保幼激素类似物Methoprene耐受基因1和G蛋白偶联受体激酶2在棉铃虫发育过程中的功能研究

摘要

随着分子生物学技术的发展，人类研究昆虫发育的机制有了更好的平台。通过阐明昆虫发育的分子机理，可以为人类研究与疾病相关的生理过程提供参考和理论依据。全变态昆虫的整个生命周期要经历多次蜕皮，包括幼虫各龄期之间的蜕皮、幼虫向蛹过渡的变态蜕皮以及蛹到成虫的羽化蜕皮。昆虫的发育和蜕皮变态过程主要受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)共同调控。因此，阐明20E膜信号通路终止机制和JH胞内受体Methoprene耐受基因1(Met1)传导JH信号的机制具有重大意义。
　　国内外研究进展及科学问题
　　目前关于昆虫JH功能的研究主要集中在对其受体功能机制的研究上，关于最有可能的JH受体Methoprene耐受基因(Met)的研究结果有很多。Met结合JH后和bHLH-PAS家族其他蛋白一起作为复合体结合到Krh1基因启动子区域JH响应元件(JHRE)中的E-Box上，启动Krh1的转录，进而传导JH信号;在赤拟谷盗中干扰Met，会引起幼虫的早熟变态。超气门蛋白(USP)参与20E信号通路的同时还能与JH结合。Met作为JH的胞内受体如何传导JH信号，USP如何与Met相互作用一起参与JH通路，这些科学问题的答案尚不明确。20E膜信号通路是目前的研究热点,20E最有可能的膜受体是GPCR。G蛋白偶联受体激酶(GRK)最著名的功能是磷酸化G蛋白偶联受体(GPCR)，使GPCR信号脱敏。棉铃虫中的GRK2分布在细胞质中，GRK2如何在20E的诱导下由细胞质移位至细胞膜终止GPCR的功能，GRK2是否介导20E膜信号的终止都是目前研究的热点科学问题。
　　结果：
　　本文以棉铃虫及其表皮细胞系为实验材料，通过体内和体外实验，运用分子生物学技术，深入研究了Met1和GRK2在棉铃虫生长发育中的功能及机制，获得如下结果和结论:
　　1.磷酸化的Met1和非磷酸化USP1形成转录复合体促进基因转录维持幼虫状态Met1的表达被JHⅢ上调，但是被高浓度的20E抑制。虫体干扰Met1导致提前化蛹。Met1通过促进JH通路基因转录和抑制20E通路基因转录来维持幼虫状态。无激素时，存在Met1-Met1-USP1复合体;JHⅢ诱导下，Met1的PAC结构域发生磷酸化导致Met1同源二聚体解离，Met1和Hsp90，USP1一起以复合体形式结合到Krh1基因启动子中的JHRE序列上起始Krh1的转录;在20E诱导下，USP1的第21位丝氨酸发生磷酸化，打破Met1与USP1的结合并破坏Met1-Met1的二聚化，Met1以单体形式存在，磷酸化的USP1与20E的核受体EcR-B1结合形成转录复合体传导20E信号。
　　2.GRK2终止GPCR在细胞膜上传导20E信号的功能
　　GRK2蛋白在虫体变态时期高表达，GRK2的表达被20E上调。在虫体干扰GRK2导致化蛹进程加速、20E通路基因转录上调和凋亡变态过程的提前。20E通过细胞膜上的ErGPCR-2调控PKC磷酸化GRK2的第680位丝氨酸，导致GRK2的膜转位;位于细胞膜上的GRK2结合ErGPCR-2并使之磷酸化导致ErGPCR-2的内吞，进而终止ErGPCR-2传导20E信号的功能。20E和GRK2之间存在负反馈调控机制。
　　结论：
　　Met1通过抑制20E通路并促进JH通路基因转录来维持幼虫状态，磷酸化的Met1和非磷酸化USP1一起传导JH信号，本文的研究结果为JH维持昆虫幼虫状态抑制变态发生提供了新的实验证据和理论支持。通过对GRK2的功能研究，揭示了类固醇激素20E终止的机制，阐明了GRK2和ErGPCR-2相互作用使20E通路在虫体中正常的发挥作用不致过量。为昆虫发育及蜕皮变态提供了新的理论知识，为害虫防治提供的新的靶标。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 概述

第二节 昆虫蜕皮变态的分子机制

一、20E基因组信号途径

二、20E的非基因组信号途径

三、保幼激素信号转导途径

四、保幼激素信号途径和蜕皮激素信号途径的相互作用

五、本论文的科学问题及研究意义

第二章 磷酸化的保幼激素类似物Methoprene耐受基因1和非磷酸化的超气门蛋白1形成转录复合体促进基因转录维持幼虫状态

一．引言

二．实验方法和材料

1．实验材料

2．实验方法

三．实验结果

1．Met1基因序列克隆及分析

2．Met1的蛋白原核表达及多克隆抗体制备

3．Met1在幼虫取食期表达量高但在变态期表达量低

4．干扰Met1后影响基因转录导致化蛹提前

5．细胞系干扰Met1抑制JH通路基因转录并促进20E通路基因转录

6．细胞系中过表达Met1促进JH所诱导的相关基因的转录同时抑制20E所诱导的相关基因的转录

7．JH Ⅲ和20E打破Met1-Met1二聚

8．JH Ⅲ诱导Met1的PAC结构域发生磷酸化进而打破Met1-Met1二聚

9．Met1结合Hsp90作为复合体结合Kr-h1基因启动子JHRE序列

10．Met1抑制EcR-B1与USP1的结合

11．Met1结合非磷酸化的USP1，不能结合20E所诱导磷酸化的USP1

12．Met1的C端决定Met1和USP1的结合

13．JH Ⅲ诱导下，Met1同源二聚体解聚并与USP1互作才能结合JHRE来起始Krh1的转录

四．讨论

1．Met1的表达受JH和20E共同调控

2．JH Ⅲ诱导Met1的PAC结构域磷酸化使Met1-Met1同源二聚解离

3．磷酸化的Met和非磷酸化的USP1形成复合体起始JH通路维持幼虫状态

4．Met1抑制20E通路基因转录进而阻止变态发生

5．20E诱导USP1发生磷酸化进而破坏其与Met1的结合

五．结论

第三章 G蛋白偶联受体激酶2终止蜕皮激素膜信号通路中G蛋白偶联受体的功能

一．引言

二．实验方法和材料

1．实验材料

2．实验方法

三．实验结果

1．GRK2基因克隆与分析

2．GRK2多克隆抗体制备

3．GRK2在棉铃虫变态期高表达

4．干扰GRK2促进变态和20E通路中基因转录

5．干扰GRK2后促进20E所诱导的凋亡

6．棉铃虫表皮细胞中20E诱导GRK2向细胞膜移动

7．680位丝氨酸磷酸化决定GRK2向膜移动

8．GRK2磷酸化ErGPCR-2并介导ErGPCR-2内吞

四．讨论

1．20E上调GRK2的表达

2．20E诱导下，PKC介导的磷酸化决定着GRK2的向膜移动

3．20E信号的负反馈调控

五．结论

创新点总结

展望

参考文献

致谢

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