检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法

摘要

本发明公开了一种检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法，该方法在同一个反应体系中进行酶切富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应来分别检测E746_A750del缺失突变和L858R点突变，其将酶切突变富集PCR和ARMS荧光定量PCR整合在一起，通过有效的温度和时间控制，经一个反应程序即可完成酶切突变富集和ARMS荧光定量PCR反应。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术。

背景技术

肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病，目前国内外肺癌的发病率和死亡率还在不断上升。肺癌的治疗效果多年来一直没有显著提高，总的治愈率仅为10％左右，其原因一方面由于其生物学特性十分复杂、恶性程度高且多药耐药。另一方面关键还在80％以上的肺癌在确诊时已属晚期。晚期非细小性肺癌的传统治疗方法是以化疗为主的综合治疗，近年来虽然不断有新型的化疗药物被发现，但是其疗效没有明显的提高。一种新型的靶向治疗药物易瑞莎(Iressa)是一种选择性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，因其疗效好、副作用小，在全世界范围内应用开来。

研究表明表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与肺癌病人对抗肿瘤药物易瑞莎(Iressa)的敏感性有关。而肺癌的前期临床试验表明，在含铂类药物联合化疗失败后，易瑞莎仍有25％-35％的客观有效率，疾病控制率在50％左右，中位生存期约为7个月左右，受试者的症状改善且安全性良好，所以EGFR基因突变检测对于临床医生进行肺癌的个体化治疗具有重要的参考价值。Lynch等对用易瑞莎有效的、无效的和未用Iressa治疗的非细小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)进行了EGFR基因的检测，结果发现9例有效者中8例有EGFR基因酪氨酸激酶区域的突变，这些特定区域的突变主要表现为氨基酸的丢失或正常氨基酸被替代；7例无效者中无一例有此突变，而在未接受Iressa治疗的25例患者中仅有2例有EGFR基因突变，占8％。临床实践显示，易瑞莎对非小细胞肺癌的疗效存在很大的个体差异，仅有8-18％的个体会有很好效果。通过对这些患者组织EGFR基因的突变分析，发现绝大多数个体在EGFR基因酪氨酸激酶区域发生突变。这些突变主要集中在外显子18-21上，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子的点突变L858R最为常见。因此，通过EGFR基因18-21号外显子的突变检测，对于预测靶向药物治疗效果以及临床医生进行肺癌的个体化治疗具有重要的参考价值。

目前，DNA测序法仍然是检测EGFR基因突变使用最多的方法，但需要获取肿瘤组织、分离肿瘤细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长，费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。在美国有实验室专门提供EGFR基因突变的检测，尽管避免了操作的限制和缩短了结果的时间，但费用昂贵。目前，国内临床单位使用的人试剂盒主要是国外进口，价格昂贵，不适于国内的使用。

因此，本实验的目的就是以肺癌患者的血浆为提取样本，基于实时荧光定量PCR技术，为临床提供一种简便、快速、准确和经济的肺癌EGFR基因突变检测方法，为肺癌个体化治疗服务，为肺癌病人造福。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的方法，利用该方法可以提高检测基因突变的分辨率。

本发明的另一个目的是提供一种检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的试剂盒。

本发明的再一个目的是提供使用该试剂盒检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的方法。

根据本发明的一个目的，提供了一种检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的方法，其特征在于，在同一个反应体系中进行酶切富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应来分别检测外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R。

本发明的方法中，在所述酶切富集PCR反应中，使用限制性内切酶Msel和Mscl进行酶切，其中，所述限制性内切酶Msel特异性酶切TTAA位点，可特异性地酶切野生型外显子19；所述限制性内切酶Mscl特异性酶切GCTGGC位点，可特异性地酶切野生型外显子21，该酶切反应可降低野生型基因对突变型基因的干扰。

具体地，本发明的检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R的方法包括以下步骤：

1)制备检测样本，制备样本的类型包括组织样本和血清样本，采用常见的组织样本和血清样本全DNA提取试剂盒即可提取目的DNA，如Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒；

2)在同一个反应体系中进行酶切富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应来分别检测外显子19缺失突变E746_A750del和外显子21点突变L858R，其中，在所述酶切富集PCR反应中，使用限制性内切酶Msel和Mscl进行酶切，并且在所述酶切富集PCR反应中使用的富集引物为：

E746_A750del上游引物：5’-CTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC-3’

E746_A750del下游引物：5’-TGGACCCCCACACAGCAAAGC-3’

L858R上游引物：5’-CTGCAGAACTTGACCCCTCCCA-3’

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC-3’，

在所述ARMS荧光定量PCR反应中使用的ARMS引物为：

E746_A750del上游引物：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’

E746_A750del下游引物：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’

L858R上游引物：5’-GTCAAGATCACAGATTTTGCGCG-3’

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’，

在所述ARMS荧光定量PCR反应中使用的Taqman探针序列为：

E746_A750del探针：5’-FAM-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-TAMRA-3’，

L858R探针：5’-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-TAMR-3’；以及

3)结果分析，根据Ct(Cycle threshold，阈值循环数)值判定结果。

在本发明的方法中，所述步骤2)进一步包括：

2-1)将样本分别置于进行酶切富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应的反应体系中，在37℃下温育30min，使样本在酶切富集ARMS荧光定量PCR体系中首先进行酶切反应，特异性地对野生型基因进行酶切；

2-2)在步骤2-1)的基础上，进行PCR富集，可分别扩增一个400-500bp片段，覆盖了突变位点，PCR反应程序为：95℃20s，65℃20s，72℃60s，共10个循环；和

2-3)在步骤2-2)的基础上，进行ARMS荧光定量PCR反应，对突变基因进行荧光鉴定，PCR反应程序为：95℃5s，60℃30s(收集荧光)，共40个循环。

其中，在步骤2-2)中，进行PCR富集时，所述反应程序在65℃下杂交对富集引物可有效复性，对ARMS引物则效率较低；在步骤2-3)中，进行ARMS荧光定量PCR反应时，所述反应程序60℃延伸30s，仅对ARMS引物有效，富集引物在此条件下无法形成有效扩增。

本发明的方法将酶切富集PCR体系和ARMS荧光定量PCR体系整合到一个反应体系中，通过有效的温度和时间控制，从而可以在一个反应体系中进行酶切、富集PCR和ARMS荧光定量PCR来检测表皮生长因子受体基因突变。

在本发明中，所述富集引物的Tm值为65℃，且比ARMS引物的Tm值高5℃。

在本发明中，所述富集引物扩增片段的长度是ARMS引物扩增片段的长度的3-5倍。

在本发明中，所述ARMS引物的3’末端位于目的突变位点区并与突变型相匹配，且在ARMS引物的3’末端第4个碱基处再引入一个错配碱基。

根据本发明的另一目的，本发明提供了一种检测表皮生长因子受体基因突变的试剂盒，其包括：

(1)酶切富集PCR体系，所述酶切富集PCR体系包括限制性内切酶反应体系和PCR富集反应体系，其中，所述限制性内切酶反应体系包括：限制性内切酶Msel和Mscl，所述限制性内切酶Msel特异性酶切TTAA位点，可特异性地酶切野生型外显子19，所述限制性内切酶Mscl特异性酶切GCTGGC位点，可特异性地酶切野生型外显子21，该酶切反应可降低野生型基因对突变型基因的干扰；以及富集引物，所述富集引物可对突变位点进行富集，所述富集引物为：

E746_A750del上游引物：5’-CTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC-3’

E746_A750del下游引物：5’-TGGACCCCCACACAGCAAAGC-3’

L858R上游引物：5’-CTGCAGAACTTGACCCCTCCCA-3’

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC-3’。

(2)ARMS荧光定量PCR体系，所述ARMS荧光定量PCR体系包括Taq DNA聚合酶、ARMS引物和Taqman探针，所述Taq DNA聚合酶无3’-5’外切酶活性且每分钟可延伸500个碱基，所述ARMS引物3’末端位于目的突变位点区，所述Taqman探针可对扩增产物进行荧光信号检测，其中，

所述的ARMS引物为：

E746_A750del上游引物：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’

E746_A750del下游引物：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’

L858R上游引物：5’-GTCAAGATCACAGATTTTGCGCG-3’

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’，

所述的Taqman探针序列为：

E746_A750del探针：5’-FAM-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-TAMRA-3’，

L858R探针：5’-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-TAMR-3’。

本发明提供的试剂盒一方面通过上述的PCR富集对突变性基因进行富集，同时降低野生型基因产生的背景信号；另一方面通过上述的ARMS荧光定量PCR体系对突变位点进行特异性扩增，并通过荧光信号进行实时定量检测。

在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、引物、探针、dNTP、Mg²⁺和阴性对照等等。其中，所述Taq DNA聚合酶无3’-5’外切酶活性且每分钟可延伸500个碱基，所述阴性对照为无菌去离子水。

根据本发明的另一目的，本发明提供了一种运用本发明的试剂盒检测表皮生长因子受体基因突变的方法，本方法首次整合了酶切富集和ARMS荧光定量PCR反应，包括如下步骤：

1)制备检测样本，制备样本的类型包括组织样本和血清样本，可采用常见的组织样本和血清样本全DNA提取试剂盒即可提取目的DNA，如Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒。

2)将样本分别置于两个进行酶切富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应的反应体系中在37℃下温育30min，使样本首先进行酶切反应，特异性地对野生型基因进行酶切；

3)在步骤2)的基础上，在所述两个反应体系中分别先进行PCR富集，可分别扩增一个400-500bp片段，覆盖了突变位点，PCR反应程序为：95℃20s，65℃20s，72℃60s，共10个循环；再分别进行ARMS荧光定量PCR反应，对突变基因进行荧光鉴定，PCR反应程序为：95℃5s，60℃30s(收集荧光)，共40个循环。

在步骤3)中，进行PCR富集时，所述反应程序在65℃下杂交对富集引物可有效复性，对ARMS引物则效率较低；进行ARMS荧光定量PCR反应时，所述反应程序60℃延伸30s，仅对ARMS引物有效，富集引物在此条件下无法形成有效扩增。

4)结果分析，根据Ct(Cycle threshold，阈值循环数)值判定结果。

本发明中的实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

本发明中的扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称等位基因特异性扩增法(Allele-specific amplification，ASA)、等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等，其借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。该方法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物来进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则会导致PCR不能延伸。

本发明通过将酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，通过一步即可实现对基因突变的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。

附图说明

图1为使用本发明的方法检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del的阳性结果。

图2为使用本发明的方法检测表皮生长因子受体基因外显子21点突变L858R的阳性结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1引物和探针设计

一、材料

限制性内切酶Msel和Mscl购自英国NEB公司，2×Universe Taqman Mix购自美国ABI公司(此Mix已包括PCR缓冲液、dNTP、Mg²⁺，均由供应商提供)，所用引物及探针由上海生工合成，Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒购自北京天跟生物科技有限公司。所用仪器为美国ABI公司ABI7300荧光定量PCR仪。

二、引物与探针序列设计

1、富集引物设计

分别设计可扩增一段400-500bp的引物，相关参数为：Tm值65.0℃-68.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小23±3bp。所设计的富集引物序列如下：

E746_A750del上游引物：5’-CTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC-3’(SEQID No.1)

E746_A750del下游引物：5’-TGGACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQID No.2)

L858R上游引物：5’-CTGCAGAACTTGACCCCTCCCA-3’(SEQ ID No.3)

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC-3’(SEQ IDNo.4)

2、ARMS引物设计

分别设计可扩增一段80-120bp的引物，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。ARMS引物的3’末端位于突变位点区，并与突变型相匹配，为提高特异性，在3’末端第4个碱基处再引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物序列如下：

E746_A750del上游引物：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ IDNo.5)

E746_A750del下游引物：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ IDNo.6)

L858R上游引物：5’-GTCAAGATCACAGATTTTGCGCG-3’(SEQ IDNo.7)

L858R下游引物：5’-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’(SEQ IDNo.8)

3、探针设计

分别在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，3’端TAMRA标记，其序列如下：

E746_A750del探针：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID No.9)

L858R探针：5’-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-3’(SEQ IDNo.10)。

实施例2利用本方法检测E746_A750del和L858R突变

本发明的突变富集ARMS荧光定量PCR的检测方法整合了酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中对样品分别进行酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR鉴定。具体过程为：

1、样本制备：采用Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。

2、检测方法：首先将样品以及阴性对照分别在25μl反应体系中于37℃下温浴30min，使用内切酶Msel(NEB，England)或Mscl(NEB，England)分别对EGFR野生型外显子19或21进行酶切，以降低野生型DNA对突变碱基的干扰。然后进行PCR反应，运行第一个循环对突变碱基进行富集，在65℃退火温度下，ARMS引物不能进行有效工作，因此只有富集引物进行延伸；运行第二个循环时，在60℃延伸30s，因所选用的ABI Taq酶每分钟延伸500个碱基，在30s内，富集引物不能进行有效延伸，形成不了循环，因此只进行ARMS荧光反应。检测E746_A750del和L858R突变的25μl反应体系中包括的组分分别如表1和表2所示：

表1

表2

PCR反应程序为：37℃温浴30min；95℃10min；第一个循环：95℃20s，65℃20，72℃60s，共10个循环；第二个循环：95℃5s，60℃30s(收集荧光)，共40个循环。

该方法中的阴性对照为无菌去离子水。

3、结果分析：图1为检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变E746_A750del的阳性结果。图2为检测表皮生长因子受体基因外显子21点突变L858R的阳性结果。其中，Ct值小于36判断为阳性结果，Ct值在36-38之间须重新检测，Ct值大于38判断为阴性或所提全基因组DNA浓度太低，超出检测范围。

实施例3临床组织样本检测

1、材料和方法

从协和医院和中国药品生物制品鉴定所共收集73份肺癌的肿瘤组织样本，采用Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒提取全基因组DNA。

各取2μl进行突变富集ARMS荧光定量PCR检测，以无菌去离子水做阴性对照，具体实施方法见实施例2。

2、实验结果

在73份组织样本中，共检出12份E746_A750del缺失突变，11份L858R突变。检测方法判定与实施例2相同。