营养因子变化对真姬菇子实体发育的影响

摘要

真姬菇(Hypsizygus marmoreus)是一种具有很大市场潜力、营养价值很高的食药兼用菌。真姬菇是目前实现了工业化生产的食用菌中栽培周期最长的食用菌之一，子实体的发生量、质量与栽培基质中的营养成分有着密切的关系，然而，商业性栽培所用的栽培基质成分复杂，无法精确分析某一营养因子对真姬菇生长发育的影响。已有的关于真姬菇的研究，主要集中于培养条件的优化，生物学特性的研究、有效成分分析、药理作用的研究上，对其遗传学方面的研究仍较薄弱，对真姬菇子实体形成的分子机制上的研究更是空白。
　　 本研究以真姬菇SIEF3133菌株为材料，根据其生理生化的特点，设计了32种不同的液体合成培养基。通过对真姬菇在不同培养基上菌丝生长、原基形成和子实体发育状况进行分析，得到适合子实体生长发育的培养基；对真姬菇生长发育期间主要生理指标进行测定；调节葡萄糖浓度，分析葡萄糖浓度变化对真姬菇子实体发育的影响；获得不同葡萄糖浓度下，真姬菇菌丝体阶段和原基阶段的SAGE表达谱，分析比较真姬菇在不同葡萄糖浓度培养基上和不同发育阶段的基因表达差异。
　　 本论文的主要实验结果如下：
　　 1.根据真姬菇SIEF3133菌株的生理生化特点设计了32种不同的液体合成培养基，研究碳源(包括葡萄糖、羧甲基纤维素钠、淀粉、麦芽糖、果糖和乳糖)和氮源(L-谷氨酸钠、酵母提取物、胰蛋白胨、酸水解干酪素和硝酸铵)对真姬菇子实体发育的影响。对真姬菇在不同培养基上的生长发育状况进行分析，得到了一种最适合真姬菇子实体发育的液体合成培养基。培养基主要成分如下(g/L)：葡萄糖20 g、L-谷氨酸钠2 g、酵母提取物5 g、蛋白胨3 g、酸水解干酪素2 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O1.5 g、矿质元素溶液(A)10 mL、微量元素溶液(B)1 mL和维生素溶液(C)1 mL。真姬菇在该培养基上能正常发育，最终形成可育孢子的成熟子实体。
　　 2.对真姬菇子实体生长发育期间培养基内主要生理指标(生物量、还原糖、总糖含量、蛋白质和氨基酸含量)进行测定，在原基形成前每6天取样测定一次，而原基形成后每2天取样测定一次。结果显示，菌丝体生物量在培养结束后达到0.65 g，而培养基内的营养因子的含量总体上呈不断下降的趋势，还原糖含量从2 g持续下降至0.3 g，而总糖的变化比较复杂，氨基酸含量从0.33 g降至0.15 g，可溶性蛋白的含量则在培养过程中出现多次波动。对上述各生理指标的变化进行比较发现：营养因子的变化与菌丝生长发育有着密切的联系。
　　 3.通过调节培养基内葡萄糖的浓度，研究其对真姬菇原基形成的影响。培养基内葡萄糖浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L和40g/L，结果表明：培养基内葡萄糖的浓度不仅影响真姬菇原基形成的速度，还影响其形成的原基的形态；当其浓度达到40g/L时，原基呈现丛生状态。
　　 4.应用基因表达序列分析技术(SAGE)对不同葡萄糖浓度下(10g/L和40g/L)，真姬菇菌丝和原基阶段的基因表达进行研究。10-m1、10-m2、40-m3和40-m4这4个SAGE文库分别产生3665084、3713976、3528430和3783886个标签，其中特异标签数分别有176028、185985、186925和180610个。由于真姬菇尚无公布的基因组数据库，我们将这些标签与 NCBI上登录的担子菌基因组中标注的基因进行比对，结果显示：10-m1、10-m2、40-m3和40-m4内分别有237、252、260和241个特异标签与基因组内标签匹配。对这些SAGE文库内的标签进行比较分析后发现，无论在哪种培养基上，多个基因都在菌丝和原基阶段之间差异表达，这些基因可能参与真姬菇原基的发育，对其正常发育起着一定的作用。