评价环境单因素对转基因植物基因漂移影响的方法

摘要

本发明提供了一种评价环境单因素对转基因植物基因漂移影响的方法，此方法是在温室条件下，通过人工模拟提取了自然环境中对基因漂移可能存在影响的因子，拆分自然环境，进行单一因素下的基因漂移试验，以确定单一因素对基因漂移的影响程度，在结合不同地域环境因素的实际测量值之后，可更好地确定当地影响基因漂移的主要因素，并对转基因植物的种植制定有效预案，一定程度上减少了试验重复次数，节约试验成本。同时，与wagon-wheel的大量样点F1代取样分析不同，本发明方法，占用空间少，F1代取样量降低，大大降低了试验后期检测、分析的工作量。

说明书

技术领域

本发明涉及评价转基因植物生态安全性的方法，具体地说，涉及 评价环境单因素对转基因植物基因漂移影响的方法。

背景技术

在转基因植物大面积商品化的同时，其生态安全性等方面问题也 在世界范围内引起了广泛的争议和关注。转基因植物基因漂移的途径 理论上大致有两个：一是通常意义上的基因漂移，主要是通过有性杂 交的方式使基因在同一物种的群体之间或是可进行交配的近缘种之 间转移的现象，按照媒介不同，大致包括花粉介导、种子介导和无性 繁殖器官介导的基因漂移；二是基因水平上的转移，这是指通过非有 性生殖的方式使基因在不同物种个体之间转移的现象，这一般可能是 发生在非同种生物之间，如外源基因通过植物与微生物(细菌、真菌、 病毒等)间在自然界中发生基因转移。而在所有的基因漂移途径中， 花粉介导的基因漂移因其作用范围广，控制条件差，生态风险高，因 此是转基因植物风险性评价体系中的重要评价环节和试验重点。目前 的转基因植物风险性评价体系中主要通过大田试验来确定转基因植 物花粉漂移的影响因素和距离。普遍使用的是wagon-wheel的模式。 图1为田间常用的检测基因漂移的wagon-wheel模式，图中心区域为转 基因植物种植区，周围种植常规品种，F1代取样点多呈米字形或是车 轮状排布(Yunsu Shi，2008；仿Paul G.Johnson，2006)。即是以一定 面积的转基因植物为中心，周围放射性种植常规品种，经过一代的杂 交，之后多以“米”字形或车轮状取样，检测F1代，试验重复两年及 以上。

wagon-wheel种植模式是目前最广泛使用的田间转基因植物风险 性评价的试验方法。试验设计中常规品种种植区域一般设置其延伸距 离远远大于花粉可能传播的理论值，一定程度上保证了含有外源基因 的花粉无法传至试验地以外区域。同时具有F1代样本量大，试验结果 可信性高的优点。“米”字形的各个方向可以互为对照用以确定误差 范围和显著性水平。若是结合当地气象数据，可以部分推测出环境因 素对花粉漂移距离的影响，比如王天宇等2001年的研究表明，气候条 件中影响基因漂移频率可见的主要因素是风，在试验条件下顺、逆风 基因漂移的频率相差2倍多。

wagon-wheel模式虽然具有数据结果分析明确，试验过程中对环 境风险性较低的优点，但试验占用空间大，耗费周期长，且不能完全 杜绝试验中含有外源基因的花粉向周围环境传播的可能性。而且试验 结果是试验地综合环境因子的影响结果。因此，在不同地域的田间试 验结果也不尽相同，以棉花为例：张宝红等研究认为，转基因棉花花 粉最远传播距离可达50m(张宝红，2000)；而沈法富等研究表明， 转Bt基因陆地棉花粉最远传播距离为36m；转Bt基因海岛棉花粉最远 传播距离可达72m(沈法富，2001)，张长青等则认为100m的隔离距 离才可以使转基因逃逸的频率降为零(张长青，1997)。

本发明通过使用温室，进行密闭条件下的试验，从根本上杜绝了 试验用转基因植株花粉向外环境扩散的问题，提高了试验的安全性。 同时因不用设置远远超过花粉传播距离的常规品种区域，占用空间 小。wagon-wheel法虽然一定程度上可以推测出环境因素对花粉漂移 的影响，但内容模糊，且数据为环境多因素混合作用的结果，趋势描 述不清晰。而本发明通过人工模拟提取了自然环境中对基因漂移可能 存在影响的因子，拆分自然环境，进行单一因素下的基因漂移试验， 可以充分确定单一因素对基因漂移的影响程度，解决了大多试验结果 不一，一片试验田仅能对其相近自然环境的地域提供参考值的特点， 在结合不同地域环境因素的实际测量值之后，可以更好的确定当地影 响基因漂移的主要因素，并对转基因植物的种植制定有效预案，一定 程度上减少了试验重复次数，节约试验成本。同时，与wagon-wheel 的大量样点F1代取样分析不同，本发明这种封闭式的试验方法，占用 空间少，F1代取样量降低，大大降低了试验后期检测、分析的工作量。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价环境单因素对转基因植物基因漂 移影响的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种评价环境单因素对转基因植 物基因漂移影响的方法，其包括步骤：

1)温室种植模式的建立：在温室两侧设置保护行，温室中部一 侧为转基因植物种植区，另一侧为常规植物种植区，转基因植物种植 区和常规植物种植区分别与温室两侧的保护行相连，转基因植物种植 区和常规植物种植区相连，不留空隙；

2)环境单因素的作用：在植物开花期施以环境单因素；

3)常规植物F1代的取样：待植物开花期结束后，去除环境单因 素，沿转基因植物种植区至常规植物种植区的线性方向上取样常规植 物F1代，第一个样点位于与转基因植物相连的常规植物第一排，第二 个样点与第一个样点相邻，之后每个样点间的距离逐渐递增，直至与 保护行相接处；

4)基因漂移的检测：对3)中各样点的F1代进行分析，检测F1 代中是否存在外源基因，确定环境单因素作用对基因漂移频率、距离 影响的数据，为基因漂移数学模型的建立打下基础。

前述的方法，其中所述的常规植物种植区所种植的植物中不含有 转基因植物种植区所种植的转基因植物中转入的外源基因。

前述的方法，其中所述的常规植物种植区所种植的植物包括转基 因植物种植区所种植的转基因植物转入外源基因前的母本、该转基因 植物的同种或与该转基因植物存在杂交可能性的不同种植物。

前述的方法，其中所述环境单因素包括风力因素或昆虫传粉因 素。

前述的方法，其中所述保护行为常规植物种植区所种植的植物品 种。

具体地，本发明是通过使用日光温室种植达到转基因植物安全性 评价的效果。本发明技术方案使用3个日光温室，种植模式均为温室 两侧设置保护行，排除边缘对试验结果潜在的影响。温室中部一侧为 转基因植物种植区，因基因漂移距离与转基因植物播种面积有关，本 发明技术方案中的转基因植物种植区域根据试验内容和对象的不同 其大小可调。温室中部另一侧为常规植物种植区，即种植不含外源转 入基因的植物。常规植物多选用转基因植株转入外源基因前的母本， 转基因植物的同种及存在杂交可能性的不同种植株。3个温室分别作 如下处理：

(一)温室1仅达到封闭效果，无特殊处理，作为对照使用，营 造无风无传粉昆虫的环境条件。图2所示为对照组温室种植模式：温 室两侧设置保护行；温室中部一侧为转基因植物种植区，另一侧为常 规植物种植区；各个种植区域间紧密贴合，不留空隙。

(二)温室2为人工风力种植区，其中的风力因素由多台电风扇 接力排布进行吹风来完成，使得从转基因植物种植区至常规植物种植 区存在连续单向的气流。目的是通过与对照组比较，测量风力因素在 基因漂移过程中的作用。图3所示为人工风力种植区温室设计，其种 植模式与对照组相同，仅在温室中装入多台单一方向的电风扇，使从 转基因植物种植区至常规植物种植区存在连续单向的气流。

(三)温室3通过使用传粉昆虫，达到评价传粉昆虫在转基因植 物基因漂移中作用的效果。温室的种植模式也与对照组相同，仅在转 基因植物种植区域中间放置传粉昆虫，传粉昆虫品种是根据温室内种 植的植株选取，多为蜜蜂。旨在测量传粉昆虫在基因漂移过程中的作 用。图4所示为传粉昆虫种植区温室设计，整个温室布局与对照组相 同，只在转基因植物种植区中放入传粉昆虫。

田间取样与wagon-wheel模式中取样距离相似，但仅为线性取样。 取样方向仅为转基因植物种植区至常规植物种植区的线性方向上。根 据目前已知的基因漂移试验数据可知，与转基因植物种植区相距越 近，基因漂移频率越高。由此在取样位点的设置上第一个样点位于与 转基因植物紧密相连的常规植物第一排，第二个样点与之紧密相邻， 多为第二排，其后的样点间距逐渐拉开，直至与保护行相接处，如图 5所示，样点选择参照wagon-wheel模式。即第一个样点位于与转基因 植物紧密相连的常规植物上，之后每个样点间的距离逐个递加。

本发明通过对3个温室的常规植物F1代取样分析，进行基因水平 或蛋白水平上的检测，充分确定单一因素对转基因植物基因漂移的影 响程度。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

首先，本发明是在封闭式条件下进行的，杜绝了外源基因扩散的 可能性，安全系数高。

其次，与常规大田试验模式相比，占地面积小，人工程度高，试 验重复性优于大田。

再次，本发明仅使用日光温室及电风扇等主材，易于推广。

本发明提供的方法是根据大田数据，在充分研究自然环境中基因 漂移的影响因素后，合理安排规划，提取风、传粉昆虫这种对基因漂 移存在显著影响的因子，通过模仿自然环境，进行单一因素下的基因 漂移试验，测定出单一因素对基因漂移的影响程度，为基因漂移数学 模型的建立打下基础。同时，环境单因素作用对基因漂移频率、距离 影响的数据确立后，再与不同自然地域的环境因素实际测量值结合， 可以更好的确定当地影响基因漂移的主要因素，并对转基因植物的种 植制定有效预案，较之完全在环境因素混合作用下大田试验，无疑适 用范围更广。而且，本发明采用线性取样，较之wagon-wheel的放射 性取样方式，F1代所需分析的样本减少，一定程度上也节约了后期检 测成本。因此，本发明方法在保证安全性的同时，对于不同地域环境 下的基因漂移问题有更大的参考价值，还同时具有节约试验成本等多 方面的特点。

附图说明

图1为检测转基因植物基因漂移的wagon-wheel模式；

图2为本发明对照组温室种植模式：

图3为本发明人工风力种植区温室设计，其中代表风扇；

图4为本发明传粉昆虫种植区温室设计，其中代表一箱蜜蜂；

图5为本发明样点选择参照wagon-wheel模式，其中代表取样 点；

图6为本发明优选实施例转基因抗虫棉风险性评价的温室布局设 计；

图7为本发明优选实施例在风力条件下温室中电风扇的排布，其 中代表风扇；

图8为本发明优选实施例在风力条件下温室中电风扇距离地面的 高度，其中代表风扇；

图9为本发明优选实施例石远321杂交F1代样品总DNA提取后的 琼脂糖凝胶电泳结果示意图；M代表Marker，1-10代表F1代样品提取 的总DNA；

图10为本发明优选实施例PCR检测Bt基因的琼脂糖凝胶电泳结 果示意图；M代表Marker；1-22为F1代样品特异性PCR检测结果；23 为阴性对照，使用石远321亲本；24为阳性对照，使用转基因抗虫棉 SGK321；阳性对照存在条带，阴性对照无条带产生，则结果可信；

图11为本发明优选实施例环境单因素试验对基因漂移影响结果 示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例转基因抗虫棉风险性评价

试验主要测量转双价抗虫基因棉花品种SGK321的抗虫基因漂移 情况。在转基因品种种植区种植SGK321。对于常规棉品种的选用， 选取SGK321的非转基因母本石远321。

温室布局如图6所示，保护行种植常规品种，其中SGK321为转基 因抗虫品种，石远321为非转基因的常规品种。

根据已发表的田间数据，自然条件下转基因棉花的最远基因漂移 距离可能在36米之内，且6米外基因漂移频率低于1％，又因漂移距离 与转基因品种面积正相关，在缩小大田试验中转基因棉花种植面积的 同时，设置常规棉种植径长36m。试验选用长60m，宽8m的日光温室， 转基因种植区域4.5*8m，其余以保护行填充。

在主要测定风力因素的温室中，为保证长达36米的常规棉区存在 自转基因棉区出发的持续、单向气流，选用风程6m的电风扇，隔4.5m 放置一台，共置9台。其中第一台电风扇放入转基因棉区，使含外源 基因的花粉被充分吹动。根据棉花花期高度，电风扇挂于约2m处， 图7为在风力条件下温室中电风扇的排布，其中第一台风扇置于转基 因棉区中，其余每隔4.5m依次排列。图8为在风力条件下温室中电风 扇距离地面的高度，图示风扇挂于距地面2m处，即风扇位置设于棉 区上方，且与棉花顶部相距不远。

棉区管理与常规方法相同。传粉昆虫单因素试验中，因棉花的主 要传粉昆虫是蜜蜂，待花期，测量传粉昆虫对转基因植物基因漂移的 影响。试验方法为在试验用温室内的转基因棉区中央放入一箱蜜蜂， 以达传粉昆虫的释放目的。风力单因素试验则是从转基因种植区开始 设置多台电风扇，风扇排布方式为从转基因向常规棉种植区的线性排 列，达到从转基因向常规棉种植区的持续风力作用。试验起始时间以 转基因棉区开花为准，此时保持电风扇常开状态。同时空白对照组按 照单因素试验的田间规划布局，去除单因素试验温室里的风、蜜蜂因 素。试验起始前将常规棉区已开花朵全部去除，以减免试验干扰因素。 棉花花期约为2个月，待到转基因棉区盛花期已过，去除常规棉区所 有花蕾，单因素风力试验温室关闭电扇，同时单因素传粉昆虫试验温 室移出蜜蜂，此时试验反应终止。

棉区取样与wagon-wheel模式中取样距离相似，但仅为线性取样。 每个品种的取样点按图5走向。取样位点的设置上第一个样点位于与 转基因植物紧密相连的常规植物第一排，第二个样点与之紧密相邻， 为第二排，其后的位点间距逐渐拉开，即在4、8、16、24、32、45 排进行取样，直至与保护行相接处。每个样点上分别自多个植株的上、 中、下部分别摘下棉铃，分别保存脱绒处理。

棉区取得各个样点的F1代种子脱绒后，分开种植，可以从基因 水平上和蛋白水平上联合检测基因漂移的情况。基因水平上通过对 F1代植株的DNA提取及PCR检测以确定外源基因的存在。蛋白水 平上通过制备Bt蛋白抗体，使用ELISA或蛋白试纸条可以检测出 Bt毒蛋白的存在与否，用于确定基因漂移的距离和频率，为基因漂 移数学模型的建立打下基础。具体方法为：

(1)石远321杂交F1代样品总DNA的提取：采用CTAB法进行， 对提取后的总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，样品总 DNA提取效果良好。

(2)F1代DNA的浓度测定及稀释：使用nanodrop2000测定DNA 浓度，并将样本浓度稀释成10-25ng/μl。

(3)使用特异性引物对棉花Bt基因进行PCR检测：

正向引物：5’-GAAGGATTGAGCAATCTCTAC-3’

反向引物：5’-CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’

扩增的目的片段长340bp(王长永，2007)。PCR检测时使用含 有Bt基因的转基因抗虫棉品种SGK321作为阳性对照，不含抗虫基 因的石远321作为阴性对照。图10为PCR检测Bt基因的琼脂糖凝 胶电泳结果示意图，其中23为阴性对照检测结果，24为阳性对照检 测结果。阳性对照存在条带，阴性对照无条带产生，则结果可信。

(4)蛋白试纸条检测：使用蛋白试纸条(购自北京银土地生物技术 有限公司)对PCR检测呈阳性的样品再进行测定。

对石远321杂交F1代样品检测结果如表1所示：

表1不同环境因素作用下基因漂移的检测结果

结果分析：

(1)空白对照区：在隔绝风、蜜蜂等基因漂移环境影响因素的作用 下，棉花基因漂移频率极低，本发明检测结果为0％。

(2)单因素传粉昆虫试验区：基因漂移频率在不同距离的位点波动 性较强，由图11可知，蜜蜂传粉随机性较强，但总体而言距离越长， 漂移频率越高，推测与蜜蜂习性有关，文献显示，蜜蜂传粉距离可达 6km(Allen，2005)。因此，在室内条件下，蜜蜂可能更偏爱远距离 传粉，传粉距离达到试验设置的最远距离。

(3)单因素风力试验区：风力因素的作用结果显示呈部分波动性， 但总体而言，与转基因棉田距离高于6.4m漂移频率显著下降，与大 田wagon-wheel模式所得试验结果相符。最远杂交距离在36m之内， 与田间试验结果相符(沈法富，2001)。

结论：

将环境单因素分离后，通过单因素区域与对照区域试验数据相对 比，可以明确地看出各个环境因素的特质。由此可以确定，传粉昆虫 的试验影响是随机的，风力的影响是随着距离的增加而降低。特别是 与wagon-wheel的大田试验数据相对比，可以确定，造成7m左右基 因漂移频率显著下降的主要环境因素是风力因素，而在36m距离之 外，偶发性存在于大田的杂交F1代，由传粉昆虫造成的可能性较大。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。