用于制备顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的方法

摘要

通常称为肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯(CMO)的顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯被用于治疗骨关节炎和其它关节炎性病症。顺式-9-十四碳烯酸(顺式-9-肉豆蔻烯酸)是用于制备CMO的主要前体。由于对于顺式-9-十四碳烯酸存在有限的天然植物来源，因此本发明的目的在于从油酸甲酯合成顺式-9-十四碳烯酸甲酯。由于油酸不能以纯的形式得到，因此必须从富集油酸的油例如橄榄油中分离油酸。顺式-10-十四碳烯酸甲酯，即顺式-9-十四碳烯酸的异构体，也从十一碳烯酸甲酯，即蓖麻油的衍生物制备。十一碳烯酸可以以纯的形式容易地商购。顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯分别通过顺式-9-十四碳烯酸甲酯和顺式-10-十四碳烯酸甲酯与1-十六烷醇(鲸蜡醇)的酶促酯交换制备。将肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体用于大鼠中的抗关节炎，阻滞炎症和减轻佐剂诱导的关节炎进行评价。

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于制备肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体即顺式 -9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的方法。更具 体地，本发明还涉及两种异构体顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10- 十四碳烯酸十六烷基酯用于在大鼠中阻滞炎症和减轻佐剂诱导的关节炎 的评价。

发明背景

肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯(CMO)是顺式-9-肉豆蔻烯酸十六烷基酯的常用 名。CMO是顺式-9-十四碳烯酸(肉豆蔻烯酸)和1-十六烷醇(鲸蜡醇)的酯。 肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯由于其抗关节炎的性质而是众所周知的。仅在非常有 选择性的数量的动物物种，包括牛，鲸，海狸和小鼠中发现了顺式-9-十四 碳烯酸十六烷基酯。在1972年，国家健康研究所(National Institutes of  Health)的研究者Harry W.Diehl从小鼠中分离了肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯 (Diehl HW，May EL.药物科学杂志(J Pharm Sci)1994；83：296-9)。肉豆蔻 烯酸鲸蜡基酯已经被用于针对哺乳动物中的炎性类风湿关节炎的免疫化 (Diehl，US 4,049,824，Levin，WO 01/41783)，类风湿关节炎的治疗 (Diehl，US 4,113,881)和骨关节炎(Diehl，US 5,569,676)。植物黄油基肉豆 蔻烯酸鲸蜡基酯还被用于治疗骨关节炎和其它肌肉骨骼病症和损伤 (Leonard，US 20030181521)。含有CMO的营养制品被广泛地用于减轻疼 痛炎症，并且除此之外，一项报告提出了cerasomol-CMO在患有纤维组 织肌痛(fibromyalgia)的患者中的正面临床效果(Edwards AM.J.Nutr. Environ.Med.2001；11：105-11)。由于Swiss Albino小鼠是CMO的仅有天 然来源，因此Kenneth等通过用1-十六烷醇将顺式-9-十四碳烯酸 (tertadecenoic acid)(购自商业来源)酯化而通过化学方法合成了纯的顺式-9- 十四碳烯酸十六烷基酯，并且在DBA/1Lac J小鼠中的胶原诱导的关节炎 模型中确认了其抗关节炎性质(Kenneth W.Hunter，Jr.，Ruth A.Gault， Jeffrey S.Stehouwer，Suk-Wah Tam-Chang.药理学研究(Pharmacological  Research)2003；47：43-47)。顺式-9-肉豆蔻烯酸天然地作为在顺式-9-肉豆 蔻烯酸含量为8％的牛脂脂肪(Lord G，WO 00/64436)和具有20-30％的顺 式-9-肉豆蔻烯酸的Pycnanthus Komb的种子脂肪(Leonard，US 20030181521)中脂肪酸与其它脂肪酸的混合物获得。文献研究揭示的是， 不存在报道顺式-9-肉豆蔻烯酸的合成途径。由于顺式-9-肉豆蔻烯酸的天然 可获得性是不足的，因此本发明首次报道了从油酸甲酯的合成途径。由于 难以从任何植物油来源分离纯油酸，因此本发明首次报道了从可商购原料 即十一碳烯酸合成新的异构体顺式-10-肉豆蔻烯酸。然后通过将顺式-10- 肉豆蔻烯酸甲酯和顺式-9-肉豆蔻烯酸甲酯分别与鲸蜡醇进行酯交换以制 备肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯，并且关于抗炎症和抗关节炎活性进行评价。将新 的异构体即顺式-10-肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的抗炎症和抗关节炎性质与含有 如上所述制备的顺式-9-肉豆蔻烯酸的已知CMO的抗炎症和抗关节炎性质 进行比较。

合成途径的第一步骤是从油酸合成顺式-9-肉豆蔻烯酸。油酸不能以纯 的形式得到，并且必须通过采用例如脲加合或分馏蒸馏的方法而从富集油 酸的油例如橄榄油制备。由于从天然来源分离纯油酸非常昂贵，基于顺式 -9肉豆蔻烯酸的肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的成本也非常高。因此，需要辨别用 于CMO的制备的肉豆蔻烯酸的备选来源。令人惊奇地，在关于顺式-9肉 豆蔻烯酸的化学合成或用于CMO的制备的任何其它备选原料的方向没有 报道很多工作。考虑到这些，本发明研究了用于制备肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯 的肉豆蔻烯酸的备选异构体的合成的可能性。在此方向上的一种吸引人的 底物是用于顺式-10肉豆蔻烯酸的制备的10-十一碳烯酸。10-十一碳烯酸 是蓖麻油脂肪酸甲酯(蓖麻醇酸甲酯)的热解产物并且可以以纯的形式大量 商购。在本发明中，从油酸甲酯和十一碳烯酸甲酯制备顺式-9肉豆蔻烯酸 的甲酯和顺式-10肉豆蔻烯酸的甲酯的异构体(3和7)，并且将其与鲸蜡醇 进一步酯交换，以得到顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四碳 烯酸十六烷基酯8。将顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四碳 烯酸十六烷基酯8关于抗关节炎性质进行评价，并且发现，顺式-10-十四 碳烯酸十六烷基酯8在大鼠中在抑制炎症方面比得上顺式-9-十四碳烯酸 十六烷基酯4并且在佐剂诱导的关节炎方面有效。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种用于制备肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种 异构体即顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯 的方法。

本发明的再另一个目的是两种异构体顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯 和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯用于在大鼠中阻滞炎症和减轻佐剂诱导 的关节炎的评价。

发明概述

因此，本发明提供一种用于制备肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体即 顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的方法， 以及两种异构体顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六 烷基酯用于在大鼠中阻滞炎症和减轻佐剂诱导的关节炎的评价。

在本发明的一个实施方案中，提供一种用于制备具有通式1的肉豆蔻 烯酸鲸蜡基酯的两种异构体即顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十 四碳烯酸十六烷基酯的方法，

通式1

其中n＝7或8    其中m＝3或2

所述方法包括下列步骤：

a.在有机溶剂的存在下，在-70至-78℃之间的温度范围，将选自由油 酸甲酯和十一碳烯酸甲酯组成的组中的酯冷却；

b.通过将臭氧鼓泡60至90min的时间，将冷却的酯臭氧分解；

c.用二甲硫(DMS)猝灭反应，随后在25至35℃之间范围内的温度搅 拌6至8hr的时间；

d.在真空下从在步骤(c)中得到的反应混合物中蒸发溶剂和DMS，以 得到取决于在步骤(a)中使用的酯而含有1-醛壬酸甲酯(1-al-methyl nonoate) 或1-醛癸酸甲酯(1-al-methyl deaconate)的粗制固体；

e.将在步骤(d)中得到的含有1-醛烷酸甲酯(1-al-methylalkyloate)的粗 制固体溶解在干燥THF(四氢呋喃)中；

f.同时地，将选自由正戊基三苯基盐和正丁基三苯基盐组成的组 的三苯基膦盐溶解在干燥的THF中，并且冷却至在0至5℃之间范围内的 温度，随后添加正丁基锂；

g.将在步骤(f)中得到的反应混合物搅拌30至60min的时间，以得到 橙色溶液；

h.将在步骤(e)中得到的在干燥THF中的粗制固体溶液加入到在步骤 (f)中得到的在干燥THF中三苯基膦盐溶液中，随后回流3至8小时的时 间；

i.在减压下从在步骤(h)中得到的反应混合物移去THF，以得到残留 物；

j.向在步骤(i)中得到的残留物中加入水，随后用醚萃取；

k.在真空下移去醚以得到残留物，随后使用采用己烷和乙酸乙酯 (98∶2)作为洗脱液的柱色谱法进行纯化，以取决于在步骤(a)中使用的酯和 在步骤(f)中使用的三苯基膦盐而得到顺式-9-肉豆蔻烯酸酯和顺式-10-肉豆 蔻烯酸酯；

l.在选自由固定化脂肪酶TL IM和Novozyme 435组成的组中的酶的 存在下，在65至70℃范围内的温度，将在步骤(k)中得到的肉豆蔻烯酸酯 与鲸蜡醇酯交换8至10小时的时间；

m.通过过滤分离酶并且蒸发溶剂以得到具有肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的 相应异构体的粗制产物；

n.通过柱色谱法纯化在步骤(l)中得到的粗制产物，以得到式1的纯肉 豆蔻烯酸鲸蜡基酯。

在本发明方法的另一个实施方案中，其中在步骤(a)中使用的溶剂为二 氯甲烷或氯仿。

在本发明的另一个实施方案中，在步骤(a)中使用的油酸甲酯和在步骤 (f)中使用的正戊基三苯基盐用于制备顺式-9-十四碳烯酸酯。

在本发明的另一个实施方案中，在步骤(a)中使用的十一碳烯酸甲酯和 在步骤(f)中使用的正丁基三苯基盐用于制备顺式-10-十四碳烯酸酯。

在本发明的另一个实施方案中，顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯的收率 在88-95％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯的纯度 在92-95％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的收 率在80-90％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的纯 度在90-95％的范围内。

在本发明的另一个实施方案中，将所制备的所述异构体顺式-9-十四碳 烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯关于在大鼠中阻滞炎症 和减轻佐剂诱导的关节炎进行评价。

在本发明的另一个实施方案中，异构体顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯 和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯用于阻滞炎症和减轻佐剂诱导的关节炎 的用途。

在本发明的另一个实施方案中，异构体用于阻滞炎症的用途，其中在 剂量为400mg/kg体重的情况下，与处于对照组相比，异构体顺式-9-十四 碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯有效地将动物的炎症 和水肿同等地减轻多达36％。

在本发明的另一个实施方案中，异构体用于减轻佐剂诱导的关节炎活 性的用途，其中在100mg/kg体重的剂量的情况下，异构体顺式-9-十四碳 烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯有效地将关节炎同等地 减轻多达10至15％。

在本发明的另一个实施方案中，异构体用于抗关节炎活性的用途，其 中异构体顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯对于80％的大鼠是21天内有效， 而对于20％的大鼠是32天内有效。

附图简述

图1：方案1：顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯的制备

图2：方案2：顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的制备

图3：顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯(顺式-9 CMO)和顺式-10-十四碳 烯酸十六烷基酯(顺式-10 CMO)的抗炎活性

图4：顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯(顺式-9 CMO)和顺式-10-十四碳 烯酸十六烷基酯(顺式-10 CMO)对关节炎大鼠的效果

图5：顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯(顺式-10 CMO)的抗关节炎潜 能

发明详述

本发明涉及根据方案1和方案2的肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体 即顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8的 合成。CMO的主要组分是顺式-9肉豆蔻烯酸，并且其与其它脂肪酸一起 从选择性的天然来源分离。文献揭示的是，不存在可以提供纯的顺式-9肉 豆蔻烯酸的来源。用于解决此问题的唯一方案是其从油酸开始的化学合 成。由于从天然来源如橄榄或任何其它的植物油分离纯的油酸非常昂贵， 因此基于顺式-9肉豆蔻烯酸的肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的成本也将非常高。因 此，需要辩识用于制备CMO的肉豆蔻烯酸的备选来源。在此方向上的一 种吸引人的底物是用于顺式-10肉豆蔻烯酸的制备的10-十一碳烯酸。10- 十一碳烯酸是蓖麻油脂肪酸甲酯(蓖麻醇酸甲酯)的热解产物并且可以以纯 的形式商购。因此，在本发明中，分别从油酸甲酯和十一碳烯酸甲酯制备 两种异构体即顺式-9-十四碳烯酸甲酯3和顺式-10-十四碳烯酸甲酯7的合 成。3和7的合成涉及用于得到1-醛壬酸甲酯2和1-醛癸酸甲酯6的油酸 甲酯和十一碳烯酸甲酯的臭氧分解(Santiago de la Moya等.四面体通讯 (Tetrahedron Letters)2005；46：5157-5159)。将这些醛与根据Peter等[Peter  Vinczer，Gabor Baan，Zoltan Juvancz，Lajos Novak和Csaba Szantay，合 成通讯(Synthetic Communications)1985；15(14)：1257-1270]制备的正戊基 溴和正丁基溴的三苯基膦盐一起进行维蒂希(Wittig)反应[Marco Appel， Steffen Blaurock，Stefan Berger.Eur.J.Org.Chem.2002；1143-1148]以得到 顺式-9-肉豆蔻烯酸酯3和顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7，并且在使用固定化脂 肪酶TL IM(lipozyme TL IM)的情况下与鲸蜡醇一起进行酶促酯交换， 以得到顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯 8。对这两种化合物进行抗关节炎性质评价，并且发现顺式-10-十四碳烯酸 十六烷基酯8在大鼠中在抑制炎症方面比得上顺式-9-十四碳烯酸十六烷 基酯4并且在大鼠中佐剂诱导的关节炎方面有效。

如方案1中所示进行顺式9-十四碳烯酸十六烷基酯4的合成，其包括 使用二氯甲烷作为溶剂，在-78摄氏度进行油酸甲酯1[通过油酸(＞98％纯 度)与2％硫酸/甲醇的酯化而制备]的臭氧分解1小时。将反应用二甲硫 (DMS)猝灭并且继续搅拌6小时。从反应混合物中蒸发溶剂和DMS并且 在真空下干燥。这样得到的产物富含1-醛壬酸甲酯2和1-壬醛 (1-nonanal)(C-9醛)，并且将其与正戊基溴的三苯基膦盐一起在正 -BuLi/THF进行维蒂希(Wittig)反应，以得到收率为55-65％并且纯度为 66-70％的顺式-9-肉豆蔻烯酸酯3。使用1，3-特异性或非特异性脂肪酶如固 定化脂肪酶TL IM(疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa))和 Novozyme 435(南极假丝酵母(Candida antarctica))，将顺式-9-肉豆蔻烯酸 酯3与鲸蜡醇在65℃至70℃进行酯交换8小时，以得到收率为88-95％并 且纯度为92-95％的顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4。所有产物的纯度通过 GC检查并且结构通过GC-MS，IR和¹H NMR确认。

如方案2中所示进行顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8的合成，使用 二氯甲烷作为溶剂在-78℃进行10-十一碳烯酸甲酯5(＞99％纯度)的臭氧分 解1小时。将反应用二甲硫(DMS)猝灭并且继续搅拌6小时。从反应混合 物中蒸发溶剂和DMS并且在真空下干燥，以90％收率得到1-醛癸酸甲酯 6。将粗制醛6与正丁基溴的三苯基膦盐一起在正-BuLi/THF中进行维蒂希 (Wittig)反应，得到收率为65-68％并且纯度为75-78％的顺式-10-肉豆蔻烯 酸酯7。使用固定化脂肪酶TL IM，将顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7与鲸蜡醇 在65℃至70℃进行酯交换8小时，得到收率为88-90％并且纯度为90-95％ 的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8。所有产物的纯度均通过GC检查并且 结构通过GC-MS，IR和¹H NMR确认。

肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体(4和8)的抗炎活性潜能使用 Winter等(Winter CA，Risley EA和Nuss GW，J.Pharmacolo.Exp.Ther. 1963；141：369-376)的方法在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中进行初 步评价。通过将弗氏完全佐剂注射到Wistar大鼠中而诱发的关节炎几乎与 人类的风湿性关节炎相似。因此，使用Pearson等(Pearson CM，Proc.Soc. Exper.Biol.Med.1953；91：95-101)的方法进行对抗关节炎活性的进一步 研究。对肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体的抗关节炎性质的研究进行评 价，并且发现，顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8在大鼠中抑制炎症和减 轻佐剂诱导的关节炎方面比得上顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4。

实施例：1

顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯的制备：

根据方案1进行顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4的制备。将在二氯甲 烷(100ml)中的油酸甲酯1(12.0g，0.0314mol)冷却至-78摄氏度，并且将 臭氧气体鼓泡到反应混合物中，历时1小时。在反应以后，通过加入二甲 硫(DMS，8ml)将反应猝灭并且在25℃搅拌6小时。在真空下移去溶剂并 且将所得到的残留物2(4.25g，0.022mol)直接用于制备顺式-9-肉豆蔻烯 酸酯3。将正戊基三苯基盐(11.16g，0.027mol)装入到50ml干燥THF 中并且冷却至0℃。向此浆液中，加入正丁基锂(17.0ml，在己烷中为1.6 M)，将反应混合物搅拌0.5小时以得到橙色溶液。将溶解在干燥THF(20ml) 中的含有1-醛壬酸甲酯的粗制产物2(5.0g，0.027mol)缓慢加入到以上 内含物中，并且使反应混合物达到25℃，然后加热至回流温度以回流4 小时。通过TLC监测反应并且在反应完全以后，在减压下从反应混合物 中移去THF，并且向残留物中加入蒸馏水825ml)，并且用醚萃取(25ml X 3次)。将合并的醚层在无水硫酸钠上干燥并且移去溶剂，并在真空下干燥， 得到残留物，并且使用己烷和乙酸乙酯(98∶2)作为洗脱液通过柱色谱法纯 化，以65％收率得到通过GC测量的66％纯度的顺式-9-肉豆蔻烯酸酯3(4.2 g，0.0175mol)。在固定化脂肪酶TL IM(0.930g，总底物的10重量％)的 存在下，将顺式-9-肉豆蔻烯酸酯3(4.2g，0.0175mol)与鲸蜡醇(5.08g， 0.021mol)一起在68℃进行酶促酯交换8小时。通过TLC监测反应并且在 反应完成以后，加入己烷(50ml)并且通过过滤分离脂肪酶，并且蒸发溶剂 以得到粗制产物，通过柱色谱法纯化，以95％收率得到GC测量的92％纯 度的顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4(7.48g，0.0166mol)。顺式-9-十四碳 烯酸十六烷基酯4的结构通过¹HNMR，IR和GC-MS确认。

光谱数据：

¹H NMR：(600MHz，CDCl₃)：δ5.36-5.33(m，2H，J＝3Hz， -CH＝CH-)，4.01(t，2H，)，2.25(t，2H，)，1.99 (m，4H，-CH₂-CH＝CH-CH₂-)，1.60(m，4H， -CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-)，1.30-1.20(br，d，38H， -CH₂-CH₂-CH₂-)，0.90(q，6H，-CH₂-CH₃)。

IR (纯/NaCl)：2926，1738，1654，1242，721Cm^-1。

GC-MS：m/z：C₃₀H₅₈O₂(M⁺)：450。

实施例2

顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯的制备：

在68℃，在Novozyme 435(0.930g，总底物的10重量％)的存在下， 将顺式-9-肉豆蔻烯酸酯3(4.2g，0.0175mol)与鲸蜡醇(5.08g，0.021mol) 一起进行酶促酯交换8小时。通过TLC监测反应并且在反应完成以后， 加入己烷(50ml)并且通过过滤分离脂肪酶，并且蒸发溶剂以得到粗制产 物，并且通过柱色谱法纯化，以90％收率得到通过GC测量的90％纯度的 顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4(7.48g，0.0166mol)。顺式-9-十四碳烯酸 十六烷基酯4的结构通过¹HNMR，IR和GC-MS确认。

光谱数据：

¹H NMR：(600MHz，CDCl₃)：δ5.36-5.33(m，2H，J＝3Hz， -CH＝CH-)，4.01(t，2H，)，2.25(t，2H，)，1.99 (m，4H，-CH₂-CH＝CH-CH₂-)，1.60(m，4H， -CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-)，1.30-1.20(br，d，38H， -CH₂-CH₂-CH₂-)，0.90(q，6H，-CH₂-CH₃)。

IR纯/NaCl)：2926，1738，1654，1242，721Cm^-1。

GC-MS：m/z：C₃₀H₅₈O₂(M⁺)：450。

实施例：3

顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的制备：

根据方案2进行顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8的制备。将在二氯 甲烷(150ml)中的十一碳烯酸甲酯5(10.21g，0.0515mol)冷却至-78℃， 并且将臭氧气体鼓泡到反应混合物中，历时1小时。通过加入二甲硫(DMS， 5ml)将反应猝灭并且在25℃搅拌6小时。在真空下移去溶剂并且将所得 到的残留物6直接用于制备顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7。将溴化正丁基三苯 基盐(10.0g，0.0251mol)装入到干燥THF(50ml)中并且冷却至0℃。向 此浆液中，加入正丁基锂(17.0ml，在己烷中为1.6M)，并且搅拌0.5小 时。将溶解在干燥THF(50ml)中的含有1-醛癸酸甲酯的粗制产物6(5.01 g，0.025mol)缓慢加入到以上内含物中，并且使反应混合物温热至室温， 然后加热至回流温度以回流4小时。在减压下从反应产物中移去THF，并 且向残留物中加入蒸馏水(25ml)，并且用醚萃取(25ml X 3次)。将合并的 醚层在无水硫酸钠上干燥，蒸发溶剂并在真空下干燥，以得到产物，并且 进一步通过使用己烷和乙酸乙酯(98∶2)作为洗脱液的柱色谱法纯化，以 56％收率得到通过GC测量的97％纯度的顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7(3.35g， 0.014mol)。在固定化脂肪酶TL IM(0.745g，总底物的10重量％)的存在 下，将顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7(3.35g，0.014mol)与鲸蜡醇(4.07g，0.0168 mol)一起在65℃进行酶促酯交换8小时。过TLC监测反应并且在反应完 成以后，加入己烷(50ml)并且通过过滤分离脂肪酶，并且蒸发溶剂以得到 粗制产物，并且通过柱色谱法纯化，以88％收率得到通过GC测量的95％ 纯度的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8(5.55g，0.0123)。顺式-10-十四碳 烯酸十六烷基酯8的结构通过¹H NMR，IR和GC-MS确认。

光谱数据：

¹H NMR(600MHz，CDCl₃)：δ5.30(m，2H，-CH＝CH-)，4.01(t，2H， )，2.25(t，2H，)，2.0(m，4H， -CH₂-CH＝CH-CH₂-)，1.60(m，4H，-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-)，1.30- 1.20(br，d，38H，-CH₂-CH₂-CH₂-)，0.90(q，6H，-CH₂-CH₃)。

IR(纯/NaCl)：2926，1738，1654，1242，721Cm^-1。

GC-MS：m/z：C₃₀H₅₈O₂(M⁺)：450。

实施例4

顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的制备：

在65℃，在Novozyme 435(0.745g，总底物的10重量％)的存在下， 将顺式-10-肉豆蔻烯酸酯7(3.35g，0.014mol)与鲸蜡醇(4.07g，0.0168 mol)一起进行酶促酯交换8小时。通过TLC监测反应并且在反应完成以后， 加入己烷(50ml)并且通过过滤分离脂肪酶，并且蒸发溶剂以得到粗制产 物，并且通过柱色谱法纯化，以80％收率得到通过GC测量的90％纯度的 顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8(5.55g，0.0123)。顺式-10-十四碳烯酸十 六烷基酯8的结构通过¹H NMR，IR和GC-MS确认。

光谱数据：

¹H NMR(600MHz，CDCl₃)：δ5.30(m，2H，-CH＝CH-)，4.01(t，2H， )，2.25(t，2H，)，2.0(m，4H， -CH₂-CH＝CH-CH₂-)，1.60(m，4H，-CH₂-CH₂-CH＝CH-CH₂-CH₂-)，1.30- 1.20(br，d，38H，-CH₂-CH₂-CH₂-)，0.90(q，6H，-CH₂-CH₃)。

IR(纯/NaCl)：2926，1738，1654，1242，721Cm^-1。

GC-MS：m/z：C₃₀H₅₈O₂(M⁺)：450。

实施例5

顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯关 于抗炎潜能的评价研究：

对以上在方案1和方案2中示例的合成制备的顺式-9-十四碳烯酸十六 烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8进行针对角叉菜聚糖诱导的 爪水肿模型的抗炎潜能评估。将大鼠分为4组。将顺式-9-十四碳烯酸十六 烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8以400mg/kg的剂量对在不 同的两个组中的大鼠腹膜内给药。另一测试组以10mg/kg的剂量接受吲哚 美辛，其被用作参比标准。对照组单独接受赋形剂。在测试化合物给药之 后一小时，将角叉菜聚糖(1％，0.1ml)注射到所有组中的动物的足底区域 中。在注射角叉菜聚糖之前，使用体积描记器测量爪体积。在角叉菜聚糖 给药以后3小时再次测量爪体积。通过测量爪体积相对于在对照组中的平 均爪体积的抑制而估计顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四 碳烯酸十六烷基酯8的抗炎潜能。发现与对照组相比，顺式-9-十四碳烯酸 十六烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8都将动物的炎症和水肿 同等地减轻了多达36％(图3)。

实施例：6

顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯对 关节炎大鼠的效果：

将以上在方案1和方案2中示例的合成得到的顺式-9-十四碳烯酸十六 烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8在大鼠中的弗氏完全佐剂诱 导的关节炎模型中的抗关节炎潜能进行评价。将雄性Wistar大鼠分成4组， 每组包括6只大鼠。通过下列方法在所有组中的大鼠中诱导关节炎：通过 在右后爪的足底区域进行注射，而以1mg/只大鼠的剂量给药完全弗氏佐 剂(Complete Freund’s Adjuvant)(CFA)。每隔一天对两个爪进行爪体积测量， 直至14天，并且直至发展成完全的关节炎。从第14天至第22天给药顺 式-9-十四碳烯酸十六烷基酯4(100mg/kg/天)，顺式-10-十四碳烯酸十六烷 基酯8(100mg/Kg/天)和吲哚美辛(2.5mg/Kg/天)。对于在所有组中的所有 大鼠，从第15天至第22天每天再测量爪体积。相对于对照组计算治疗组 中的关节炎的抑制百分比(图4)。发现的是，顺式-9-十四碳烯酸十六烷基 酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8在100mg/kg的剂量的情况下， 将爪体积和与关节炎相关的症状同等地减轻多达10至15％，并且当剂量 从100mg/kg增加到300mg/kg时，此抑制是剂量依赖性的，这表明顺式 -9-十四碳烯酸十六烷基酯4和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8在减轻与 确定的关节炎相关的症状方面是有用的。

实施例：7

顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯对于大鼠中的抗关节炎潜能的评价：

将在以上方案2中示例的合成制备的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯 8对重量为150至180g的雄性大鼠进行肠胃外给药，具体地，通过腹膜 内途径给药，该给药是在单独给药或在相容的药用载体如植物油即花生、 芝麻和棉籽中(用于调节一种或多种活性化合物的剂量体积)给药。应当指 出，矿物油的使用不是强制性的，因为所述活性化合物本身是油。如在 (Vogel药物发现和评价药物试验(Vogel’s Drug Discovery and Evaluation  Pharmacological assays)，第二版，2002，Springer Verlag，第802-803页) 中描述的程序如下。将雄性Wistar大鼠分成1个对照组和两个治疗组。三 个组中的所有动物都接受弗氏完全佐剂(1mg/大鼠)。将这天指定为第1 天。在24小时的时间以后，将顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8以300 mg/kg的剂量给药于1个治疗组并且另一个治疗组接受2.5mg/kg吲哚美 辛(用作标准药物)。继续定量给药15天(图3)。对照组接受没有任何药物 的赋形剂(矿物油)。每隔一天测量爪体积(左边的和右边的)。

如通过爪体积的增加所指示的，对照组中的所有大鼠都患有严重的多 关节炎。然而，用顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8治疗的大鼠受到保护， 从而免受多关节炎。在顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯治疗的组中的动物 的约80％在21天的时间内免受关节炎的发展。余下的20％大鼠在32天的 时间内免受关节炎的影响。还发现顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯8针对 关节炎保护的有效范围为0.1至1.0gm/kg体重的动物。然而，发现比此范 围或少或多的剂量也保护大鼠中的弗氏完全佐剂诱导的多关节炎的发展。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于制备具有通式1的肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的两种异构体即 顺式-9-十四碳烯酸十六烷基酯和顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯的方法，

通式1

其中n＝7或8    其中m＝3或2

所述方法包括下列步骤：

a.在有机溶剂的存在下，在-70至-78℃之间的温度范围，将选自由油 酸甲酯和十一碳烯酸甲酯组成的组中的酯冷却；

b.通过将臭氧鼓泡60至90min的时间，将冷却的酯臭氧分解；

c.用二甲硫(DMS)猝灭反应，随后在25至35℃的温度搅拌6至8hr 的时间；

d.在真空下从步骤(c)所得到的反应混合物中蒸发有机溶剂和DMS， 从而取决于在步骤(a)中使用的酯而得到含有1-醛壬酸甲酯或1-醛癸酸甲 酯的粗制固体；

e.将步骤(d)中得到的含有1-醛壬酸甲酯或1-醛癸酸甲酯的粗制固体 溶解在干燥THF(四氢呋喃)中；

f.同时地，将选自由正戊基三苯基盐和正丁基三苯基盐组成的组 中的三苯基膦盐溶解在干燥THF中，并且冷却至在0至5℃的温度，随后 添加正丁基锂；

g.将步骤(f)中得到的反应混合物搅拌30至60min的时间，以得到橙 色溶液；

h.将步骤(e)中得到的在干燥THF中的粗制固体溶液加入到在步骤(f) 中得到的在干燥THF中的三苯基膦盐溶液中，随后回流3至8小时的时 间；

i.在减压下从步骤(h)所得到的反应混合物中移去THF，以得到残留 物；

j.向步骤(i)所得到的残留物中加入水，随后用醚萃取；

k.在真空下移去醚以得到残留物，随后使用采用己烷和乙酸乙酯 (98∶2)作为洗脱液的柱色谱法进行纯化，从而取决于在步骤(a)中使用的酯 和在步骤(f)中使用的三苯基膦盐而得到顺式-9-肉豆蔻烯酸酯和顺式-10-肉 豆蔻烯酸酯；

l.在选自由固定化脂肪酶TLIM和Novozyme 435组成的组中的酶的 存在下，在65至70℃范围内的温度，将步骤(k)所得到的肉豆蔻烯酸酯与 鲸蜡醇酯交换8至10小时的时间；

m.通过过滤分离酶并且蒸发溶剂以得到具有肉豆蔻烯酸鲸蜡基酯的 相应异构体的粗制产物；

n.通过柱色谱法纯化步骤(l)中得到的粗制产物，以得到式1的纯肉豆 蔻烯酸鲸蜡基酯。

2.根据权利要求1的步骤(a)中所述的方法，其中在步骤(a)中使用的 有机溶剂为二氯甲烷或氯仿。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的油酸甲酯和 在步骤(f)中使用的正戊基三苯基盐用于制备顺式-9-十四碳烯酸酯。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的十一碳烯酸 甲酯和在步骤(f)中使用的正丁基三苯基盐用于制备顺式-10-十四碳烯酸 酯。

5.根据权利要求1的通式1所述的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯， 其用于治疗炎症和佐剂诱导的关节炎。

6.根据权利要求1的通式1所述的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯， 其用于以400mg/kg体重的剂量治疗动物的炎症和水肿多达36％。

7.根据权利要求1的通式1所述的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯， 其用于以100mg/kg体重的剂量减轻关节炎多达10至15％。

8.根据权利要求1的通式1所述的顺式-10-十四碳烯酸十六烷基酯， 其用于阻滞炎症和减轻佐剂诱导的关节炎，并且对于80％的大鼠是21天 内有效，而对于20％的大鼠是32天内有效。