真姬菇菌株及真姬菇子实体的生产方法

摘要

本发明提供不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株、使用该菌株的真姬菇子实体的生产方法、以及不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法。本发明提供一种真姬菇菌株、使用该菌株的真姬菇子实体的生产方法，其中，所述真姬菇菌株在使用以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分、并且含有以干燥重量比计为约6.4重量％的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基进行的栽培中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变。本发明还提供一种不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法，该方法使用了以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分、并含有大量镁化合物的固体状栽培用培养基。利用本发明的筛选方法，能够预先筛选出不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株，保证大规模商业生产的真姬菇子实体的成品率，能够有效地生产优质的真姬菇子实体。

说明书

技术领域

本发明涉及难以发生种菌硬化症的真姬菇菌株、以及使用该菌株生产真姬菇子实体的方法。而且，本发明涉及一种筛选难以发生种菌硬化症的真姬菇菌株的方法。

背景技术

近年来，已开发了蘑菇的人工栽培技术，从而提供各种食用蘑菇的子实体(香菇、金针菇、平菇、滑菇、舞茸、真姬菇、荷叶菇、占地菇等)。

通常，蘑菇的人工栽培方法有原木栽培和菌床栽培，在原木栽培中，将栎树、榉树、柞树等原木用作碎块木(ほだ木)；在菌床栽培中，使用固体状栽培用培养基，该固体状栽培用培养基是这样形成的：将米糠、小麦麸、玉米皮等营养源混合在锯末、玉米穗轴粉末等中而形成的培养基填充在瓶、袋、箱等容器中。在这些栽培方法中，在大型设备的工厂系统中推行的是使用聚乙烯制的瓶的菌床栽培方法，因为该方法比较容易实现大型化、机械化。但是，在大型设备的工厂系统中，会看到在少量栽培中不常看到的蘑菇栽培时的各种不利情况。

例如，在真姬菇中，有时会看到在培养成熟期菌床上的种菌部分变色为褐色而硬化的现象。另外，此时，频繁地伴随着产生腐败臭。产生这些现象时，多观察到这样的例子：搔菌后，直到菌床面都变成褐色，以及菌丝不再生或者再生极慢以至于不出芽，即，不能收获到子实体。这种现象被称为种菌硬化症，由于使子实体的生产效率降低，因此成为重要问题。但是，种菌硬化症的原因或机制尚不清楚，另外，作为应对方法，也只不过是尝试着降低培养温度等策略(例如，非专利文献1及2)。

[现有技术文献]

[非专利文献]

[非专利文献1]菌床きのこ·栽培障害事例集，第64-66页，日本长野县经济事业农业协同联合会，平成7年3月发行

[非专利文献2]長野県野菜花き試験場報告，第11号，23-26页，2001年

发明内容

发明要解决的问题

鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供一种在真姬菇的大规模生产中与现有的真姬菇菌株相比不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株、以及使用该菌株生产真姬菇子实体的方法。另外，还提供一种筛选不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的方法。

解决问题的手段

本发明人对于种菌硬化症(其在真姬菇子实体的大规模生产中被认为是重要课题)进行了潜心研究，结果出乎意料地发现，通过使用大量含有硅酸铝镁之类的镁化合物(通常，为了使真姬菇子实体的产量增加而少量使用硅酸铝镁之类的镁化合物)的固体状栽培用培养基(菌床栽培用培养基或培养基)来进行真姬菇子实体的栽培，可以人为地引起与在大规模生产中发生的种菌硬化症同样的现象。另外发现，使用该固体状栽培用培养基可以筛选不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株，并且发现使用该方法非常不容易发生种菌硬化症的真姬菇菌株。而且还发现，通过使用该菌株，可以在大规模生产中生产出产量好的稳定的真姬菇子实体，从而完成本发明。

总体上，本发明涉及以下方面：

[1]一种真姬菇菌株，在使用固体状栽培用培养基的栽培中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变，其中所述的固体状栽培用培养基以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分，并含有以干燥重量比计为约6.4重量％的硅酸铝镁。

[2]如[1]所述的真姬菇菌株，在使用由针叶树锯属、米糠、玉 米穗轴粉末、大豆皮、麦麸和镁化合物形成的固体状栽培用培养基进行的栽培中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变。

[3]如[1]或[2]所述的真姬菇菌株，其选自：Hypsizygus marmoreus K-4975(FERM BP-11321)、Hypsizygus marmoreus K-4979(FERM BP-11322)、Hypsizygus marmoreus K-4980(FERM BP-11323)、Hypsizygus marmoreus K-4981(FERM BP-11324)、或者为来源于这些菌株的变异株并且与这些菌株具有同等性质的菌株。

[4]一种真姬菇子实体的生产方法，使用了[1]所述的真姬菇菌株。

[5]一种不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法，包括使用固体状栽培用培养基以栽培真姬菇菌株，其中所述的固体状栽培用培养基以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分，并含有选自以干燥重量比计为约5.2重量％以上的硅酸铝镁、以干燥重量比计为约0.5重量％以上的氧化镁、以及以干燥重量比计为约2重量％以上的氧化铝镁氢氧化物(水酸化アルミナマグネシウム)中的至少1种镁化合物。

[6]如[5]所述的真姬菇菌株的筛选方法，其中所述固体状栽培用培养基由针叶树锯屑、米糠、玉米穗轴粉末、大豆皮、麦麸、以及镁化合物形成。

[7]如[5]或[6]所述的真姬菇菌株的筛选方法，其为选择这样的真姬菇菌株的筛选方法，该真姬菇菌株中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变。

作为上述[3]所述的发明的一个实施方案，提供一种真姬菇菌株，其为来源于选自下述菌株中的至少一者的变异株并且与这些菌株具有同等性质：Hypsizygus marmoreus K-4975(FERM BP-11321)、Hypsizygus marmoreus K-4979(FERM BP-11322)、Hypsizygus marmoreus K-4980(FERM BP-11323)、Hypsizygus marmoreus K-4981(FERM BP-11324)，这些菌株在使用以针叶树锯屑及米糠作为主要构成成分、并且含有以干燥重量比计为约6.4重量％的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基进行的栽培中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变。

发明效果

根据本发明，提供一种不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株，并提供使用该菌株进行稳定的真姬菇子实体的大规模商业生产方法。另外，还提供不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的简便的筛选方法。

具体实施方式

在本申请说明书中，所谓“种菌硬化症”是指，在真姬菇子实体的生产中，在将种菌接种至固体状栽培用培养基上之后，在培养成熟期固体状栽培用培养基表面的种菌部分变色为褐色而硬化并伴随腐败臭、搔菌后在菌床表面菌丝不再生或再生极慢的现象。产生了该现象的固体状栽培用培养基甚至不发芽，即，不能收获子实体。

在本申请说明书中，对于真姬菇的菌床栽培方法没有特别限定，可以列举(例如)使用固体状栽培用培养基的栽培方法，该固体状栽培用培养基是通过向瓶、袋、箱等容器中填充在锯末、玉米穗轴粉末等中混合有米糠、小麦麸、玉米皮等营养源的固体栽培用培养基而获得的。作为固体状栽培用培养基，可以使用在栽培真姬菇子实体时所使用的公知的固体状栽培用培养基。可以列举(例如)以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分的固体状栽培用培养基，优选的是，可以列举含有针叶树锯屑、米糠、玉米穗轴粉末、大豆皮、麦麸和镁化合物的固体状栽培用培养基。

在本申请说明书中，所谓“以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分”是表示：在固体状栽培用培养基中，作为培养基基材，针叶树锯屑为主要成分，作为营养材料，米糠为主要成分。即，表示：作为培养基基材，仅使用针叶树锯屑、或相对于其他的培养基基材更多地使用针叶树锯屑；作为营养材料，仅使用米糠、或相对于其他的营养材料更多地使用米糠。例如，在瓶栽培中，在使用850mL瓶的情况下，针叶树锯屑以干燥重量计为50～95克，优选为60～75克；米糠以干燥重量计为45～110克，优选为45～90克。

在本申请说明书中，对于所谓的“镁化合物”没有特别限定，只要是含有镁的化合物即可，可以使用镁的含氧酸盐、卤化物、氧化物、 氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。例如，作为含氧酸盐，可列举硅酸铝镁、碳酸镁、硝酸镁、硫酸镁、碳酸氢镁、过碳酸镁；作为卤化物，可列举氟化镁、氟化氢镁、氯化镁、溴化镁、碘化镁；作为氧化物，可列举氧化镁；作为氢氧化物，可列举氢氧化镁、氧化铝镁氢氧化物(氢氧化铝和氢氧化镁的共沉物)；作为无机盐，可列举铝酸镁、氢化镁、硫化镁、硫化氢镁(氢硫化镁)、过锰酸镁、铬酸镁、氯酸镁等。这些镁化合物可以使用1种，也可以将多种组合使用。在本发明的不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法中，特别优选使用硅酸铝镁、氧化镁或氧化铝镁氢氧化物。另外，该筛选方法中的固体状栽培用培养基中的镁化合物含量因使用的镁化合物不同而不同，只要适当选择即可，例如，在使用硅酸铝镁的情况下，相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，硅酸铝镁以干燥重量比计为约5.2重量％(例如，在市售品的干燥减量为18％的情况下，该市售品的用量以湿重量计为约12g/850mL瓶)以上、优选约5.2～8.4重量％(例如，在市售品的干燥减量为18％的情况下，该市售品的用量以湿重量计为约12～20g/850mL瓶)、进一步优选为约6.4重量％(例如，在市售品的干燥减量为18％的情况下，该市售品的用量以湿重量计约15g/850mL瓶)；在使用氧化镁的情况下，相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，氧化镁以干燥重量比计为约0.5重量％(例如，市售品的情况下，约1g/850mL瓶)以上、优选约0.5～3重量％(例如，市售品的情况下，约1～6g/850mL瓶)、进一步优选约0.8重量％(例如，市售品的情况下，约1.5g/850mL瓶)；在使用氧化铝镁氢氧化物的情况下，相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，氧化铝镁氢氧化物以干燥重量比计为约2重量％(例如，在市售品的干燥减量为10％的情况下，该市售品的用量以湿重量计为约4g/850mL瓶)以上、优选约2～4重量％(例如，在市售品的干燥减量为10％的情况下，该市售品的用量以湿重量计为约4～8g/850mL瓶)、进一步优选约2.5重量％(例如，在市售品的干燥减量为10％的情况下，该市售品的用量以湿重量计约5g/850mL瓶)。

此外，除非特别说明，否则在本申请说明书中，“％”和“比率”均表示以重量为基准的值。

可以通过作为菌床栽培方法的瓶栽培、袋栽培、箱栽培等来实施本发明的不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法。作为一例，对利用瓶栽培的本发明筛选方法进行描述。真姬菇的菌床栽培方法由菌床培养基配制、装瓶、杀菌、种菌的接种、菌床培养、搔菌(搔成馒头型)、发芽、生长繁殖、收获等各工序组成(例如，日本特开平05-268942号公报)。这些工序中，在菌床培养基配制工序中，将镁化合物(例如硅酸铝镁)添加至固体状栽培用培养基中，使得相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，镁化合物以干燥重量比计为约5.2重量％。在本发明的不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的筛选方法中，对于大量含有镁化合物的固体状栽培用培养基没有特别限定，可以使用在栽培真姬菇子实体时所使用的公知的固体状栽培用培养基。在本发明中，特别优选使用以针叶树锯屑(例如，杉材)及米糠为主要成分的培养基，例如，可以使用由针叶树锯屑、米糠、玉米穗轴粉末、大豆皮、麦麸、镁化合物构成的固体状栽培用培养基。

接着，进行装瓶以后的工序。作为所接种的种菌，可以使用打算进行是否不易发生种菌硬化症筛选的真姬菇菌株的液体种菌或固体种菌。

作为可以实施本发明的不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株筛选方法的真姬菇菌株，可以列举：以榆生离褶伞(Lyophyllum ulmarium)表示的菌株、以Hypsizygus marmoreus表示的菌株、以及适于栽培的这些菌株的变异株、以这些菌株作为亲株并利用公知的杂交育种而得到的杂交株等。

是否不易发生种菌硬化症可以通过观察选自搔菌前后的菌床表面状态、搔菌后的膜再生状态、子实体的生长繁殖状态中的任一种状态或全部状态来进行筛选。例如，在容易发生种菌硬化症的真姬菇种菌的情况下，在搔菌前的菌床面的状态下，形成为褐色和/或产生异臭的状态。另外，在这种情况下，搔菌后的菌床面也大多形成为褐色和/或产生异臭的状态。而且，在搔菌后的膜再生中，形成为膜完全不再生或者仅一部分膜再生的状态。在子实体的生长繁殖状态下，与使用不含有或少量含有镁化合物的固体状栽培用培养基的情况相比，子实体 的产量极低或者子实体的品质(形状)降低。如下述实施例所示，在搔菌后的菌床面发生褐变的情况下，可以看到，即使正常地产生了子实体，其产量也降低。因此，在大量含有镁化合物的固体状栽培用培养基中，固体状栽培用培养基表面的种菌部分不发生褐变的菌株可以称为不易发生种菌硬化症的优良菌株。

通过选择不会形成上述状态的真姬菇菌株，可以筛选出不易发生或不发生种菌硬化症的真姬菇菌株。另外，如后述的实施例中记载的那样，通过与现有已知的真姬菇菌株进行比较，也可以筛选出不易发生或不发生种菌硬化症的真姬菇菌株。在本发明的筛选方法中，优选每1菌株在同一时期、同一培养基、同一条件下进行5个以上、优选8个以上的栽培，筛选是否不易发生或不发生种菌硬化症。

作为使用本发明方法而筛选出的真姬菇菌株，可列举以下菌株。

●Hypsizygus marmoreus K-4975：于2009年9月2日(日本国内保藏日)，保藏在日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编：305-8566)，日本国内保藏编号FERM P-21841，其后，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于2010年12月24日以接收编号FERM ABP-11321接收，并且于2011年2月10日国际保藏，国际保藏编号FERM BP-11321

●Hypsizygus marmoreus K-4979：于2009年9月2日(日本国内保藏日)，保藏在日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编：305-8566)，日本国内保藏编号FERM P-21842，其后，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于2010年12月24日以接收编号FERM ABP-11322接收，并且于2011年2月10日国际保藏，国际保藏编号FERM BP-11322

●Hypsizygus marmoreus K-4980：于2009年9月2日(日本国内保藏日)，保藏在日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编：305-8566)，日本国内保藏编号FERM P-21843，其后，基于国际承 认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于2010年12月24日以接收编号FERM ABP-11323接收，并且于2011年2月10日国际保藏，国际保藏编号FERM BP-11323

●Hypsizygus marmoreus K-4981：于2009年9月2日(日本国内保藏日)，保藏在日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编：305-8566)，日本国内保藏编号FERM P-21844，其后，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于2010年12月24日以接收编号FERM ABP-11324接收，并且于2011年2月10日国际保藏，国际保藏编号FERM BP-11324

将干燥重量为62克的锯屑(杉材)、湿重量为60克的米糠(水分含量约10％)、湿重量为30克的玉米穗轴粉末(水分含量约10％)、湿重量为20克的大豆皮(水分含量约10％)、湿重量为20克的麦麸(水分含量约10％)和湿重量为15克的硅酸铝镁(干燥减量为18％的情况下)混合，然后，调制成含水率为65％的固体状栽培用培养基，利用该固体状栽培用培养基在25℃下进行的栽培中，以上这些菌株的种菌部分不发生褐变。

另外，具有与上述菌株同等性质(即，不易发生种菌硬化症的性质)的变异株也包含在本发明中，所述变异株为以以上这些菌株作为亲株、且采用公知的方法(例如，对上述菌株的孢子进行变异处理、或者将上述菌株的菌丝与其他菌株的菌丝进行杂交处理)而得到的变异株。这样的变异株是本领域技术人员通过常规方法能够容易取得的。此外，关于该变异株是否具有与上述菌株同等性质，可以根据本申请说明书所记载的方法来筛选。而且，与选自在使用以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分、并且含有以干燥重量比计约6.4重量％的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基进行的栽培中，固体状栽培用培养基的种菌部分不发生褐变的上述菌株中的至少1个菌株具有同等性质的真姬菇菌株也包含在本发明中。

示出Hypsizygus marmoreus K-4975(FERM BP-11321)的各种性质。

(1)在麦芽提取物琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用麦芽提取物琼脂培养基(麦芽提取物5％、琼脂3％)。至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为52mm。菌丝白色而稠密，生出气生菌丝。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝白色而稠密，以直线状延伸。背面同样未发生变色。

(2)在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用PDA琼脂培养基(Difco^TM Potato Dextrose Agar Becton，Dickinson and Company USA公司生产)。至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为55mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。至第20天，培养皿的整个表面被稠密的菌丝覆盖，像垫子状凸起。气生菌丝非常多。背面同样未发生变色。

(3)在Czapek Dox琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用Czapek Dox琼脂培养基(NaNO₂ 0.2％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KCl 0.05％、FeSO₄·7H₂O 0.001％、蔗糖3％、琼脂1.5％)。至第7天有中等程度的生长繁殖，菌落直径为45mm。菌丝呈树状伸长，非常稀薄，气生菌丝少。至第10天，菌落直径为65mm；至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝呈树状、白色、稀薄。背面同样未发生变色。

(4)在Sabouraud琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用Sabouraud琼脂培养基(葡萄糖4％、蛋白胨0.1％、琼脂1.5％)。至第10天有小程度的生长繁殖，菌落直径为31mm。菌丝呈白色而稀薄的绵状。至第20天，菌落直径为55mm。菌丝白色而稠密。背面同样未发生变色。

(5)在燕麦片琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用燕麦片琼脂培养基(向30克燕麦片中加入小于或等于1000ml的水，在热水浴上加热煮沸1小时。用2至3层纱布将其过滤，然后向所得到的滤液中加水至1000ml，再加入2％的琼脂)。至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为54mm。菌丝多以分枝状伸长，气生菌丝多。至第10天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量的绵状气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(6)在合成毛霉菌琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用合成毛霉菌琼脂培养基(葡萄糖4％、天冬酰胺0.2％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.025g/L、硫胺0.5mg/L、琼脂1.5％)。至第10天有中等程度的生长繁殖，菌落直径为50mm。菌丝为白色，呈直线状伸长。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，产生气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(7)在YpSs琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

使用YpSs琼脂培养基(可溶性淀粉1.5％、酵母提取物0.4％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、琼脂2％)。至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为64mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。呈垫子状生长繁殖。至第10天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量气生菌丝。背面同样未发生变色。

(8)在酚氧化酶检测用培养基(25℃)中的生长繁殖状态：

在添加有0.5％没食子酸的PDA琼脂培养基中，至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为27mm。菌丝呈白色绵状，产生气生菌丝。培养基发生褐变，褐变半径为26mm。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，在菌丝表面观察观察到菌丝有浓淡，产生气生菌丝。培养基全部发生褐变。背面同样观察到有褐变。

(9)最适宜的生长繁殖温度：

在PDA琼脂培养基上接种经过前培养的直径5mm的琼脂种菌，在25℃下进行预培养，使得菌丝再生。其后，在各温度下培养7天，测定一个方向上的菌丝的伸长量。结果，通过测定7天的菌丝伸长，最佳生长繁殖的温度为24～26℃。另外，在5℃下能多少看到一些生长繁殖，但在35℃下几乎不生长繁殖。

(10)最适宜生长繁殖的pH：

将PGY液体培养基(葡萄糖2％、多聚蛋白胨0.2％、酵母提取物0.2％、K₂HPO₄ 0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.5％)每次60ml分注于100ml用的三角烧瓶中，杀菌，用酸或碱调节各pH后，接种直径5mm的琼脂种菌，在25℃下静置培养15天，然后测定菌体的干燥重量。结果，最适宜生长繁殖的pH为6至8。另外，本菌株能够生长繁殖的pH范围为3.5至10。

以下对菌株在与上述相同的培养基及条件下的各种性质进行研究。

示出Hypsizygus marmoreus K-4979(FERM BP-11322)的各种性质。

(1)在麦芽提取物琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为46mm。菌丝白色而稠密，生出气生菌丝。至第13天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝白色而稠密，以直线状延伸。背面同样未发生变色。

(2)在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为53mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。至第20天，培养皿的整个表面被稠密的菌丝覆盖，像垫子状凸起。气生菌丝非常多。背面同样未发生变色。

(3)在Czapek Dox琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为33mm。菌丝呈树状伸长，非常稀薄，气生菌丝少。至第10天，菌落直径为50mm；至第17天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝呈树状、白色、稀薄。背面同样未发生变色。

(4)在Sabouraud琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有小程度的生长繁殖，菌落直径为34mm。菌丝呈白色稀薄的绵状。至第20天，菌落直径为65mm。菌丝白色而稠密。背面同样未发生变色。

(5)在燕麦片琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为51mm。菌丝多以分枝状伸长，气生菌丝多。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量绵状气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(6)在合成毛霉菌琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有中等程度的生长繁殖，菌落直径为55mm。菌丝为白色，呈直线状伸长。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，产生气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(7)在YpSs琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为62mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。呈垫子状生长繁殖。至第10天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量气生菌丝。背面同样未发生变色。

(8)在酚氧化酶检测用培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为21mm。菌丝呈白色绵状，产生气生菌丝。培养基发生褐变，褐变半径为26mm。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，在菌丝表面观察到菌丝有浓淡，产生气生菌丝。培养基全部发生褐变。背面同样观察到有褐变。

(9)最适宜生长繁殖的温度：

测定7天的菌丝的伸长量，最佳的生长繁殖温度为24～26℃。另外，在5℃下多少能够看到一些生长繁殖，但在35℃下几乎不生长繁殖。

(10)最适宜生长繁殖的pH：

最适宜生长繁殖的pH为6至8。另外，本菌株能够生长繁殖的pH范围为3.5至10。

示出Hypsizygus marmoreus K-4980(FERM BP-11323)的各种性质。

(1)在麦芽提取物琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为45mm。菌丝白色而稠密，生出气生菌丝。至第13天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝白色而稠密，以直线状延伸。背面同样未发生变色。

(2)在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为47mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。至第20天，培养皿的整个表面被稠密的菌丝覆盖，像垫子状凸起。气生菌丝非常多。背面同样未发生变色。

(3)在Czapek Dox琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为38mm。菌丝呈树状伸长，非常稀薄，气生菌丝少。至第10天，菌落直径为55mm；至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝呈树状、白色、稀薄。背面同样未发生变色。

(4)在Sabouraud琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有小程度的生长繁殖，菌落直径为41mm。菌丝呈白色稀薄的绵状。至第20天，菌落直径为61mm。菌丝白色而稠密。背面同样未发生变色。

(5)在燕麦片琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为46mm。菌丝多以分枝状伸长，气生菌丝多。至第13天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量绵状气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(6)在合成毛霉菌琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有中等程度的生长繁殖，菌落直径为47mm。菌丝为白色，呈直线状伸长。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，产生气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(7)在YpSs琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为59mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。呈垫子状生长繁殖。至第10天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量气生菌丝。背面同样未发生变色。

(8)在酚氧化酶检测用培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为29mm。菌丝呈白色的绵状，产生气生菌丝。培养基发生褐变，褐变半径为27mm。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，在菌丝表面观察到菌丝有浓淡，产生气生菌丝。培养基全部发生褐变。背面同样观察到有褐变。

(9)最适宜生长繁殖的温度：

测定7天的菌丝伸长量，最佳生长繁殖的温度为24～26℃。另外，在5℃下多少能够看到一些生长繁殖，但在35℃下几乎不生长繁殖。

(10)最适宜生长繁殖的pH：

最适宜生长繁殖的pH为6至8。另外，本菌株能够进行生长繁殖的pH范围为3.5至10。

示出Hypsizygus marmoreus K-4981(FERM BP-11324)的各种性质。

(1)在麦芽提取物琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为48mm。菌丝白色而稠密， 生出气生菌丝。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝白色而稠密，以直线状延伸。背面同样未发生变色。

(2)在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为48mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。至第13天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。至第20天，培养皿的整个表面被稠密的菌丝覆盖，像垫子状凸起。气生菌丝非常多。背面同样未发生变色。

(3)在Czapek Dox琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为30mm。菌丝呈树状伸长，非常稀薄，气生菌丝少。至第10天，菌落直径为45mm；至第17天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖。菌丝呈树状、白色、稀薄。背面同样未发生变色。

(4)在Sabouraud琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有小程度的生长繁殖，菌落直径为36mm。菌丝呈白色稀薄的绵状。至第20天，菌落直径为68mm。菌丝白色而稠密。背面同样未发生变色。

(5)在燕麦片琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为48mm。菌丝多以分枝状伸长，气生菌丝多。至第12天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量绵状气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(6)在合成毛霉菌琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第10天有中等程度的生长繁殖，菌落直径为50mm。菌丝为白色，呈直线状伸长。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，产生气生菌丝。菌丝为白色。背面同样未发生变色。

(7)在YpSs琼脂培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天生长繁殖旺盛，菌落直径为55mm。菌丝白色而稠密，生出大量气生菌丝。呈垫子状生长繁殖。至第10天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，生出大量气生菌丝。背面同样未发生变色。

(8)在酚氧化酶检测用培养基(25℃)中的生长繁殖状态

至第7天有小程度的生长繁殖，菌落直径为30mm。菌丝呈白色 的绵状，产生气生菌丝。培养基发生褐变，褐变半径为27mm。至第15天，菌丝在整个培养皿上生长繁殖，在菌丝表面观察到菌丝有浓淡，产生气生菌丝。培养基全部发生褐变。背面同样观察到有褐变。

(9)最适宜生长繁殖的温度：

测定7天的菌丝伸长量，最佳生长繁殖的温度为24～26℃。另外，在5℃下多少能够看到一些生长繁殖，但在35℃下几乎不生长繁殖。

(10)最适宜生长繁殖的pH：

最适宜生长繁殖的pH为6至8。另外，本菌株能够进行生长繁殖的pH范围为3.5至10。

这4种菌株中的任一种在与其他3种菌株对峙培养中均形成带线。另外，这些菌株中的任一种在与榆生离褶伞(リオオフイラムウルマリウム)M-8171(FERM BP-1415)及各种公知的菌株的对峙培养中也形成带线，它们显然是新菌株。另外，在使用以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分、并包含以干燥重量比计为约6.4重量％(例如，在市售品的干燥减量为18％的情况下，约15g/850mL瓶)的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基进行的栽培中，这4种菌株均为不发生种菌硬化症的新菌株。另外，在使用以针叶树锯屑及米糠为主要组成成分、并包含以干燥重量比计为约6.4重量％(例如，在市售品的干燥减量为18％的情况下，以湿重量计为约15g/850mL瓶)的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基进行的栽培中，与榆生离褶伞(リオフイラムウルマリウム)M-8171(FERM BP-1415)相比，上述任意一种菌株都为高产量。此外，即使在通常的培养基(即，未大量含有镁化合物的培养基)中进行栽培的情况下，与现有菌株相比，在上述菌株中种菌硬化症的发生频率也低。

另外，榆生离褶伞M-8171(Lyophyllum ulmarium M-8171)于1987年7月17日，保藏在日本国通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(地址：日本国茨城果筑波郡谷田部町1丁目1番3，邮编：305；即，现在的日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编：305-8566))，国际保藏编号FERM BP-1415。

以上列举瓶栽培的实例进行了说明，但是本发明并不局限于上述利用瓶栽培的筛选方法。

使用通过上述筛选方法而获得的菌株，可以利用瓶栽培、袋栽培、箱栽培等来生产真姬菇子实体。作为一例，对利用瓶栽培的真姬菇子实体的生产方法进行描述，该方法由菌床培养基调制、装瓶、杀菌、种菌的接种、菌床培养、搔菌(搔成馒头型)、发芽、生长繁殖、收获等各工序组成。例如，作为进行日本特开平05-268942号公报中所记载的菌床栽培时的种菌，可以使用通过上述筛选方法而获得的菌株。

[实施例]

下面利用实施例更进一步具体地说明本发明，但本发明并不仅限于以下的实施例范围。

实施例1

将以干燥重量计为62g的锯末(杉材)、湿重量为60g的米糠(水分含量10％)、湿重量为30g的玉米穗轴粉末(水分含量10％)、湿重量为20g的大豆皮(水分含量10％)、湿重量为20g的麦麸(水分含量10％)充分混合，以2.5g/瓶或15g/瓶(相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，以干燥重量比计分别为约1.1重量％、约6.4重量％)的量向所得到的混合物中添加硅酸铝镁(干燥减量为18％，富士化学工业株式会社生产，商品名：ノイシリン)，将水分含量调节为65％，然后压装在聚丙烯制的850mL容量的广口培养瓶(ブロ一ビンS-850，信越农材株式会社生产)。在压装物表面的中央，开直径1cm左右的接种孔部，盖上盖子后，在120℃下进行高压灭菌60分钟，将冷却至常温的物质作为固体状栽培用培养基。

对本发明人持有的11株真姬菇(Hypsizygus marmoreus)菌株实施双列杂交，共得到434株杂交株。进行将各杂交株接种于上述培养基上的栽培试验，选拔出4株真姬菇(Hypsizygus marmoreus)K-4975(FERM BP-11321)、K-4979(FERM BP-11322)、K-4980(FERMBP-11323)、K-4981(FERM BP-11324)，它们是在含有15g/850mL瓶的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基中在搔菌前菌床表面没有发生褐变的 新的杂交株。

配制上述的含有2.5g/850mL瓶或15g/850mL瓶的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基。在固体状栽培用培养基中分别接种K-4975、K-4979、K-4980、K-4981、K-4529(由上述杂交株不经过选拔工序而选出的菌株)、利用公知的方法由JA全农长野市售的真姬菇分离得到的比较用的菌株(以下记载为市售菌株)、以及榆生离褶伞M-8171(FERMBP-1415)的另外制成的固体种菌，每种菌分别接种8条，在25℃、湿度55％的条件下培养菌丝体30天，进一步培养45天，得到子实体原基。其后，摘去菌帽，将菌床面上部的菌丝层1cm残留在中央部以进行搔菌，检查搔菌时菌床表面的状态。结果示于表1。

[表1]

由表1可以看出，通常，在真姬菇子实体的生产中添加为了增收而使用的2.5g硅酸铝镁时，任何的菌株都正常地生长繁殖；与此相对，在真姬菇子实体的生产中添加通常为不使用的量的15g硅酸铝镁时，作为新获得的5株杂交株中有4株(K-4975、K-4979、K-4980及K-4981)为正常，但是，1株(K-4529)在全部的试验区中伴有菌床表面的褐变或异臭的产生。而且，市售菌株及M-8171，也看到在全部的试验区中产生褐变或异臭。

接着，对所有这些培养基加入20mL自来水并充分地吸水后，利用反转脱水除去多余的水，其后，将环境控制为照度20勒克斯、温度15℃，加湿时将ヒユ一ミアイ100(鹭宫制作所制造)的显示值控制为湿 度90％以上，在二氧化碳浓度控制为1000～3000ppm范围内的发芽生长繁殖室中进行发芽及生长繁殖14天，然后确认膜再生状态。结果示于表2。

[表2]

由表2可以看出，添加2.5g硅酸铝镁时，在全部的菌株中膜再生状态为正常。与此相对，在添加15g的情况下，K-4975、K-4979、K-4980、K-4981及市售菌株的膜再生状态为正常，而K-4529及M-8171观察到仅一部分进行膜再生以及膜完全不再生。

而且，在原样的同一条件下继续生长繁殖，得到真姬菇子实体(成熟子实体)。将所得到的真姬菇子实体的平均产量和生长繁殖天数(搔菌后至收获成熟子实体的天数)的结果示于表3中。表中，平均产量用“子实体的平均产量＝子实体总重量/产生供试瓶数”(也包括不产生瓶)的式子算出，生长繁殖天数用“生长繁殖天数＝成熟子实体所需要的生长繁殖总天数/收获瓶数(不包含不产生瓶)”的式子算出。

[表3]

由表3可以看出，在添加15g硅酸铝镁的情况下，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981的产量好，生长繁殖天数也不特别延迟，子实体的品质也良好。与此相对，K-4529、市售菌株及M-8171观察到产量显著降低或品质恶化。

由表1～3的结果可知，通过使用大量含有作为镁化合物的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981为不易发生种菌硬化症的菌株。由此可知，与现有菌株相比，这些菌株即使在使用通常的培养基(即，未大量含有镁化合物的培养基)的大规模的商业生产中，也不发生种菌硬化症、或者种菌硬化症的发生频率非常低。另外可知，通过使用大量含有作为镁化合物的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基，可以筛选出不易发生或不发生种菌硬化症的菌株。

实施例2

以下讨论在添加15g硅酸铝镁时培养菌丝体时的温度对不易发生或不发生种菌硬化症的菌株的筛选是否产生影响。

使用添加了15g硅酸铝镁的固体状栽培用培养基，将培养菌丝体时的温度设定为25℃和27℃，除此之外，采用与实施例1中记载的方法同样的方法，对真姬菇(Hypsizygus marmoreus)K-4975(FERM BP-11321)、K-4979(FERM BP-11322)、K-4980(FERM BP-11323)、K-4981(FERM BP-11324)、K-4529、比较用的市售菌株以及榆生离褶伞M-8171(FERM BP-1415)进行研究。首先，检查搔菌时菌床面的状态。结果示于表4。

[表4]

由表4可知，在添加15g硅酸铝镁的条件下、并且菌丝体的培养温度为25℃的情况下，结果与实施例1相同。在相同的培养基中、并且菌丝体的培养温度为27℃的情况下，也与25℃的情况相同，作为新获得的5株杂交株中的4株(K-4975、K-4979、K-4980及K-4981)为正常，但1株(K-4529)在全部的试验区中伴有褐变或异臭。另外，市售菌株及M-8171也在全部的试验区中伴有褐变或异臭。

接着，与实施例1同样地进行吸水、反转脱水、发芽及生长繁殖，然后确认膜再生状态，结果示于表5。

[表5]

由表5可知，在添加了15g硅酸铝镁的条件下、且菌丝体的培养温度为25℃的情况下，结果与实施例1相同。在相同的培养基中、并且菌丝体的培养温度为27℃的情况下，K-4975、K-4979、K-4980、K-4981 及市售菌株的膜再生状态正常，但是K-4529及M-8171观察到仅部分膜再生以及膜完全不再生。

下面，将真姬菇子实体的平均产量和生长繁殖天数(搔菌后至收获成熟子实体的天数)的结果示于表6。

[表6]

由表6可知，在添加15g硅酸铝镁的条件下、且菌丝体的培养温度为25℃的情况下，结果与实施例1相同。在相同的培养基中、且菌丝体的培养温度为27℃的情况下，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981产量好，生长繁殖天数也不特别延迟，子实体的品质也良好。与此相对，K-4529、市售菌株及M-8171观察到产量显著降低或品质恶化。

由表4～6的结果可知，通过使用大量含有作为镁化合物的硅酸铝镁的固体状栽培用培养基，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981为不易发生种菌硬化症的菌株。另外可知，在使用大量含有硅酸铝镁的固体状栽培用培养基的情况下，菌丝体的培养温度变化对不易发生或不发生种菌硬化症的菌株的筛选不产生影响。

实施例3

采用与实施例2同样的方法，对真姬菇(Hypsizygus marmoreus)K-4975(FERM BP-11321)、K-4979(FERM BP-11322)、K-4980(FERM BP-11323)、K-4981(FERM BP-11324)、K-4529、比较用的市售菌株、及榆生离褶伞M-8171(FERM BP-1415)进行研究，不同之处在于，添加5g/瓶(相对于固体状栽培用培养基的总干燥重量，以干燥重量比计为约2.5重量％)的氧化铝镁氢氧化物(氢氧化铝和氢氧化镁的共沉物，干燥减量10％，协和化学工业株式会社生产，商品名：キヨ一ワ一ド300) 以取代硅酸铝镁。首先，检查搔菌时菌床面的状态。结果示于表7。

[表7]

由表7可知，在添加5g氧化铝镁氢氧化物的条件下、且菌丝体的培养温度为25℃及27℃的任一种情况下，结果与实施例2有同样的趋势。

接着，向所有这些培养基中加入20mL自来水并充分地吸水后，利用反转脱水除去多余的水，其后，将环境控制为照度20勒克斯、温度15℃，加湿时作为ヒユ一ミアイ100(鹭宫制作所制造)的显示值控制为湿度90％以上，在二氧化碳浓度控制为1000～3000ppm范围内的发芽生长繁殖室中继续发芽及生长繁殖12天。另外，K-4980及K-4981进行9天生长繁殖，K-4975进行10天生长繁殖，K-4979、K-4529及市售菌株进行14天生长繁殖，M-8171进行15天生长繁殖，然后得到真姬菇子实体。

在上述发芽及生长繁殖时的第14天确认膜再生状态。结果示于表8。

[表8]

由表8可知，在添加5g氧化铝镁氢氧化物的条件下、且菌丝体的培养温度为25℃的情况下，看到市售菌株中仅部分膜再生和膜完全不再生。而其他菌株，结果与实施例2相同。另外，在相同的培养基中且菌丝体的培养温度为27℃的情况下，结果与实施例2相同。

下面，将真姬菇子实体的平均产量和生长繁殖天数(搔菌后至收获成熟子实体的天数)的结果示于表9。

[表9]

由表9可知，在添加5g氧化铝镁氢氧化物的条件下，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981产量好，生长繁殖天数也不特别延迟，子实体的品质也良好。与此相对，K-4529、市售菌株及M-8171中，观察到不产生子实体或者产量显著降低或品质恶化。

由表7～9的结果可知，即使在使用大量含有作为镁化合物的氧化铝镁氢氧化物的固体状栽培用培养基的情况下，K-4975、K-4979、K-4980及K-4981也为不易发生种菌硬化症的菌株。另外可知，即使在使用大量含有氧化铝镁氢氧化物以取代硅酸铝镁的固体状栽培用培养 基的情况下，也可以筛选出不易发生或不发生种菌硬化症的菌株，显然，即使为其他的镁化合物，也可以获得同样的效果。

工业上实用性

根据本发明，可以提供一种在利用商业生产用的固体状栽培用培养基进行的栽培中，培养基表面的种菌部分不发生褐变的真姬菇菌株。通过利用该菌株，能够实现真姬菇子实体的稳定的大规模商业生产。另外，根据本发明，可以提供一种筛选不易发生种菌硬化症的真姬菇菌株的简便方法。通过使用该方法，可以预先筛选出是否为容易发生种菌硬化症的真姬菇菌株，保证大规模商业生产的真姬菇子实体的成品率，从而能够有效地生产真姬菇子实体。