达dsRNA的示意图。

图5为干扰载体PRP:dsJHBP的结构示意图。

图6为转基因烟草的PCR检测图；M为DL2000plus Marker；CK为野生型烟草；1-10 为PCR阳性烟草。

图7为转基因烟草Northern blot检测图；CK为野生型烟草；1-6为PCR阳性烟草。

图8为棉铃虫的死亡率分析；X轴代表棉铃虫幼虫进食转基因烟草叶片的天数；Y 轴代表棉铃虫的死亡率。

图9为接种8天后存活棉铃虫的体重分析。

图10为转基因烟草喂食棉铃虫后，real-time PCR检测昆虫体内Ha-JHBP基因mRNA 表达水平。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

细菌表达载体L4440：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考 文献：Timmons，L.and Fire，A.(1998)Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395：854-854.)；该载体的详细信息可在互联网上查询到，具体网址为 http://www.addgene.org/pgvecl？cmd＝findpl&identifier＝1654。

大肠杆菌HT115(DE3)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参 考文献：Timmons，L.，Court，D.L.and Fire，A.(2001)Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.Gene 263：103-112.)。

根癌农杆菌EHA105：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考 文献：Hood EE，Gelvin SB，Melchers S，Hoekema A(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants(EHA105).Trans Res 2：208-218。

实施例4中所用的无菌烟草品种为Nicotiana tabacum cv.Xanthi，公众可以从中 国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：A.NATO，S.BAZETOUX，Y.MATHIEU Photosynthetic Capacities and Growth Characteristics of Nicotiana tabacum(cv. Xanthi)Cell Suspension Cultures Physiologia Plantarum Volume 41，Issue 2， pages 116-123，October 1977。

棉铃虫(Helicoverpa armigera)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研 究所获得；参考文献：Wu KM，Lu YH，Feng HQ，Jiang YY，Zhao JZ.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areas with Bt toxin-containing cotton.Science.2008 Sep 19；321(5896)：1676-8。

LB培养基：溶剂为水，含有酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，用10M NaOH 水溶液调节pH至7.0。

YEB培养基：溶剂为水，含有牛肉浸膏5g/L、酵母膏1g/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、 MgSO4·7H₂O 0.04g/L、琼脂15g/L，用10M NaOH水溶液调节pH至7.2。

共培养培养基：以MS培养基为基础培养基，另含有IAA(吲哚乙酸)0.1mg/L、6-BA (6-苄氨基嘌呤)1mg/L、AS(乙酰丁香酮)100uM。

筛选培养基：以MS培养基为基础培养基，另含有IAA(吲哚乙酸)0.1mg/L、6-BA (6-苄氨基嘌呤)1mg/L、Cef(头孢霉素)400mg/L、Kan(卡那霉素)100mg/L。

再生培养基：以MS培养基为基础培养基，另含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)1mg/L、 Cef(头孢霉素)400mg/L、Kan(卡那霉素)100mg/L。

生根培养基：以MS培养基为基础培养基，另含有Cef(头孢霉素)200mg/L、Kan (卡那霉素)100mg/L。

实施例1、棉铃虫保幼激素结合蛋白及其编码基因的发现

1、根据已知昆虫的JHBP基因序列设计兼并引物(P1/P2)如下：

P1：5’-AGTGA(C/T)ATA(A/G)AATGC(T/A)T(G/A)AGCAA-3’；

P2：5’-GG(C/T)TC(T/A)CCAA(T/A)GATTTC(A/G)CAAG-3’。

2、提取3龄棉铃虫幼虫的总RNA，经RT-PCR体外反转录获得cDNA。

3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、将步骤3的PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt测序载体上进行测序，测序结果表 明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列5所示。

5、提取3龄棉铃虫总RNA作引物延伸实验，在mRNA的5’端加RNA接头RAP1；将5’ 端加接头的RNA反转录合成cDNA，以此cDNA为模板，根据序列5设计5’端扩增引物(P3) 和3’端扩增引物(P4)，然后采用5’RACE和3’RACE(所用引物UP5-I/UP5-II/P3和 UP3/P4)的方法获得5’端和3’端未知序列；拼接得到全长序列。

RAP1：5’-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3’；

UP5-I：5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’；

UP5-II：5’-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’；

UP3：5’-oligo(dT)25-3’；

P3：5’-GCAGTTGTTGAAGCTGTATAAGCGCC-3’；

P4：5’-GGAGAACCGAACGTGGATATTGG-3’。

6、根据拼接得到的全长序列设计引物P5/P6如下：

P5：5’-ATGGCAGTTTATAGGAGCTTG-3’；

P6：5’-TTAAATGTCAGTGAAAAAGGCTT-3’。

7、以步骤2的cDNA为模板，用步骤6设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

8、将步骤7的PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt测序载体上，得到重组质粒。

9、将重组质粒进行测序，测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的 序列2自5’末端第12至740位核苷酸所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为Ha-JHBP蛋白。将Ha-JHBP蛋白与目前已知鳞 翅目夜蛾科昆虫的相应蛋白序列进行比对，相似性约为80％，经SMART(The Simple Modular Architecture Research Tool)分析，Ha-JHBP蛋白具备与保幼激素结合的结 构域。将编码Ha-JHBP蛋白的基因命名为Ha-JHBP基因，其开放阅读框如序列表的序列2 自5’末端第12至740位核苷酸所示。

制备序列表的序列2自5’末端第12至740位核苷酸所示DNA。将制备的DNA克隆到 pEASY-Blunt测序载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组质粒pJHBP。

实施例2、棉铃虫幼虫饲喂试验

一、重组质粒pLJP的构建

1、以重组质粒pJHBP为模板，用引物P7-BglII/P8-XhoI进行PCR扩增，回收PCR扩 增产物(Ha-JHBP基因保守区段JHBP1-BX)。

P7-BglII：5’-GAAGATCTGATGTTGTGTATGA-3’；

P8-XhoI：5’-CCGCTCGAGTTAAAAGTCGTGGT-3’。

2、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切细菌表达载体L4440，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pLJP。重组质粒pLJP 的出发载体为L4440，在出发载体的BglII和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2 自5’末端第204-691位核苷酸所示的DNA。重组质粒pLJP结构示意图见图1，包括两个 T7启动子及T7启动子之间的Ha-JHBP基因。通过两个T7启动子，重组质粒pLJP可以表达 序列表的序列6所示RNA片段和序列表的序列7所示的RNA片段，两RNA片段可形成双链 RNA。

二、重组菌和对照菌的制备

将重组质粒pLJP转化大肠杆菌HT115(DE3)，得到重组菌。

将细菌表达载体L4440转化大肠杆菌HT115(DE3)，得到对照菌。

三、棉铃虫幼虫饲喂试验

1、制备RNA样本

将重组菌在LB培养基中37℃、200rpm振荡培养8-10h；然后按2％(体积百分含量) 比例转接到新鲜LB培养基中，振荡培养至OD₆₀₀为0.6左右；加入IPTG，振荡培养4小时， 收集菌体；从菌体中提取总RNA(RNA样本甲)。

将对照菌在LB培养基中37℃、200rpm振荡培养8-10h；然后按2％(体积百分含量) 比例转接到新鲜LB培养基中，振荡培养至OD₆₀₀为0.6左右；加入IPTG，振荡培养4小时， 收集菌体；从菌体中提取总RNA(RNA样本乙)。

2、人工饲料

棉铃虫饲养人工饲料配方(1L)：黄豆粉80g，小麦粉80g，酵母粉16g，琼脂14g， 维生素C 20片，维生素B 15片，山梨酸1g，苯甲酸钠1g，冰乙酸5ml，尼泊尔金乙酯2g， 苯菌灵(Benlate)0，05-0.1g，加水至体积为1L；煮沸冷却后为固体，进行饲喂试验。

3、棉铃虫幼虫饲喂试验

将2龄棉铃虫幼虫分成两组，每组设三个重复，每个重复24头幼虫，分别进行饲喂 试验，具体如下：

第一组：将100ng/ul的RNA样本甲均匀喷洒于人工饲料的表面(每克饲料喷涂 10ul)；将2龄棉铃虫幼虫置于喷涂后的人工饲料上，每天更换新经处理的人工饲料；

第二组：将100ng/ul的RNA样本乙均匀喷洒于人工饲料的表面(每克饲料喷涂 10ul)；将2龄棉铃虫幼虫置于喷涂后的人工饲料上，每天更换新经处理的人工饲料；

10天后，统计棉铃虫的死亡率，见图2。第一组棉铃虫幼虫的死亡率高于第二组。

实施例3、干扰载体的构建

一、合成干扰片段

1、合成序列表的序列3所示的DNA(intron间隔序列，5’端带有PstI酶切识别位 点，3’端带有PstI酶切识别位点)，将其插入载体pUC19(购自Takara公司，产品目录 号为D3219)的PstI酶切位点之间，得到重组质粒pUC19i，用限制性内切酶BglII和XhoI 双酶切质粒pUC19i，得到酶切产物甲。

2、以重组质粒pJHBP为模板，用引物P7-BglII/P8-XhoI进行PCR扩增，回收PCR扩 增产物。

P7-BglII：5’-GAAGATCTGATGTTGTGTATGA-3’；

P8-Xho I：5’-CCGCTCGAGTTAAAAGTCGTGGT-3’。

用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切PCR扩增产物，得到酶切产物乙。

3、将酶切产物甲和酶切产物乙连接，得到重组质粒pUC19i-JHBP(S)，用限制性内 切酶SalI和XbaI双酶切质粒pUC19i-JHBP(S)，得到酶切产物丙。

4、以重组质粒pJHBP为模板，用引物P7-BglII/P9-XbaI进行PCR扩增，回收PCR扩 增产物。

P7-BglII：5’-GAAGATCTGATGTTGTGTATGA-3’；

P9-XbaI：5’-GCTCTAGAGTTAAAAGTCGTGGT-3’。

用限制性内切酶BglII和XbaI双酶切PCR扩增产物，得到酶切产物丁。

5、将酶切产物丁和酶切产物丙连接，得到连接产物，即带有干扰片段的重组质粒 pUC19i-dsJHBP。重组质粒pUC19i-dsJHBP中，在pUC19的PstI酶切位点插入了干扰片段。

干扰片段如序列表的序列4所示，自5’末端第15至497位核苷酸为Ha-JHBP基因正 向序列，第711至1193位核苷酸为Ha-JHBP基因的反向序列。图3为干扰片段的结构示意 图；“Seq S”为Ha-JHBP基因正向序列，“Seq A”为Ha-JHBP基因的反向序列，“intron” 为间隔序列。图4为植物体内表达干扰RNA的示意图；“Seq S”为Ha-JHBP基因正向序列， “Seq A”为Ha-JHBP基因的反向序列，“|”代表氢键。

二、干扰载体的构建

植物表达载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司；详细序列见GenBank：AF234315.1， 网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7638145)上构建连接棉花曲叶病毒 (CLCuV)互补链启动子PRP和T-NOS终止子，获得质粒pC2300PN。

1、合成序列表的序列8所示的DNA(序列表的序列8自5’末端第12至295位核苷酸 为PRP片段)。

2、通过用限制性内切酶PstI/EcoR I双酶切，将序列8所示的DNA插入pCAMBIA2300 的Pst I/EcoR I位点之间，得到重组质粒pCAMBIA2300-PRP。

3、合成序列表的序列9所示的DNA(序列表的序列9自5’末端第14至194位核苷酸 为T-NOS片段)。

4、通过用限制性内切酶PstI/HindIII双酶切，将序列9所示的DNA插入 pCAMBIA2300-PRP的PstI/HindIII位点之间，得到重组质粒pC2300PN。

5、用限制性内切酶PstI酶切重组质粒pUC19i-dsJHBP，回收序列4所示的干扰片段， 将其插入pC2300PN的PstI酶切位点，获得干扰载体PRP:dsJHBP。干扰载体PRP:dsJHBP 的结构示意图见图5，包括棉花曲叶病毒(CLCuV)启动子PRP，干扰片段和T-NOS终止子 以及左右边界。

实施例4、转基因烟草的获得和抗性鉴定

一、转基因烟草的获得

1、将干扰载体PRP:dsJHBP电击转入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌转划YEB固体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)，进行 活化；挑取单克隆菌斑于YEB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)，28℃ 200rpm培养16～20小时；然后按4％(体积百分含量)的比例接种于YEB液体培养基(含 乙酰丁香酮100uM)，28℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5～0.6(约4小时)；4℃、 4000rpm离心，收集菌体；将菌体用MS液体培养基(含乙酰丁香酮200uM)悬浮，调节 OD值为0.15～0.20，即为重组菌菌悬液。

3、将无菌烟草叶片切成小叶盘，放入重组菌菌悬液中，侵染10分钟。

4、取出侵染后的小叶盘，滤纸稍微吸去多余菌液，叶盘背面朝上铺于共培养培养 基上，25℃黑暗条件培养72小时；将经共培养的叶盘转移到筛选培养基上，28℃16/8 h光周期下培养15～20天；将已生长有愈伤组织的叶盘由筛选培养基转移至再生培养基 上，28℃16/8h光周期下培养至有小的再生芽出现；切下小芽移到生根培养基中生根 壮苗，待长根后移入蛭石营养土混合物中。

5、PCR鉴定

将生根小苗进行PCR鉴定(P10/P11)，显示430bp左右条带的植株为PCR阳性植株。

P10：5’-GACGAAGGCTTGGGACTGGT-3’；

P11：5’-TGGCATAGCGTCTTCTTCCG-3’。

PCR反应条件：95℃，5分钟1个循环；95℃40秒，56℃40秒，72℃40秒，35 个循环；72℃延伸10分钟。

PCR的产物的电泳图见图6。

6、Northern blot鉴定

将PCR阳性的植株进行Northern blot鉴定。

取50ug叶片提取的总RNA，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，将RNA转移至Hybond-NX 杂交膜上，与探针37℃杂交12-16小时(探针为序列表的序列2自5’末端第207-689位 核苷酸所示的DNA)。

Northern blot鉴定结果见图7，泳道1、2、4、5的植株具有较强的杂交信号。转 基因植株杂交出相应的条带。Northern blot鉴定阳性的植株即为转基因植株(T₀代)。 将泳道1的植株命名为T₀-1、将泳道2的植株命名为T₀-2、将泳道5的植株命名为T₀-5。

二、对照烟草的获得

将pC2300PN代替干扰载体PRP:dsJHBP，采用步骤一相同的操作，得到转空载体烟 草，作为转基因烟草的对照。

三、抗虫鉴定

分别将转基因烟草(T₀-1、T₀-2、T₀-5)、3株T₀代转空载体烟草进行饲喂试验，具 体如下：将植株置于温室培养(生长温度为25℃，光照周期为16/8h)，植株生长至7～ 10叶龄时，接种3龄棉铃虫幼虫，每株烟草接种10头幼虫；每天统计幼虫的死亡率。

试验期间，棉铃虫幼虫的死亡率见图8(取转基因烟草的平均值和转空载体烟草的 平均值)。自接种的第4天开始，转基因烟草植株上受试虫的死亡率明显高于转空载体 烟草。

接种8天后，3株转基因烟草上尚有10只存活，3株转空载体烟草中尚有23只存活。 取植株上的尚存活的棉铃虫，称重并将虫重数据进行方差分析。见图9。喂食转基因烟 草的幼虫体重明显小于喂食转空载体烟草的幼虫体重，P＜0.05(0.013)。

接种8天后，取植株上的尚存活的棉铃虫，提取总RNA，反转录合成cDNA。将cDNA 作为模板采用QRT-PCR的方法检测棉铃虫体内Ha-JHBP基因表达。

QRT-PCR检测中Ha-JHBP基因引物为：

P12：5’-ATTGCTTGCATTTGCGAGTTGTGT-3’；

P13：5’-TCCGGGAAACCATTGCTTGT-3’。

内参ACTIN基因引物为：

P14：5’-CCTGGTATTGCTGACCGTATGC-3’；

P15：5’-CTGTTGGAAGGTGGAGAGGGAA-3’。

所有存活个体平均结果如图10所示。接种于转基因烟草的棉铃虫体内Ha-JHBP基因 的mRNA水平显著低于接种于转空载体烟草的棉铃虫，说明取食转基因烟草植株叶片可 以降低棉铃虫体内Ha-JHBP基因的表达量。