一种利用变温脱毒技术生产马铃薯PVA脱毒苗的方法

摘要

一种利用变温脱毒技术生产马铃薯PVA脱毒苗的方法，它属于马铃薯良种繁育体系中的一部分。本发明提供的利用变温脱毒技术生产马铃薯PVA脱毒苗的方法包括如下的步骤：(1)获得组培苗；(2)变温处理；(3)继代与连续变温处理；(4)常规扩繁。上述方法共计42天的变温试验处理即可获得马铃薯PVA脱毒苗。本发明获得马铃薯PVA脱毒苗效率高、省时、省力、节约能源、技术程序简单，促进马铃薯产业的健康、持续发展。

说明书

技术领域

本发明涉及一种马铃薯脱毒种苗繁育体系中的脱毒技术，尤其是涉及一种采用变温脱毒技术生产马铃薯PVA脱毒苗的脱毒技术。

背景技术

马铃薯是我国第四大粮食作物之一，其在栽培过程中容易感染多种病毒和类病毒，表型产生卷叶、花叶、黄化、植株莲座化等复杂症状。在农业生产中，马铃薯主要通过无性繁殖扩大生产，植株体内的病毒含量可以逐代累积，造成病毒性种质资源的退化，减产幅度达40～70％。由于马铃薯种质资源世界性的交流日益扩大，导致了马铃薯病毒的世界性传播，我国较为普遍的有7种之多，多种病毒单独或者复合引起各种表型的或者生理性的各种症状，严重影响了马铃薯的产量和品质。

马铃薯PVA病毒是少数几个能引起马铃薯主栽品种表现出花叶症状的病毒种类之一。马铃薯PVA病毒单独浸染引起轻度花叶或者无明显症状，但其经常与其他病毒，如马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)、马铃薯M病毒(Potato virusM，PVM)、马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)等病毒复合侵染，引起严重减产。PVA可随种薯传播，而且至少有7种蚜虫以非持久性的方式传毒，这些蚜虫在我国普遍存在，因此该病毒在我国扩散可能性很大，具有较高流行风险。

利用脱毒种苗生产脱毒种薯是提高马铃薯产量和品质的重要手段。传统的脱毒种苗的获得主要是采用茎尖培养的方式培养脱毒种苗，进而结出无病毒的块茎，形成一个完整的脱毒快繁体系。采用组织培养的方法通过将马铃薯块茎或者植株转化成无菌苗的方法并不能去除马铃薯PVA病毒，如2002年植物保护学报发表的《马铃薯PVA试管苗保存效果的研究》表明切取马铃薯试管苗0.6～1cm的茎尖与常规培养保存的PVA有相同的侵染力。通过采用茎尖培养以及茎尖培养结合热处理、药物处理的方式获得马铃薯脱毒苗的研究已经有很多，如：2001年西北农林科技大学的硕士论文《高效马铃薯茎尖脱毒、快繁及微型薯繁育技术研究》表明34℃处理3周处理无菌苗和以38℃处理3周带芽马铃薯块茎较好，热处理后剥取茎尖对PVY脱除率为80～82.5％，对PVX脱除率为50～65％之间；2005年发表于西南农业大学学报自然科学版的《马铃薯茎尖分化成苗的培养基优化研究》、2005年西南农业大学硕士论文《马铃薯茎尖脱毒技术体系优化研究》报道40℃(4h)+25℃(20h)变温处理2周的方法对带芽块茎进行热处理，对PLRV脱除率为100％，对PVY脱除率为96.87％，对PVX脱除率为89.33％，对PVS脱除率为87.93％、2006年新疆农业大学硕士论文《马铃薯的茎尖脱毒、复壮及RT-PCR检测》、2007年发表于山西农业科学的《马铃薯茎尖培养脱毒率的影响因素试验》、2007年发表于吉林农业科学的《马铃薯茎尖组织培养脱毒的研究》等，以及2007年石河子大学的硕士论文《专用马铃薯高效脱毒技术研究》报道40℃(4h)+16℃(20h)变温处理8周带芽马铃薯块茎，其PVX脱除率为62％，对PVY脱除率为78％。以上马铃薯脱毒技术的不足之处是：一是茎尖脱毒技术要求技术水平高，技术熟练；二是不同的马铃薯品种或者品系要求专用的配方，适应性不广泛；三是生产脱毒种苗的周期长，一次性获得的脱毒种苗技术小，不利于短时间的大批量的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种在转化成试管苗或者已有试管苗的基础上，采用变温脱毒技术，能达到降低生产成本、省工、省时、节能、简化生产技术程序，高效的生产马铃薯PVA脱毒苗的脱毒技术，能适应工厂化的生产。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，具体步骤如下：

(1)获得组培苗；

(2)变温处理：取上述步骤获得的组培苗，使其在36℃下处理12小时；20℃下处理12小时，光周期为12h/12h，光照强度为2000～4000勒克斯；连续处理4周；

(3)继代与连续变温处理：分别取上述变温处理后的组培苗从形态学上端的第一节位、第二节位和第三节位茎段按照茎段位置分类接种于无激素添加剂的MS培养基上继续变温处理2周，变温处理条件同步骤2，光照强度为2000～4000勒克斯，共计42天的变温试验处理即可获得马铃薯PVA脱毒苗。

(4)常规扩繁：取共计连续处理6周的组培苗，继代后常规培养，培养温度为25℃，光照为2000～4000勒克斯，每瓶10颗；光周期为14小时光照、10小时黑暗。

最好在上述第(4)中，增加对连续处理6周后的组培苗取样进行病毒检测，如检测证实无病毒后，则再继代后常规培养。

获得组培苗的方法是现有技术中熟知的方法。但是，本发明中热处理的时间与组培苗的成活率有极为显著的关系。不同的温度和时间的组合对试管苗的生长有影响，因为只有适合的温度组合，才能抑制病毒的复制，而马铃薯组培苗继续生长，从而脱掉病毒。

在现有报道的文章中，有过类似的变温脱毒处理技术来脱毒马铃薯病毒的。如马铃薯卷叶病病毒、马铃薯PVY病毒、马铃薯PVX病毒、马铃薯PVS病毒等。但本发明与其他相关报道显著不同的是，本发明以马铃薯组培苗为脱毒材料，不需剥取茎尖材料培养，应用范围较其他研究报道的以处理马铃薯块茎为研究材料更为广泛；其次是本发明的变温处理参数与其他报道的研究差异较大，而且最主要的是针对马铃薯PVA病毒。

在病毒检测后进行光照培养，这样的目的是为了扩大无病毒马铃薯苗的生产。而且最主要是通过病毒检测后再扩繁是为了排除未脱毒掉的马铃薯组培苗。后面的光照处理不属于脱毒的范围，而是正常的马铃薯组培苗的扩繁技术。

在本发明实施例中，说明了可以在进行变温脱毒步骤前，先进行检测，看所获得的组培苗是否带PVA病毒。然后再进行变温脱毒。

用本发明提供的变温脱毒方法处理带病毒马铃薯组培苗，能获得马铃薯PVA病毒脱毒苗，效率高、省时、省力、节约能源、技术程序简单，促进马铃薯产业的健康、持续发展。

附图说明

图1为本发明之设计流程图；

图2为本发明实施例中马铃薯田间苗、组培苗的RT-PCR电泳图，其中，M：Mark；1-2：阴性对照；3-4：组培苗；5-6：盆栽苗；7-8：田间苗；9：阳性对照；

图3为本发明实施例中马铃薯组培苗变温脱毒处理后RT-PCR电泳图，其中，1：阴性对照；2：变温处理4周第一节位苗；3：变温处理4周第二节位苗；4：变温处理4周第三节位苗；5：变温处理6周第一节位苗；6：变温处理6周第二节位苗；7：变温处理6周第三节位苗；8：阳性对照；M：Mark；

图4为本发明实施例中马铃薯组培苗变温脱毒处理后RT-PCR电泳图，其中，1：阴性对照；2-16：变温处理6周后继带组培苗；17：阳性对照；M：Mark。

具体实施方式

实施例1

1)组培苗的转化：取经常温储藏的马铃薯品种为中寨黄皮的块茎，在温度为25℃的黑暗条件下处理7天后得到嫩芽，取嫩芽经0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗4次后，在无激素添加剂的MS培养基上25℃培养，光照强度为2000～4000勒克斯，5天后得到无菌苗。

2)病毒检测：对来源同一个马铃薯块茎的无性苗后代进行病毒检测，依托RT-PCR技术，以PVA引物序列Sense：5’-TGCCCAGGTATGGTCTTCAACG-3’和Reverse：5’-ACTTCGGTTACACCCCCTTCAC-3’来检测试管苗的带毒情况。病毒检测方法按X.NIE的方法进行(X.Nie，R.P.Sing.2001，Anovel usage of random primers for multiplexRT-PCR detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubers.Journal of VirologicalMethods 91，37-49)进行。检测结果见图2。图2表明本发明所处理的试验材料在脱毒前都是带病毒的。

3)基础苗的扩繁：对检测带PVA病毒的组培苗扩繁，培养基为无激素添加剂的MS培养基，培养温度为25℃，光照为2000～4000勒克斯，每瓶10颗；组培容器为底径6cm，高度9cm的玻璃瓶。

4)变温处理：取生长10天的组培苗10瓶在光照培养箱中变温处理，12小时36℃处理，12小时20℃处理，光周期为12h/12h光照强度为20.00～4000勒克斯。连续变温处理4周。

5)连续变温处理：分别取连续变温处理4周组培苗从形态学上端的第一节位、第二节位和第三节位茎段按照茎段位置分类接种于无激素添加剂的MS培养基上继续变温处理2周，光照强度为2000～4000勒克斯。

6)病毒检测与扩繁：取共计连续处理6周的组培苗，取样进行病毒检测，检测方法同第2步中的检测方法，检测结果见图3、4。图3的2-4条泳道表明本发明在经过4周的连续变温处理后，马铃薯PVA病毒是没有完全脱掉；而5-7泳道表明经过连续6周变温处理马铃薯材料已经将马铃薯PVA病毒脱掉。图4表明取自连续处理6周的不同节位的马铃薯组培苗经病毒检测已经完全脱掉病毒。

继代后常规培养，培养温度为25℃，光照为2000～4000勒克斯，每瓶10颗；光周期为14小时光照、10小时黑暗；共计42天的变温试验处理即可获得马铃薯PVA脱毒苗。