穿龙薯蓣内生真菌及其应用

摘要

本发明公开了一株穿龙薯蓣内生真菌及其应用。本发明从穿龙薯蓣叶片中分离得到一株内生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4616；结合基因组DNA测序和形态学鉴定结果，本发明所分离的C39菌为丛梗孢目，丛梗孢科镰孢属(Fusarium)真菌。将本发明内生真菌C39的种子液接入到由穿龙薯蓣等植物所制备得到的固体发酵培养基中进行发酵培养，可以有效地提高药材中薯蓣皂苷元的含量。稳定性验证实验表明，内生真菌(Fusarium sp.)C39的稳定性良好，不同世代的C39菌经多世代的传递仍然保持固体发酵提高穿山龙等薯蓣类植物药材中薯蓣皂苷元含量的能力。

说明书

技术领域

本发明涉及植物内生真菌，尤其涉及来源于穿龙薯蓣类植物的内生真菌，本发明还涉及该穿龙薯蓣内生真菌在生物转化薯蓣皂苷类成分中的应用，属于植物内生真菌及其应用领域。

背景技术

薯蓣皂苷(dioscin)属于甾体皂苷，水解后可以得到薯蓣皂苷元(diosgenin)，不仅具有显著的抗肿瘤、抗炎、降血脂、免疫调节、抗艾滋病等作用，而且是目前世界上合成300多种甾体激素和避孕药物的重要原料。薯蓣皂苷主要存在于薯蓣科植物中，目前中国以穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)、盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)和黄山药(Dioscorea panthaica)等植物的根茎作为提取皂苷的主要原料，进行加工制剂。例如，生产临床常用的预防和治疗冠心病、心绞痛的药典药物“地奥心血康”等。但随着皂素工业的发展和国内、国际市场对薯蓣皂苷元需求量的增加，野生资源已渐趋衰竭，人工栽培面积有限，且薯蓣根茎类药材的栽培周期较长，从天然植物中提取薯蓣皂苷类原料难以满足市场日益增长的需求。所以寻求替代品或者加大已有资源的利用势在必行。

内生真菌与宿主植物具有互惠共生的关系，有些内生菌具有促进宿主植物合成活性成分的能力，通过内生菌的作用增加药用植物活性成分的产量。如果能从穿龙薯蓣植物中分离得到一株内生真菌，将其制备成种子液添加到薯蓣类药材中进行发酵，能够促使药材中存在的物质合成薯蓣皂苷元，这将极大的提高对薯蓣类药材的利用度。

发明内容

本发明目的之一是提供一种穿龙薯蓣中分离得到的新的内生真菌；

本发明目的之二是将所分离到的内生真菌应用于生物转化薯蓣皂苷类成分；

本发明目的之三是将生物转化薯蓣皂苷类成分的转化条件进行优化筛选得到一种最佳的转化方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明从穿龙薯蓣叶片中分离得到一株内生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4616；其分类命名是：镰孢(Fusarium sp.)；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2011年3月1日。

本发明内生真菌(Fusarium sp.)C39的形态学特征：将内生真菌(Fusarium sp.)C39菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，25℃，暗培养4天，观察到整个菌落致密，直径4.0cm，正面呈白色绒毛状，气生菌丝高2mm，背面菌落圆心处深红色，向外呈淡红色，最外周白色，边缘整齐。显微镜下显示，菌丝纤细，分枝，有隔，无色透明；分生孢子梗无色，细长，不分枝，孢子单生，无色，多细胞，圆筒形，端部渐尖，有的微弯曲。

结合C39菌的形态特征与《半知菌属图解》进行相对比较，初步分析C39菌属于丛梗孢目，丛梗孢科，镰孢属真菌。

本发明内生真菌(Fusarium sp.)C39的分子生物学鉴定结果：提取C39菌的基因组DNA，序列测定结果为SEQ ID No.1所示；将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL X 1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树(图7)。结合形态学鉴定结果，C39菌的特征描述符合镰孢属真菌。但经比对，未发现目前GeneBank中存在与其基因序列和形态特征完全相同的已知菌种。初步确定C39菌为丛梗孢目，丛梗孢科镰孢属(Fusarium)真菌。

C39菌多次传代后功能的稳定性验证：将不同世代C39菌的种子液进行药材的固体发酵，经过七个世代的传递仍然保持固体发酵提高薯蓣类药材中薯蓣皂苷元含量的能力。

本发明的另一个目的是将所分离得到的内生真菌(Fusarium sp.)C39应用于生物转化薯蓣皂苷元，包括：(1)制备内生真菌(Fusarium sp.)C39的种子液；(2)将薯蓣类植物粉碎成粗粉，得到固体发酵培养基；(3)向固体发酵培养基中接入种子液，发酵培养，即得。

其中，所述的薯蓣类植物包括穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)、盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)或黄山药(Dioscorea panthaica)等；更优选为穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)、盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)或黄山药(Dioscorea panthaica)它们各自的根茎或根。

本发明通过大量的实验对上述发酵培养条件进行了优化和筛选，结果发现，采用以下条件能够有效的提高药材中薯蓣皂苷元的转化率：

本发明通过实验发现，将薯蓣类植物粉碎成粗粉所得到固体发酵基进行高温灭菌后再接入种子液进行发酵，能够显著提高发酵产物中薯蓣皂苷元的含量；其中，所述的发酵条件优选为：发酵温度为25℃，发酵时间为8天。

附图说明

图1  薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的化学结构式。

图2  C39菌正面菌落形态特征。

图3  C39菌底面菌落形态特征。

图4  C39菌孢子形态特征。

图5  C39菌菌丝形态特征。

图6  C39菌扩增产物电泳图谱。M为Marker；1.2.3.4：C39扩增产物平行样。

图7  C39菌的ITS序列系统进化树。

图8  薯蓣皂苷元分光光度法含量测定的标准曲线。

图9  薯蓣皂苷元标准品的紫外吸收光谱图。

图10 薯蓣皂苷元HPLC法含量测定的标准曲线。

图11 薯蓣皂苷元标准品的紫外吸收光谱图。

图12 C39菌固体发酵产物的紫外吸收光谱图。

图13 C39菌固体发酵产物、空白药材和薯蓣皂苷元标准品色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1内生真菌C39的分离纯化及保存

1.内生真菌的分离

1.1植物组织表面消毒处理

在采集的样本中，挑选没有虫斑病斑的穿龙薯蓣叶片。样本先用自来水冲洗，洗去表面的泥土和灰尘，自然晾干。按以下方法进行表面消毒：

75％乙醇漂洗1-5分钟→3.5％次氯酸钠水溶液浸泡3-7分钟→无菌水冲洗3次，每次1分钟。

根据叶片的薄厚对表面消毒的时间进行筛选，对每种植物样本，选出最佳的表面消毒时间。在次氯酸钠溶液中浸泡的时间分别设为：3.0min，4.0min，5.0min，6.0min，7.0min。尽可能多地分离出植物的内生真菌，并且进行彻底的表面消毒。

1.2内生真菌的分离

内生真菌的分离采用组织块分离的方法。在无菌条件下，将消毒过的叶片剪去四周边缘，将中央部分剪成0.5cm³方块，然后将叶片接种于PDA培养基平板上，每个平皿内接种6块组织块，同时做3个平行。接种好的平皿置于25℃恒温培养箱中培养3-7天，每天观察记录。为检查材料表面消毒是否彻底做以下对照实验：

(1)无菌水对照法

将上述组织消毒的最后一次无菌水0.1mL涂于培养基表面，置于相同条件下培养，观察记录是否有真菌生长。

(2)组织块对照法

植物样本经过2.1.1项下的表面消毒后，将整片叶片不剪切，直接放在PDA培养基上，相同条件下培养，观察记录。

(3)空白培养基对照

将未种植植物组织片的空白培养基，置于25℃恒温培养箱中培养3-7天，每天观察记录。

1.3内生真菌的纯化

待样品切割边缘长出新菌丝，及时转入新配制的PDA固体培养基上培养，待菌落出现后，根据长出菌落的形态、大小、颜色的不同，分别挑取各菌落边缘的菌丝，接于新的平板上进行培养，继续观察。采用三点法逐步纯化，培养数日后，观察菌落的形态及颜色是否均匀，边缘是否整齐，确定是否纯化。

1.4内生真菌菌种保存

将多次纯化的菌种，移至试管PDA斜面培养基上，25℃下培养5天，待观察没有污染后，加入无菌液体石蜡，液面高于培养基1cm左右，对菌株编号后，放于室温及4℃的冰箱中保存。

从穿龙薯蓣新鲜植物中，共分离出内生真菌52株。

1.5对照实验

穿龙薯蓣内生真菌最佳分离条件下的对照试验结果如下：

(1)当无菌水的培养基表面无菌落长出，表明穿龙薯蓣组织表面消毒彻底，在实验培养基中自组织边缘分离出的真菌是植物的内生真菌而不是空气中或组织块表面附生的微生物。

(2)经过7天观察，未做分割叶片组织周围无菌长出，叶片枯萎。

(3)经过7天观察，未种植组织片的空白培养基表面微干，水分蒸发所致，但无菌生长，表明培养基配置及消毒合格，可用于内生真菌的培养。

实施例2穿龙薯蓣内生真菌C39的鉴定

1、C39菌的形态学鉴定

主要根据分离得到的内生真菌菌落特征，观察个体形态特征及其他一些生物学特征进行经典分类鉴定。

1.1载片培养

取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。为防止培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌后的20％甘油液3～4ml，然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载片培养。放在25℃的培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察。

1.2挑片观察

在载玻片上加一滴乳酸苯酚液棉兰染色液，用接种针从生长有真菌的平板中挑取带有孢子的真菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，并且用针尖将其分散开，盖好盖玻片即得载片标本。

1.3插片培养

插片法：将内生真菌接种在琼脂平板上，将灭菌的盖玻片45度角插于固体培养基中，使内生真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。

乳酚棉蓝染色：插片用苯胺蓝染色15min后，加入几滴乳酚油为浮载剂，在显微镜下观察。乳酸苯酚液加苯胺蓝(棉蓝)是真菌标准的浮载剂。(碱性染料苯胺蓝可使真菌的原生质着色，而不染色细胞壁。)

2、C39菌的分子生物学鉴定

2.1 C39菌基因组DNA的提取

(1)取C39菌斜面培养的菌种，接种于200mLPD液体培养基中，25℃，130r/min振荡培养3d。2层无菌纱布过滤出菌丝，用无菌水洗2次，再用灭菌生理盐水洗2次，无菌滤纸吸去菌体表面水分，获得菌丝体。

(2)将收集的菌丝加液氮研磨，置于含有700μl DNA提取缓冲液[200mM Tris-HCl(PH＝8.0)，25mM EDTA(PH＝8.0)，250mM NaCl，0.5％ SDS(PH＝7.5)]的1.5ml离心管中，用微量移液枪混匀，37℃水浴30min。

(3)12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管中。

(4)加入等体积苯酚-氯仿(1∶1)溶液，混匀5min，12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管。

(5)加入等体积氯仿，混匀，12000r/min离心2min，将上层溶液移入新的离心管中。

(6)加入2倍体积冰乙醇，-20℃放置2小时。

(7)取放置后的DNA提取液，12000r/min离心5min，去上清液，加入70％乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min离心2min。

(8)去上清液，挥干溶剂，加入75μl 1×TE溶解沉淀即为DNA模板。

(9)DNA模板置于-20℃保存备用。

2.2 C39菌基因组DNA的检测

取少量DNA模板，采用分光光度法测定A₂₆₀/A₂₈₀比值，检测DNA模板纯度，并计算DNA浓度。

采用1×TAE作为电泳缓冲液，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测真菌基因组DNA模板。加样量为6μl，电场强度为5V/cm，电泳时间1.5小时。紫外分析仪下检测真菌基因组DNA提取结果。

2.3 C39菌基因组DNA的PCR扩增反应

在超净工作台内配制PCR扩增试剂：

扩增的反应体系见表1。

表1

  反应组分  体积(μL)  Taq酶(0.5U/μL)  0.5  10×PCR缓冲液  5  引物1(10μM)  2  引物2(10μM)  2  dNTP(2.5mM)  0.4  模板DNA  3  MgCl₂  3  去离子水  34.1

PCR反应程序如下：

1、起始变性    94℃    5min，

2、变性        94℃    30s，

3、退火        55℃    30s，

4、延伸        72℃    1min，

2-4            30个循环，

5、延伸        72℃    10min。

PCR扩增后，取扩增产物5μL，在120V/cm下电泳，约45min后，在紫外分析仪上检测条带，鉴定目的条带与预期大小是否相符。

2.4 PCR扩增产物的序列测定与数据处理

PCR扩增产物由上海英骏生物技术有限公司北京测序部纯化测序。将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL X 1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树。

3、结果与分析

3.1 C39菌的形态学鉴定结果

C39菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，25℃，暗培养4天，观察到整个菌落致密，直径4.0cm，正面呈白色绒毛状，气生菌丝高2mm，背面菌落圆心处深红色，向外呈淡红色，最外周白色，边缘整齐。显微镜下显示，菌丝纤细，分枝，有隔，无色透明；分生孢子梗无色，细长，不分枝，孢子单生，无色，多细胞，圆筒形，端部渐尖，有的微弯曲(图2-5)。

结合C39菌的形态特征与《半知菌属图解》进行相对比较，初步分析C39菌属于丛梗孢目，丛梗孢科，镰孢属真菌。

3.2 C39菌的分子生物学鉴定结果

3.2.1 C39菌DNA的检验结果

表2 C39菌基因组DNA模板纯度与浓度

由表2可以看出，所提取基因组DNA的A₂₆₀/A₂₈₀的值介于1.8-2.0之间，但是提取物中可能含有RNA杂质，然而本实验扩增片段为特异性的rDNA序列，非特异性的RNA杂质不会对扩增结果产生干扰，且随后的实验证明，少量RNA杂质并不影响ITS序列的PCR扩增。在预先检测电泳图谱上DNA模板条带清晰，且无拖尾现象，证明所得基因组DNA完整，符合进行下一步PCR扩增条件。见图6。

3.2.2 C39菌的基因组DNA测序结果：

将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息见表3。

表3

应用CLUSTAL X 1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树见图7。

可以看出C39菌与GQ866861.1聚类在同一分支，亲缘关系最为相近。对其序列对比分析可知，二者相似度为100％(图7)，然而两种真菌的形态学特征不同，区别较大。因此，只能初步推断C39菌可能为镰孢属真菌。

结合形态学鉴定结果，C39菌的特征描述符合镰孢属真菌。但经比对，未发现目前GeneBank中存在与其基因序列和形态特征完全相同的已知菌种。初步确定C39菌为丛梗孢目，丛梗孢科镰孢属(Fusarium)真菌。

实验例1 C39菌多次传代后功能的稳定性验证

1不同世代C39菌的种子液制备

在无菌条件下，将4℃冰箱中保藏的C39菌接种到新鲜的PDA固体平皿培养基上，于25℃恒温培养箱中暗培养约4～5天，待菌落长满平皿的3/4，此为C39菌的第一世代F1。用直径6mm的打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100mlPD液体培养液的250mL锥形瓶中，并在瓶中加入10粒直径0.5cm的无菌玻璃珠，利于菌丝体的分散。25℃使菌丝朝上静止12小时后，置于恒温振荡培养箱130r/min，25℃培养2天。

同时在无菌条件下，用接种针从F1的培养基上挑取少量菌丝接种到新鲜的PDA固体平皿培养基上，于25℃恒温培养箱中培养约4～5天，待菌落长满平皿的3/4，此为C39菌的第二世代F2，并制备种子液。依次进行，直至得到F7的种子液。

2药材的固体发酵实验

发酵方法同实验例2。

3样品处理及含量测定

方法同实验例2。

不同世代固体发酵物样品薯蓣皂苷元含量结果见表4。

表4  功能的稳定性验证(灭菌)结果

通过上表可知，C39菌经过七个世代的传递仍然保持固体发酵提高穿山

龙药材中薯蓣皂苷元含量的能力。

实验例2内生真菌C39对薯蓣皂苷类成分的生物转化

1.1内生真菌的活化培养及种子液制备

1.1.1内生真菌的活化培养

在无菌条件下，将4℃冰箱中保藏的穿龙薯蓣内生真菌C39接种到新鲜的PDA固体平皿培养基上，于25℃恒温培养箱中暗培养约4～5天，待菌落长满平皿的3/4时备用。

1.1.2内生真菌的种子液制备

用直径6mm的打孔器，在长势良好的菌落边缘处打孔，取菌饼接种于装有100mlPD液体培养液的250mL锥形瓶中，然后置于恒温振荡培养箱中，130r/min，25℃培养2天。做平行样8份。

1.2固体发酵的方法

称取8份穿山龙药材粗粉，每份10g，分别置于500mL锥形瓶中，用适量蒸馏水润湿，封瓶膜封口，121℃湿热灭菌30min，待冷却后于无菌条件下接种内生真菌种子液10mL，置于恒温恒湿箱25℃静止培养8天。

以未接任何菌种的药材粗粉为药材灭菌空白，同样操作，在相同条件下培养8天。

1.3样品处理

将发酵好的固体发酵物转移至平皿中，适当破碎，50℃烘干48小时，然后粉碎，用100mL正丁醇超声提取2次，每次50分钟，合并提取液。减压回收提取液至干，残渣加入2.5mol/L盐酸100mL沸水浴回流水解3小时，酸水放冷后以适量氯仿萃取3次，合并氯仿层，用蒸馏水洗至中性，适量活性炭脱色。抽滤，回收氯仿至干，残渣加甲醇定容至50mL。得固体发酵物样品溶液，备用。

同样方法处理空白对照样品，得药材灭菌对照溶液，备用。

1.4薯蓣皂苷元含量测定

1.4.1薯蓣皂苷元标准品溶液的制备

精密称取薯蓣皂苷元标准品适量，加色谱甲醇制成浓度0.639mg/mL的标准品溶液，备用。

1.4.2薯蓣皂苷元分光光度法含量测定

参考文献方法，分别精密吸取薯蓣皂苷元标准品溶液50μL、75μL、100μL、125μL、150μL置10mL具塞试管中，挥尽溶剂，分别精密加入高氯酸5mL，于70℃水浴15min，冰水冷却后，在410nm波长处测定吸光度。以薯蓣皂苷元标准品的质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y＝0.0119x-0.166(R²＝0.9968)；线性范围为：31.95μg-95.85μg，见图8。

1.4.3薯蓣皂苷元HPLC法含量测定

1.4.3.1检测波长的确定

参照《中国药典2005版》一部，药材穿山龙中薯蓣皂苷元含量的测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(84∶16)为流动相，检测波长为203nm，对薯蓣皂苷元标准品进行测定，得到标准品的高效液相紫外图谱，见图9，用甲醇-水系统时薯蓣皂苷元的紫外最大吸收出现在为205.8nm，所以检测波长选定为206nm。

1.4.3.2溶剂系统的选择

本实验采用迪马公司生产的Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，大连物化所C18保护柱。考察了甲醇-水系统不同比例分离效果，确定色谱条件如下：

色谱柱：Diamonsil C18(5μm 250×4.6mm)；大连物化所C18保护柱

流动相：96％甲醇-4％水等度洗脱

柱温：30℃

流量：1.0mL/min

检测波长：206nm

1.4.3.3方法学考察

线性关系考察：按选定的色谱条件，将薯蓣皂苷元标准品溶液分别进样5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL，测得薯蓣皂苷元的峰面积。根据色谱峰面积Y与标准品质量X做标准曲线，见图10。得线性回归方程：Y＝371246X+349868(R²＝0.9994)，表明薯蓣皂苷元在2.13μg-19.17μg范围内线性良好。

精密度实验：精密吸取上述薯蓣皂苷元标准品溶液，连续进样5次，每次20μL，测定峰面积，其薯蓣皂苷元含量的相对标准偏差为0.37％，表明高效液相色谱仪精密度良好，结果见表5。

表5  精密度试验结果(n＝5)

稳定性实验：称取同一批穿山龙药材粗粉1g，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别在0h、6h、12h、18h、24h注入HPLC，每次进样20μL，测定薯蓣皂苷元含量。经计算其相对标准偏差为0.09％，表明样品24h内样品稳定性良好，结果见表6。

表6  稳定性试验结果(n＝5)

重现性实验：称取同一批穿山龙药材粗粉5份，每份1g，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别进样20μL，测定薯蓣皂苷元含量。经计算其相对标准偏差为0.35％，表明测定方法重现性良好，结果见表7。

表7  重复性试验结果(n＝5)

加样回收率实验：称取已知含量的穿山龙药材粗粉约5份，每份1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别进样20μL，测定薯蓣皂苷元含量，计算加样回收率。经计算其相对标准偏差为0.61％，，5次测定的平均加样回收率为99.96％，表明该方法测定结果准确，结果见表8。

表8  加样回收率试验结果(n＝5)

1.4.3.4含量测定

采用上述确立的HPLC色谱分析法对固体发酵物样品溶液中的薯蓣皂苷元成分进行含量测定。

1.5结果与分析

1.5.1 C39菌固体发酵产物、空白药材对照和薯蓣皂苷元标准品色谱图见图11、图12、图13。由图13可知，药材经过C 39菌固体发酵后提高的物质的峰与薯蓣皂苷元标准品的峰重合，结合这个峰的紫外吸收光谱图(图11)与薯蓣皂苷元标准品的紫外吸收光谱图(图11)，可以初步确定C39菌对穿山龙药材生物转化后提高的物质为薯蓣皂苷元。

1.5.2薯蓣皂苷元含量测定具体结果见表9。

表9  穿山龙药材经不同发酵方法发酵后测定薯蓣皂苷元含量结果(n＝8)

从上表可知，C39菌对经过高温灭菌的药材固体发酵，能够较稳定的提高薯蓣皂苷元含量60％-80％，说明重复实验可行；对未经高温灭菌的药材，虽然有部分样品提高幅度在90％以上，但是由于穿山龙药材中存在大量杂菌，发酵过程中极易掩盖C39菌，即使接入足够量C39菌种子液，使其占据优势菌群，但生长过程仍然缓慢，不能保证重复实验的成功率。

综上，本研究选择C 39菌作为固体发酵菌种，基质选择经过高温灭菌的穿山龙药材。

实验例3内生真菌C39对穿龙薯蓣不同溶剂提取物的液体发酵实验

1、实验方法

1.1种子液制备

同实验例2。

2.2不同药材部位提取

称取穿龙薯蓣药材粗粉24份，每份10g，置500mL锥形瓶中，分别用100mL水、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚超声提取30min，抽滤，滤渣再用100mL各相应的溶剂提取一次。合并两次滤液，减压回收至干，备用。

2.2.3液体发酵

用PD液体培养基(不加琼脂，其余成分同PDA培养基)200mL转移药材提取物至500mL锥形瓶中，封瓶膜封口，121℃湿热灭菌30min。待冷却后于无菌条件下接种内生真菌C39种子液10mL，置于恒温振荡培养箱中，130r/min，25℃培养7天。

以未接任何菌种添加了药材提取物的PD液体培养基为提取物灭菌空白，同样操作，在相同条件下培养7天。

2.2.4样品处理

将培养7天后的液体发酵物以3000r/min的速度离心10分钟，得到上清液和菌丝体两部分，处理方法如下：

上清液：以等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层。

菌丝体：收集菌丝体用蒸馏水冲洗2次，50℃烘干48小时，然后粉碎，用100mL正丁醇超声提取2次，每次50分钟，合并提取液。

合并上清液和菌丝体的正丁醇提取液，减压回收至干，残渣加入2.5mol/L盐酸100mL沸水浴回流水解3小时，酸水放冷后以适量氯仿萃取3次，合并氯仿层，用蒸馏水洗至中性，适量活性炭脱色。抽滤，回收氯仿至干，残渣加甲醇定容至50mL。得液体发酵物样品溶液，备用。

同样方法处理空白对照样品，得提取物灭菌对照溶液，备用。

2.2.5含量测定

同实验例2的1.4节的内容(薯蓣皂苷元HPLC法含量测定确立的色谱条件对固体发酵物样品溶液分别进行含量测定)，进样量25μL。

2、实验结果

实验结果见表10。

表10  对不同溶剂的穿龙薯蓣药材提取物的发酵产物中薯蓣皂苷元测定结果

“--”表示薯蓣皂苷元为痕量或未见

从表10看出，穿龙薯蓣的正丁醇和乙酸乙酯提取物经过C39菌的液体发酵以后，薯蓣皂苷元含量有大幅提高；水和石油醚的穿龙薯蓣提取物仅见痕量或未见薯蓣皂苷元。可见，在C39菌作用下新合成薯蓣皂苷元的前体物质应该存在于穿龙薯蓣药材的正丁醇和乙酸乙酯提取部位。并由此证明，提高薯蓣类药材发酵物中薯蓣皂苷元含量的现象，不是C39菌单纯通过增加药材化学成分从植物细胞中溶出、增大成分的提取率来实现的，而是发生了化学成分的生物转化的结果，即：在穿龙薯蓣药材的正丁醇和乙酸乙酯提取部位中存在着薯蓣皂苷类成分的前体物质，这种(些)前体物质在内生菌C39的作用下生物转化生成薯蓣皂苷元。

实验例4薯蓣类药材固体发酵条件的优化

1.发酵时间考察

发酵方法同实验例2。发酵时间设定为：4天、6天、8天、10天、12天，每个发酵时间做3个平行样。

2.初始含水量考察

发酵方法同实验例2。加水润湿药材的体积设定为：1mL、5mL、10mL、15mL、20mL，每个含水量做3个平行样。

3.发酵温度考察

发酵方法同实验例2。发酵温度设定为：18℃、22℃、25℃、30℃、37℃，每个含水量做3个平行样。

4.接种量考察

发酵方法同实验例2。接种量设定为5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，每个含水量做3个平行样。

5.样品处理及含量测定

方法同实验例2。各组数据均经统计学软件SPSS17.0处理。结果见表11、表12、表13、表14。

表11不同发酵时间发酵物薯蓣皂苷元含量测定结果(n＝3)

注：15天组与5天组、10天组比较*P＜0.05。

参照表11，从平均值看，10天发酵时间最好，结合P值，8天以后薯蓣皂苷元含量变化不大，所以发酵时间选择8天。

表12初始含水量优化(灭菌)结果(n＝3)

注：20mL组与10mL组、15mL组、30mL组比较*P＜0.05。

参照表12，从平均值数据和P值看出，用10mL水润湿药材最佳。

表13  发酵温度优化(灭菌)结果(n＝3)

注：28℃组与20℃组、24℃组、37℃组比较*P＜0.05。

参照表13，25℃组虽与30℃组没有显著性差异，但平均值最大，所以固体发酵温度选择为25℃。

表14  接种量优化(灭菌)结果(n＝3)

注：2mL组与7mL组、10mL组比较*P＜0.05。

参照表14，10mL组虽然与15mL组没有明显差异，但平均值较高，因此接种量选择10mL。

根据以上实验结果，经过高温灭菌的固体发酵最佳条件是：用10mL水润湿药材，接种种子液10mL，25℃发酵8天。