改善与谷蛋白摄入相关之病症个体健康状况的微生物

摘要

本发明涉及用于治疗食物变态反应、特别是乳糜泻的微生物以及选择这种微生物的方法。所述微生物的作用机制包括：(i)调节固有免疫应答和适应性免疫应答；(ii)减少毒性表位在肠腔中的浓度；(iii)增强抵抗有害抗原和细菌的屏障防御功能；和(iv)提供促进消化的酶活性。

说明书

技术领域

本发明涉及食品工业和药学领域。具体地，本发明涉及益生菌(probióticos)及以下形式的衍生产品领域：功能性食品和新型食品、益生菌、合生元(simbióticos)、营养保健品(nutracéuticos)或食品补充剂以及临床应用的药物组合物。

背景技术

乳糜泻(enfermedad celíaca)是遗传性易感个体患有的一种影响肠的肠病，其具有由于对谷物中谷蛋白(gluten)持久不耐受而导致的免疫性质。该疾病具有广泛的临床谱，包括典型的、非典型的、沉默的(silentes)和潜在的形式。典型形式最常存在于生命的第一年(6-24个月)，主要表现为肠道症状以及相关变化(吸收不良、慢性腹泻、体重减轻、异常饱胀、生长迟缓等)。它是目前最常见的慢性疾病，其发病率在一般人群中为0.7-2.0％，在一级亲属中为15-20％。此外，谷蛋白摄入和乳糜泻还与其他病症有关，例如唐氏综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、肌病、多发性硬化、关节炎、孤独症、精神分裂症、抑郁症、淋巴瘤以及共济失调。谷蛋白摄入与精神障碍、神经障碍以及行为障碍之间的关系被认为是产生生物活性肽(例如具有阿片样活性的外啡肽(ejemplo))的结果。

谷蛋白(麦醇溶蛋白(gliadina)及其类似物谷醇溶蛋白(prolamina)和麦谷蛋白(glutenina))代表着诱发乳糜泻和其他相关病症的主要环境因素。这些蛋白包含富含脯氨酸和谷氨酰胺的肽序列，使其比食物中的其他蛋白质对消化酶更具抵抗力，因而能够保留于肠腔中。在遗传性易感个体中，这些肽是导致异常反应的原因，所述异常反应涉及固有免疫系统和适应性免疫系统，并且全面地导致肠粘膜的慢性炎症、上皮内淋巴细胞增多、隐窝增生以及小肠绒毛的进行性衰退(包括其全部消失)。摄入谷蛋白后产生的毒性肽可以穿过肠上皮，并优选在组织型谷氨酰胺转移酶的作用下发生脱酰胺作用，随后被抗原呈递细胞的HLA-DQ2或HLA-DQ8分子识别。因此，它们被呈递给T细胞受体，使其活化。这涉及CD4抗原(又被称为辅助性T细胞(Th))的表达及其分化成为淋巴细胞亚群，因此涉及获得性免疫。Th2亚群与B细胞相互作用，后者自身分化成为浆细胞并产生抗体抗麦醇溶蛋白、抗肌内膜和抗组织型谷氨酰胺转移酶。Th1亚群能够使促炎性细胞因子(主要是IFN-γ)的分泌及IFN-γ/IL-10比率增加(Salvati等，2005.Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadindependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa.Gut.54：46-53)。谷蛋白肽还可以引起肠上皮中由细胞因子IL-15介导的反应，其涉及固有免疫系统(Green和Jabri，2006.Celiac disease.Ann RevMed.57：207-21)。摄入的麦醇溶蛋白刺激上皮细胞中产生IL-15，其有利于上皮内细胞毒性CD8T淋巴细胞的克隆性增殖以及IFN-γ的表达(Jabri等，2000.Selective expansion of intraepithelial lymphocytes expressing theHLA-E-specific natural killer receptor CD94 in celiac disease.Gastroenterology.118：867-79；Mention等，2003.Interleukin 15：a key todisrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis inceliac disease.Gastroenterology.125：730-45；Forsberg等，2007.Concomitant increase of IL-10 and pro-inflammatory cytokines inintraepithelial lymphocyte subsets in celiac disease.Int Immunol.2007：19，993-1001)。乳糜泻患者肠道微生物群的组成与健康对照个体相比还表现出不平衡，其特征在于促炎性细菌占优势且乳酸菌和双歧杆菌的比例和组成减少(Sanz等，2007.Differences in faecal bacterial communities in celiacand healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gelelectrophoresis.FEMS Immunol Med Microbiol.51(3)：562-8。Nadal等，2007.Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of childrenwith celiac disease.J Med Microbiol.2007Dec；56(Pt-12)：1669-74；Collado等，2009.Specific duodenal and faecal bacterial groups are associated withpaediatric celiac disease.J Clin Pathol.62：264-269)。在肠腔和肠上皮中，谷蛋白以及有害细菌的增加可以联合作为刺激因素，或者促进活动性乳糜泻和其他相关紊乱症的病理过程和促炎性反应。同样地，某些细菌物种的存在或不存在可以促进或防御谷蛋白毒性。

乳糜泻具有高发病率和严重性。但是，目前对这些患者还没有治疗方法。唯一的替代方案是保持严格的终生无谷蛋白饮食。遵守该饮食建议很难，且患者继续忍受胃肠症状、营养不足以及更高的健康风险(免疫病症、骨质疏松、不育症、癌症等)，并且其肠生态系统的平衡也绝不能完全恢复。此外，患有顽固性乳糜泻的个体(5-10％)对该饮食建议无响应。

目前正在研究中的用于治疗乳糜泻的治疗选择或辅助剂(co-adjuvant)包括口服得自植物或微生物的蛋白水解酶，以加快谷蛋白肽的胃肠消化(Shan等，2005.Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue.20050249719/A1；Marti等，2006.Prolyl endopeptidase mediateddestruction of T cell epitopes in whole gluten.20060286601/A1；Stepniak yKoning.2006.Enzymatic gluten detoxification：the proof of the pudding isin the eating！Trends Biotechnol.24：433-4；Gass等，2007.Combinationenzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients withceliac sprue.Gastroenterology.133：472-80)。该策略的有效性已在模型系统中利用蛋白质和肽制备物或其重组等效物进行了证实，但是对于从食物中摄取谷蛋白的患者，仍需要证明其体内效力的研究。尽管该治疗方法具有作为无谷蛋白饮食之辅助方法的潜在益处，但其作用高度依赖于摄入酶制剂的时间，且仅允许偶尔摄入降低了毒性阈值的谷蛋白。提出的其它替代性方法包括开发组织型谷氨酰胺转移酶抑制剂化合物(Khosla等，2006.Transglutaminase inhibitors and methods of use thereofWO2007025247)、能够捕获麦醇溶蛋白肽的抗体(Fox，2007.Antibodytherapy for treatment of diseases associated with gluten intolerance.20070184049/A1)、阻断谷蛋白肽与HLA-DQ2或HLA-DQ8结合位点的化合物(Sollid等，2007.Drug therapy for celiac sprue.20070161572/A1；Peakman和Chicz.2007.Peptide epitopes recognized by disease promotingCD4+T lymphocytes.20070142622/A1)、促炎性细胞因子拮抗剂(例如IFN-γ)(Maroun等，2007.Interferon antagonists useful for the treatment ofinterferon related diseases.20070160609/A1)、口服施用重组调节性细胞因子(Salvati等，2005.Recombinant human interleukin 10 supresses gliadindependent T cell activation in ex vivo cultured celiac intestinal mucosa.Gut.2005；54：46-53)、参与炎症反应之粘附分子的抑制剂以及能够使细胞旁通透性增加之连蛋白(zonulin)的抑制剂(Paterson和Ginski.2007.Formulations for a tight junction effector US20070196501/A1)。这些策略需要对参与几个生物学过程的分子进行修饰，且其应用可导致不期望的继发作用。在食品工业中，正在研究一些策略，以避免通过对某些种类的小麦进行基因操作而使我们所摄入的食物中存在毒性表位，并在谷物发酵过程中使用能够使毒性表位降解的蛋白水解酶和乳酸杆菌。这种方法的目的是改进乳糜泻患者的饮食，给他们提供更多种类的产品，但却不能预防或治疗疾病本身(Rizzello等，2007.Highly efficient gluten degradation bylactobacilli and fungal proteases during food processing：new perspectivesfor celiac disease.Appl Environ Microbiol.73：4499-507)。

本发明基于双歧杆菌属(Bifidobacterium genus)菌株作为治疗和预防乳糜泻以及相关病症的益生菌或药物制剂的用途。为此目的而特别选择的双歧杆菌有很多益处。双歧杆菌具有能够定殖于新生儿肠道中的特殊能力，显著地促进其防御体系(免疫等)的建立并提高对饮食抗原的口服耐受性。该菌群是生命早期(特别是哺乳期儿童)肠道微生物群中的主要成分之一。

发明内容

本发明提供了一种用于选择能够调节免疫应答之微生物或微生物菌株的方法。这些微生物优选属于双歧杆菌属，由于其免疫调节能力而能够用于治疗或预防免疫介导的疾病，例如乳糜泻。

此外，本发明还提供了双歧杆菌属的一种新菌株(CECT 7347；下文中称“本发明的菌株”(IATA-ES1))、其细胞组分、分泌分子、其代谢产生的化合物以及其彼此间的任意组合和/或与其他微生物或生物活性化合物的任意组合，其以配制物(preparation)的形式存在，被设计用于降低风险并提高患有乳糜泻和其他与谷蛋白摄入相关之病症(变态反应、孤独症、共济失调、糖尿病、多发性硬化等)之个体的健康和生活质量。

本发明的菌株分离自健康哺乳期婴儿的粪便并通过对16S rRNA和tuf基因进行测序而鉴定。该菌株具有免疫调节特性，能够调节由于摄入小麦和其他谷物蛋白而引起的Th1型促炎性反应和Th2型免疫应答，其中前者以乳糜泻和相关疾病(多发性硬化、糖尿病、共济失调等)为特征，后者以IgE介导之饮食性蛋白变态反应为特征。本发明菌株的特征在于能够诱导少产生Th1细胞因子IFN-γ和促炎性细胞因子IL-1，并在外周血单个核细胞(PBMC)中诱导高量产生调节性细胞因子IL-10和TGF-β。由该菌株诱导产生的细胞因子谱并不是所有双歧杆菌和人肠道乳酸菌的普遍特征，并且使它特别适于调节易感个体中由谷蛋白引起的异常免疫应答。它与其他微生物(例如B.longum ATCC15707)的组合可以促进调节性细胞因子IL-10的合成，其有利于控制以这些病变为特征的发炎过程。无活力的细菌(通过多种措施而灭活，例如加热、冻融、辐射等)保留其免疫调节特性。

本发明的菌株能够摄取并水解导致这些病症的谷蛋白肽，从而减少毒性表位的浓度及其致病潜力。本发明的菌株含有水解含脯氨酸之底物的特异性肽酶，这在谷蛋白中普遍存在。它与含有具有多种特异性之肽酶的其他双歧杆菌菌株相组合使得它们的作用互补，从而有利于毒性表位的降解。双歧杆菌与其他微生物(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NCDO712，其具有锚定细胞壁的蛋白酶)的组合也可以加强仅由双歧杆菌作用引起的水解作用。

本发明的菌株能够通过以下方式调节由谷蛋白肽引起的免疫应答：(i)诱导调节性细胞因子(IL-10)的合成；(ii)减少来自固有免疫应答和适应性免疫应答之促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1、IL-8和IL-15的产生；和(iii)抑制由核因子κB介导的促炎途径(实施例3，表3)。

本发明的菌株及其衍生化合物还能够抑制从乳糜泻患者肠道菌群中分离的致病菌，所述致病菌具有促炎性潜力和毒力因子，这有利于重建肠道平衡(实施例4，表4和表5)。这些菌株还能够抑制活动性乳糜泻患者和采取无谷蛋白饮食的人群中肠道细菌的促炎性应答，从而减少促炎性细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的合成并增加调节性细胞因子(IL-10)的合成。

本发明的菌株还具有代谢活性(例如：磷酸酶、酯酶、脂肪酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶和N-乙酰-葡糖胺酶)，这有利于营养成分的消化并改善乳糜泻患者特有的吸收不良和营养不良综合征。

本发明的菌株能够粘附于粘蛋白(1-4％)，并在胃肠应激(酸性pH以及高胆汁浓度；实施例5，表6和表7)的条件下以及食品贮存和制备的技术过程(冷藏、冻干、发酵等)中保持稳定。在体内，其口服施用后能够在人体内运输过程中保持存活。所有这些特性保证了其在肠道中持久存在和有效，并可用作益生菌和合生元(益生菌和益生元(pre-bióticos)的组合)。这些还保证了其可以功能性食品、新型食品、补充剂、营养保健品和药物的形式使用，以降低风险并提高患有乳糜泻以及其他与谷蛋白摄入相关之病症的对象的健康和生活质量。

因此，本发明的第一个方面涉及一种选择能够调节针对食物变态反应之免疫应答的微生物或微生物菌株的方法，其包括：(a)从来自健康个体(优选哺乳期婴儿)的样品中分离微生物，所述样品优选是粪便；和(b)选择上一步骤中能够调节免疫应答并使至少一种导致食物变态反应(优选乳糜泻)的物质水解、失活或干扰其作用机制的那些微生物。优选地，步骤(a)中所选择的微生物潜在地属于益生菌的属或种。在一个优选的实施方案中，步骤(a)中获得的微生物所调节的免疫应答是Th1或Th2型促炎性应答。而且，作为替代或者除其调节免疫应答的能力外，可以针对增加上皮细胞的活力和/或完整性从而提高肠道屏障功能的能力来选择步骤(a)和(b)中获得的微生物。

通过上述方法选择的微生物或者能够使至少一种导致食物变态反应(优选乳糜泻)的物质水解、失活或干扰其作用机制并调节免疫应答的微生物可用于治疗或预防食物变态反应(下文称“本发明的微生物”)。因此，本发明的第二个方面涉及这些微生物用作药物或食品组合物的用途，所述药物或食品组合物优选用于治疗或预防食物变态反应。这些微生物可以属于任何细菌属或种，优选双歧杆菌属，更优选长双歧杆菌(B.longum)种。

本发明的第三个方面涉及保藏号为CECT 7347的菌株。

本发明的第四个方面涉及一种组合物(下文称“本发明的组合物”)，其包含至少一种本发明的微生物，优选本发明的菌株，且优选其在所述组合物中的比例为0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％。该组合物还可包含能够增强本发明微生物或菌株的免疫调节能力或者能够增强其使导致食物变态反应之物质水解、失活或干扰其作用机制之能力的其他微生物或介质。

本发明的第五个方面涉及可以从来自本发明微生物的生物活性化合物中获得的组合物，例如(以示例方式且并不限制本发明的范围)本发明任何微生物的培养物上清液(下文称“本发明的上清液”)、从本发明任何微生物或任何菌株的纯或混合培养物中获得的提取物(下文称“本发明的提取物”)、细胞组分或亚细胞级分、代谢物、以及由本发明微生物或菌株分泌的产物，这可以通过本领域技术人员熟知的物理化学和/或生物技术获得。这些来源于本发明微生物的生物活性化合物(即下文所称“本发明的衍生生物活性化合物”)可用于制备食品、补充剂、营养保健品、基于益生菌或合生元的产品、新型食品或药物。同样地，其不同用途也构成了本发明的一部分。

本发明的另一个方面涉及用于制备包含本发明组合物或至少一种本发明微生物(优选本发明的菌株)的食品的载体(soporte)材料。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物包含在载体材料中，其量为至少约10⁵cfu/g载体材料，优选为10⁶cfu/g至10¹²cfu/g，更优选为10⁶cfu/g至10¹⁰cfu/g。根据前面所述，包含本发明组合物或本发明载体材料的任何食品或补充剂也构成了本发明的一部分。

本发明的另一个方面涉及药物组合物或食品组合物，其包含任何以下成分：本发明的组合物、本发明的衍生生物活性化合物、本发明的上清液、本发明的提取物、本发明的微生物、本发明的菌株，以及任选地可药用介质和/或赋形剂。所述药物组合物或食品组合物中必须含有的微生物的量根据所设计治疗的病变类型而变化。优选地，所述病变是食物变态反应，更优选是乳糜泻。根据本发明，在制备食品组合物时，向载体材料中掺入至少一种本发明的微生物或本发明的衍生生物活性化合物，其量优选为10⁵cfu/g至10¹⁴cfu/g载体材料，更优选为约10⁸cfu/g至10¹³cfu/g载体材料，更优选为10⁷cfu/g至10¹²cfu/g载体材料。对于本发明的微生物和本发明的衍生生物活性化合物，其比例为0.1％至99.9％，优选1％至99％，更优选10％至90％。这些食品组合物可用于制备被设计成用于优选治疗或预防食物变态反应(更优选乳糜泻)的营养保健品、功能性食品、益生菌、合生元、营养补充剂或任何其他类型的产品。

本发明的药物组合物或食品组合物可以优选地为片剂、胶囊、微胶囊、粉末、溶液、糊剂(paste)等的形式。

本发明的另一个方面涉及本发明的组合物、本发明的衍生生物活性化合物、本发明的上清液、本发明的提取物、本发明的药物组合物、本发明的亚细胞级分、本发明的食品组合物或本发明的载体材料，其中本发明的微生物或本发明的菌株与另一种微生物、从其培养物获得的上清液或其亚细胞级分相组合。优选地，所述微生物属于乳球菌属(Lactococcus)，优选地属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，更优选地是乳酸乳球菌NCDO712菌株。

本发明的最后一个方面涉及本发明组合物的不同表现形式，其可以配制成食品、营养保健品、药物制剂、补充剂、益生菌或合生元，或者新型食品。

定义：

哺乳期婴儿：在全部说明书中该术语优选是指健康个体，其优选小于2岁，更优选小于1岁，更优选小于6个月，其主要是哺乳喂养。

健康个体：该术语优选是指根据专业医生的标准没有任何类型的慢性或急性病变的人。优选所述病变能够引起肠道上皮发炎，更优选所述病变是乳糜泻。

食物变态反应：在全部说明书中该术语优选是指优选由奶、蛋、豆类(legumbres)、坚果、甲壳类动物、鱼、软体动物类、芝麻、葵花籽、棉籽、罂粟籽、豆类、豌豆、扁豆引起以及更优选由谷蛋白引起的食物变态反应。

Th1型促炎性应答：对刺激的响应，所述刺激可引起产生大量的Th1型细胞因子，优选细胞因子IFN-γ，其产生量优选是对照的至少100倍，更优选至少15倍，更优选至少10倍，甚至更优选至少4倍。

Th2型促炎性应答：对刺激的反应，所述刺激可引起产生大量的Th2型细胞因子，优选细胞因子IL4，其产生量优选比对照高至少100倍，更优选至少15倍，更优选至少10倍，甚至更优选至少4倍。

潜在的益生菌属或种：在全部说明书中该术语优选是指下列进化分支和原核生物类的种和菌株：古菌(Archaea)、厚壁菌(Firmicutes)、拟杆菌(bacteroidete)、变形菌(Proteobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、疣微菌(Verrucomicrobia)、梭杆菌(Fusobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、丝状杆菌(Fibrobacters)、脱铁杆菌(Deferribacteres)、异常球菌(Deinococcus)、嗜热菌(Thermus)、蓝细菌(cianobacteria)、甲烷短杆菌(methanobrevibacterium)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)、肠球菌(Enterococcus)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、粪球菌(Coprococcus)、Subdolingranulum、Dorea、Bulleidia、Anaerofustis、孪生球菌(Gemella)、罗斯伯里氏菌(Roseburia)、Catenibacterium、戴阿利斯特菌(Dialister)、Anaerotruncus、葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、肠杆菌(Enterobacteriaceas)、Faecalibacterium、拟杆菌(Bacteroides)、Parabacteroides、普氏菌(Prevotella)、优杆菌(Eubacterium)、Akkermansia、芽孢杆菌(Bacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、梭状菌(Clostridium)等。其中还包括下列真菌和酵母种和菌株：酵母菌(Saccharomyces)、念珠菌(Candida)、毕赤酵母菌(Pichia)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、球拟酵母菌(Torulopsis)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)等。

介质：该术语优选指培养基、底物、益生元、纤维、生物活性化合物、赋形剂、配料(ingredient)等，其可以改善本发明微生物的任何特性，所述特性优选用来制备本发明的药物、营养组合物、组合物、载体材料、上清液以及食物(例如稳定性、免疫调节能力、粘附能力、发酵作用、使引起变态反应的物质水解或失活等)。

载体材料：优选地，所述载体材料是食品组合物，其选自奶、酸奶、奶酪、发酵奶、基于发酵奶的食品、发酵谷物、面粉、果汁、糖、蛋糕、冰淇淋、儿童用制剂等。

药物：在全部说明书中该术语指药物组合物或制剂，其优选设计成用于治疗或预防变态反应、食物变态反应、肠的炎性疾病、胃肠感染和致病性微生物或其毒素的转移、肠道平衡的改变(生态失调)、细菌过度生长、肠道通透性的改变、食物不耐受、乳糜泻、吸收不良综合征等。

食品组合物：在全部说明书中该术语是指食品(功能性、传统型和新型)、食品添加剂、营养目的的配方以及营养保健品，其被设计用于治疗或预防变态反应、食物变态反应、肠的炎性疾病、胃肠感染和致病性微生物或其毒素的转移、肠道平衡的改变(生态失调)、细菌过度生长、肠通透性的改变、食物不耐受、乳糜泻、吸收不良综合征等。

来源于微生物的生物活性化合物：作为结构部分、细胞组分、亚细胞级分、代谢物或分泌分子而构成所述微生物一部分的任何化合物或分子，其都可通过物理化学或生物技术获得，其中包括离心、过滤、冷冻干燥、沉淀、超声、机械和化学的细胞破碎、利用酶和/或化学试剂从培养物中提取化合物、利用色谱技术进行的分离、编码生物活性分子(能够行使益于健康的功能)之基因的克隆和过表达。

附图说明

图1.不同的麦醇溶蛋白消化后蛋白谱的SDS-PAGE分析。A板：1)麦醇溶蛋白经胃蛋白酶消化后的对照(G-P)；2)麦醇溶蛋白经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的对照(G-P-T)；3)与本发明菌株一起孵育的G-P；4)与本发明菌株(双歧杆菌(Bifidobacterium)IATA-ES1)一起孵育的G-P-T。B板：1)G-P对照；2)G-P-T对照；3)与本发明菌株以及乳酸乳球菌NCDO712一起孵育的G-P；4)与本发明菌株以及乳酸乳球菌NCDO712一起孵育的G-P-T。

图2.由麦醇溶蛋白体外消化后的可透析级分得到的色谱图。2号峰是优选被本发明菌株水解的峰。

图3.在体外存在或不存在双歧杆菌的情况下，由麦醇溶蛋白(Gld)之可溶性经消化级分引起的细胞活力的改变(以内吞溶酶体活性测量)。牛血清白蛋白-BSA-(阴性对照)；BifA2(动物双歧杆菌(B.animalis))；Bb(两歧双歧杆菌(B.bifidum))和BL(本发明的菌株-长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IATA-ES1)。结果以平均值和标准偏差表示，重复测定四次。

图4.在体外存在或不存在双歧杆菌的情况下，暴露于麦醇溶蛋白(Gld)之可溶性经消化级分的Caco-2细胞培养物中促炎性细胞因子(TNF-α)的产生和核因子κB(NF-κB)的表达。牛血清白蛋白-BSA-(阴性对照)；BifA2(动物双歧杆菌)；Bb(两歧双歧杆菌)和BL(本发明的菌株-长双歧杆菌IATA-ES1)。结果以平均值和标准偏差表示，重复测定四次。

发明详述

本发明涉及一种选择能够调节食物变态反应之免疫应答的微生物或微生物菌株的方法，其包括：(a)从来自健康个体(优选哺乳期婴儿)的样品中分离微生物；和(b)选择上一步骤中能够调节免疫应答并使至少一种导致食物变态反应(优选乳糜泻)的物质水解、失活或干扰其作用机制的那些微生物。优选地，步骤(a)中所选择的微生物可能属于益生菌属或种。

本发明的另一个方面涉及能够使至少一种导致食物变态反应的物质水解、失活或干扰其作用机制并能够调节免疫应答的微生物。这些微生物可以优选地用于治疗或预防食物变态反应、肠的炎性疾病、肠道生态系统不平衡(生态失调)、细菌过度生长、吸收不良综合征、胃肠感染和致病微生物或其毒素的转移，以及肠通透性的改变。

本发明还提供了可用于生产通过多种作用机制来降低风险和提高个体健康状况之制剂的微生物，所述个体患有或易患有与谷蛋白摄入相关的病症，所述微生物的特征在于其是未经基因修饰的微生物，由于其抗炎和调节特性而从健康个体的肠道微生物群中分离并选择得到。

所述多种作用机制包括例如以下的机制(但不限制本发明的范围)：(i)调节由谷蛋白的毒性免疫原性肽所引起的固有免疫应答和适应性免疫应答；(ii)通过运输和水解谷蛋白肽而减少毒性表位在肠腔中的浓度；(iii)增强对细菌或其他促炎剂以及毒力因子(从乳糜泻患者的胃肠道分离得到)的防御屏障功能；和(iv)提供除肽酶外的酶活性，所述酶活性有利于营养物质的消化和供给，以缓解这些患者典型的吸收不良综合征。除所提及的之外，该微生物还可以产生有益的效果，例如(但不限制本发明的范围)减少与炎症有关的氧化应激、调节肠通透性、促进有保护性功能的有益革兰氏阳性菌的定殖、调节抗原呈递细胞的功能、抑制毒性肽与宿主免疫活性上皮细胞之间的相互作用、与金属蛋白酶相互作用、调节细胞周期和细胞凋亡、调节细胞生长和分化以及调节神经内分泌功能(De Stefano等，2007.Lycopene，quercetin and tyrosolprevent macrophage activation induced by gliadin and IFN-γ.Eur JPharmacol.2；566(1-3)：192-9；Silano等，2007.A decapeptide fromdurum wheat prevents celiac peripheral blood lymphocytes fromactivation by gliadin peptides.Pediatr Res.61(1)：67-71；Gross等，2007.Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease.Inflamm BowelDis.3(7)：918-32)。

本发明的微生物优选属于双歧杆菌属。该属的微生物在配制用于治疗或预防乳糜泻和相关病症的食品、新型食品、益生菌、合生元、补充剂、营养保健品和药物制剂中具有优势。双歧杆菌具有在新生儿肠道中定殖的特殊能力，这显著地促进其防御体系的建立。

在一个特定的实施方案中，本发明的微生物优选属于长双歧杆菌种。例如(但不限制本发明的范围)属于该种的本发明菌株分离自健康哺乳期婴儿的粪便并通过对16S rRNA基因(实施例6)和tuf基因进行测序而鉴定。经测序的片段(1437个碱基)利用引物27f和1401r进行PCR扩增，并按照其他作者描述的方法利用引物530f和U-968f进行测序(Satokari等，2001.Appl.Environ.Microbiol.67，504-513；Favier等，2002.Appl.Environ.Microbiol.68，219-226)。通过将所得序列与存在于数据库(GenBank)中的序列进行比对，检测到了与对应于长双歧杆菌种14个不同菌株之序列的最大相似性，其中包括长双歧杆菌BG3(登录号AY735403.1)。利用Ventura等人(Analysis，characterization，and loci of the tuf genes in Lactobacillus and Bifidobacterium speciesand their direct application for species identification.Appl EnvironMicrobiol.2003；69(11)：6908-22)描述的引物扩增并测序了tuf基因的一部分(498bp)。在这种情况下，按照相同的方法还检测到了与长双歧杆菌种(具体地是对应于长双歧杆菌株ATCC 15707(登录号AY372042.1)的序列)的最大相似性。

这表明，长双歧杆菌株以与该属或该种中适当筛选出的其他菌株相似的方式表现出调节本发明免疫系统的理想特性，为患有与谷蛋白摄入相关之病症的个体提供了相同的有益效果。

本发明的另一个方面涉及属于长双歧杆菌种的菌株，其已于2007年12月20日保藏于总部设于布尔哈索特(Burjassot)(瓦伦西亚)的西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónde CultivosTipo-CECT)，保藏号为CECT 7347。根据16S rRNA基因序列与数据库(GenBank)中现有的其他序列的同源性(如实施例6中所描述)，以及tuf基因与该种其他菌株的同源性，该菌株属于长双歧杆菌种。后者构成了双歧杆菌属菌株的一个实例，其具有允许其用于制备药物制剂或药物、(新型或功能性)食品或者营养成分或者食品补充剂的特性。

本发明的微生物(优选本发明的菌株)可与其他微生物和生物活性化合物相组合，以通过协同作用或互补作用而改善其保护特性和代谢特性，例如增加调节性细胞因子的全合成及其类型、增加对致病菌的抑制能力以及肠道屏障功能、通过增加肽酶和其他酶的整体浓度或增加其类型和特异性而提高其对消化的贡献。

因此，本发明的另一个方面包括双歧杆菌与其他微生物或生物活性化合物以互补和/或协同方式相组合，其有利于免疫调节应答以及谷蛋白之毒性免疫原性肽的降解。作为微生物的实例，长双歧杆菌株ATCC15707由于其高度诱导IL-10合成的能力而可增强本发明菌株的免疫调节作用(如表1中所显示，实施例1)；该作用还可以补充诱导仅由第二菌株产生的TGF-β(表1，实施例1)。同时，乳酸乳球菌株NCD0712由于其是双歧杆菌因而可以补充并加强谷蛋白肽的降解，并因此由于其特性而降低谷蛋白毒性表位的浓度及其对肠道和肠道外的伤害，此外还可以加强胞内肽酶和胞外蛋白水解活性。实施例2和图1中显示了蛋白水解活性的加强，其中可以观察到，在将麦醇溶蛋白经消化样品与本发明菌株的细胞悬液和乳酸乳球菌NCD0712一起孵育后，几乎所有的蛋白条带都消失了(图1，B板，泳道3和4)。该水解作用强于仅使用本发明菌株所获得的水解作用(图1，A板，泳道3和4)。

本发明的另一个方面涉及本发明微生物(优选本发明的菌株)及其通过用于免疫调节目的的不同方法(冷冻、加热、辐射等)灭活的其无活力等价物形式的用途。

通过不同方法(冷冻、加热、辐射等)灭活的本发明的无活力微生物可继续用于治疗或预防目的，其也构成本发明的一部分。双歧杆菌的免疫调节作用至少部分地由结构成分(DNA，细胞壁组分等)产生。这使得双歧杆菌可以保留其部分免疫调节特性而无需保持活力(Lammers等，2003.Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA：IL-1and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells.FEMS Immunol Med Microbiol.38：165-72)。因此，实施例3和表3显示，经冷冻-融解循环而灭活的本发明菌株的细胞悬液与外周血单个核细胞孵育时可以调节由麦醇溶蛋白引起的促炎性应答，从而减少促炎性细胞因子(例如IFN-γ)的合成并增加调节性细胞因子(例如IL-10)的合成。

此外，利用公知技术获得的本发明微生物的衍生生物活性化合物(例如结构性化合物、代谢产物)以及本发明的任何微生物或菌株分泌分子，也构成本发明的一部分，并且其也可用于调节免疫应答。例如，物理-化学技术和生物技术其中包括离心、过滤、冷冻干燥、沉淀、超声、机械及化学细胞破碎、利用酶和/或化学试剂从培养物中提取化合物、利用色谱技术进行的分离、编码所述化合物之基因的克隆和及其过表达。

实施例1和表1显示，形成双歧杆菌细胞被膜(cell envelope)一部分的结构组分至少部分负责诱导和产生调节性细胞因子(IL-10和TGF-β)。在实施例3和表3中，将麦醇溶蛋白经消化后样品与本发明菌株的无活力细胞悬液共孵育，也显示这些细胞的结构组分能够减少由麦醇溶蛋白引起的促炎性应答并增加调节性细胞因子(IL-10)的合成。同样地，如实施例4和表4中所证实的，结构组分、代谢物以及由本发明菌株所分泌的物质对从乳糜泻患者中分离出的潜在致病菌的生长具有抑制作用。在所述实施例中，利用双层技术评估了该菌株之细胞培养物的抑制作用，其中使细胞以及代谢物和分泌物与致病微生物接触，使所有这些组分协同发挥抑制作用。还利用事先冻干的无细胞培养物之上清液作为抑制试剂评估了代谢物以及由双歧杆菌分泌至培养基中之化合物的抑制作用。因此，已表明释放至培养基中的化合物对从乳糜泻患者中分离的潜在病原体具有抑制作用(表5)。

在本发明的一个特定实施方案中，本发明的微生物、本发明的组合物、本发明的衍生生物活性化合物、本发明的上清液、本发明的提取物、本发明的药物组合物或营养组合物、本发明的菌株、其细胞组分或亚细胞级分、其代谢产生的化合物、分泌分子及其组合具有能够调节由谷蛋白或其他食物变态反应中有害肽所引起的固有免疫应答和适应性免疫应答的特性。

本发明的菌株由于其免疫调节特性而被筛选得到，其能够调节由于摄入小麦和其他谷物蛋白而引起的Th1型促炎性应答和Th2型变态反应，其中前者特征在于乳糜泻和相关疾病(唐氏综合征、1型糖尿病、疱疹样皮炎、肌病、多发性硬化、关节炎、孤独症、精神分裂症、抑郁症、淋巴瘤和共济失调)。该菌株的特征在于其能够在外周血单个核细胞(PBMC)中诱导产生少量的Th1细胞因子IFN-γ(例如＜100pm/ml)和促炎性细胞因子IL-1(例如＜150pm/ml)，以及诱导产生大量的调节性细胞因子IL-10(例如＞800pm/ml)和TGF-β(例如＞50pmol/m)(实施例1，表1)。由这些双歧杆菌诱导产生的细胞因子谱并不是所有双歧杆菌和人肠道乳酸菌的普遍特征(实施例1，表1)，并且使其特别理想地适于易感个体和活动性乳糜泻患者中由小麦蛋白所引起的异常免疫应答。

当在这些试验中利用所选择菌株的细胞悬液作为刺激物时(实施例1和表1)，对这些免疫调节作用的检测表明，形成双歧杆菌细胞被膜一部分的结构组分至少部分地负责诱导产生可减少谷蛋白肽毒性作用和免疫原性作用的调节性细胞因子(IL-10和TGF-β)。此外，在实施例3和表3中表明，将本发明菌株的无活力细胞悬液(通过冷冻-融解循环而灭活)与麦醇溶蛋白经消化样品共孵育，也能够减少由麦醇溶蛋白引起的促炎性细胞因子(例如IFN-γ和IL-15)的合成和增加调节性细胞因子(例如INF、IL-10)的合成。因此，已证实双歧杆菌细胞的结构组分可调节由谷蛋白引起的异常免疫应答，而无需其严格保持细菌活力。

本发明的微生物以及本发明的菌株、本发明的衍生生物活性化合物、其细胞组分、其代谢产生的化合物、分泌分子及其组合的特征在于能够加强对有害细菌的防御屏障功能，所述有害细菌例如是从乳糜泻患者的胃肠道中分离的促炎性细菌和含有毒力因子的细菌。

本发明微生物能够抑制从乳糜泻患者肠中分离的、具有致病性和潜在毒性的细菌(实施例4，表4和表5)。这些病原体中包括大肠杆菌(Escherichia coli)中编码致病性因子(例如菌毛)并属于毒性种系群(例如B2)的菌株、拟杆菌属(Bacteroides)及其他属中产生导致组织损伤的金属蛋白酶的菌株以及从十二指肠活检中分离的溶血菌株。在实施例4和表4中，利用双层技术证实该菌株的总细胞培养物对从乳糜泻患者中分离的病原体有抑制作用，其方式使得这些作用可由结构组分、代谢物以及本发明菌株所分泌的物质所产生。表5还显示了该菌株培养物之无细胞上清液的抑制作用，所述上清液中仅含双歧杆菌分泌至培养基中的代谢物和化合物。在这两种情况下，利用所选择的菌株获得的抑制作用高于利用其他菌株(为比较目的而测定)获得的抑制作用。因此，本发明的微生物或菌株可有助于重建肠生态系统，并减少促进发炎过程和增加上皮通透性的微生物来源之抗原负荷(antigenic load)。同样地，所选的菌株能够抑制外周血单个核细胞中由乳糜泻患者肠道微生物群刺激产生的促炎性细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)的合成。例如，在用乳糜泻患者微生物群的刺激下，由PBMC产生的90.8pmol/ml的IFN-γ浓度和1966.3pmol/ml的TNF-α浓度可在本发明菌株的存在下分别降至8.2pmol/ml和295.2pmol/ml(实施例7)。该菌株还能够刺激被乳糜泻患者肠道微生物群所减少的调节性细胞因子(IL-10)的合成。因此，例如乳糜泻患者肠道微生物群诱导产生的49.3pmol/ml的IL-10可在双歧杆菌株IATA-H1的刺激下增加高达107.5pmol/ml的值。通过此免疫调节机制，所选的菌株可有助于重建肠道平衡，并避免由有害微生物群引起的对免疫系统的过度刺激(over-stimulation)，所述过度刺激与由谷蛋白引起的过度刺激一起可产生持续发炎的恶性循环。

此外，本发明微生物的特征在于能够运输胃肠消化得到的谷蛋白肽，从而减少有害表位的浓度。

特别地，本发明的菌株能够摄取毒性肽，所述毒性肽来源于麦醇溶蛋白经胃肠的消化、在胃蛋白酶(P)作用下的胃消化产物以及在胰蛋白酶(T)和胰酶(X)作用下的肠消化产物(实施例2，图1)。利用R5抗体进行夹心ELISA试验，已经确定麦醇溶蛋白与所选菌株的有活力细菌共孵育可以减少其浓度和毒性表位的存在量，并进而减少其在肠和在肠外水平上的可能有害作用。例如，通过夹心ELISA测定出麦醇溶蛋白样品经胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶消化后(如实施例2中所描述)毒性表位的浓度为2349ppm谷蛋白，而与本发明菌株的细胞悬液孵育后降至169ppm谷蛋白。同样地，将本发明菌株与经胃肠条件下消化的麦醇溶蛋白孵育并利用排阻大小低于15kDa的膜透析，随后对其进行反相HPLC分析，证明了该双歧杆菌能够使#2级分(经消化麦醇溶蛋白的主要级分，且经质谱鉴定其中含有免疫原性肽)的浓度减少至少10％，而其余被测菌株则未显示该特性(实施例8，图2)。如实施例8中所描述，已证实在将麦醇溶蛋白经消化的不同样品在Caco-2细胞培养物中孵育后长双歧杆菌IATA-ES1菌株的该特性对肠上皮的生物学作用。该实施例证实，与所测其余菌株不同，本发明菌株可因而提高上皮细胞的活力(实施例8，图3)。此外，本发明菌株与麦醇溶蛋白经消化样品共孵育减少了后者对促炎性细胞因子(例如TNF-α)合成以及负责促炎性基因之表达之NκB因子的表达的作用(实施例8，图4)。

在肠条件下以及在胆汁盐存在时，本发明微生物(优选本发明菌株)捕获来源于麦醇溶蛋白消化之寡肽的能力可再现。这种能力通过与乳酸乳球菌NCDO712共孵育而加强，NCDO712虽然不能定殖于大肠，但通过其细胞壁锚定的蛋白酶和其他肽酶的作用，可以在对摄入的谷蛋白进行水解的前期中起辅助作用(实施例2，图1)。图1中证实了在乳酸乳球菌NCD0712作用下蛋白水解活性的增强，其中可以观察到将麦醇溶蛋白经消化样品与本发明菌株的细胞悬液和乳酸乳球菌NCD0712孵育后，几乎所有的蛋白条带都消失了(图1，B板，泳道3和4)。该水解作用强于仅使用本发明菌株所获得的水解作用(图1，A板，泳道3和4)。该双歧杆菌与乳酸乳球菌NCD0712的蛋白酶和肽酶(以提取物的形式)共孵育后，其对谷蛋白的活性也可增强。

本发明的菌株不仅可以通过使作为有害抗原的肽代谢，还可以通过免疫调节机制来调节由谷蛋白毒性肽与个体免疫活性细胞相互作用而引起的异常免疫应答(实施例3，表3)。在胃肠麦醇溶蛋白经消化样品存在时，将所选菌株的有活力的或灭活的细菌悬液与PBMC共孵育能够通过胃蛋白酶(P)、肠胰蛋白酶(T)和胰酶(X)的作用抵消这些蛋白在不同消化时期中的促炎性作用。该菌株能够诱导引起适应性免疫应答和固有免疫应答之促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1、IL-8和IL-15的产生的减少，并能够增加调节性细胞因子IL-10的合成(实施例3，表3)。通过ELISA测定(Trans AM NFκB，Active Motive，Belgium)确定，这些作用至少部分地由对核因子(NF)κB不同亚基(p50、p65(RelA)、c-Rel、RelB)的抑制作用引起。抑制该转录因子导致抑制大量促炎性基因的表达，而这些基因的表达代表了发炎过程(特别是乳糜泻中的发炎过程)中的关键控制点(Jelínková等，2004.Gliadin stimulates humanmonocytes to production of IL-8 and TNF-alpha through a mechanisminvolving NF-κB.FEBS Lett.571(1-3)：81-5)。

本发明的微生物、本发明的衍生生物活性化合物、其细胞组分及其代谢产生的化合物、分泌分子及其组合的特征在于能够通过其肽酶活性水解谷蛋白肽，从而降低有害表位的浓度。例如，本发明的菌株含有具有多种特异性以及对含有脯氨酸之底物特异性的肽酶，所述底物在谷蛋白中大量存在并限制常规酶对其的水解作用(实施例2，表2)。特别地，该菌株是具有最高亚氨基肽酶活性(＞300U/mg蛋白)的菌株之一；同样地，其表现出脯氨酰内肽酶活性(＞8U/mg蛋白)、X-脯氨酰二肽基肽酶活性(＞15U/mg蛋白)、脯氨酸二肽酶(prolidase)以及脯氨酸肽酶(prolinase)活性(＞15U/mg蛋白)。其还具有三肽酶活性(对于底物Gleu-Gly-Gly，＞130U/mg蛋白)以及亮氨酰-氨基肽酶活性(＞70U/mg蛋白)。该菌株对含有脯氨酸之底物(例如Pro-pNA)的活性高于其他乳酸菌中检测到的活性，特别是Pro-pNA/Leu-pNA活性比(Di Cagno等，2004.Sourdough bread made from wheat and nontoxic flour andstarted with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients.Appl Environ Microbiol.70：1088-96；De Angelis等，2006.VSL#3probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptidesresponsible for celiac sprue.Biochim Biophys Acta.2006 1762(1)：80-93)，这有利于富含脯氨酸之谷蛋白肽的特异性水解。

因此，本发明的菌株、本发明的衍生生物活性化合物、细胞组分及其代谢产生的化合物、分泌分子及其组合具有除肽酶之外的代谢活性(例如：磷酸酶、酯酶、脂肪酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶和N-乙酰-葡糖胺酶)，这有利于消化食物中摄取的营养物质并改善乳糜泻患者特有的吸收不良和营养不良综合征。

最后，另一个特定的实施方案是本发明的微生物、本发明的衍生生物活性化合物、细胞组分、其代谢产生的化合物、分泌分子及其组合与其他微生物联合用于生产配制物的用途，所述配制物用于降低风险并提高与谷蛋白摄入相关之疾病患者或其他食物变态反应患者的健康状况。

利用本发明菌株制备的配制物可在产业上开发，为消费者提供(包括但不限制本发明的范围)不同形式的配制物：食品(功能性食品、传统食品和新型食品)、补充剂、营养保健品(nutracéuticos)、药物组合物、益生菌和/或合生元，或新型食品。

本发明的菌株能够粘附粘蛋白(1-4％)，并抵抗胃酸pH(2.0、2.5和3.0)和小肠中存在的高浓度胆汁盐(0.5、1.0、2.0和3.0％)，上述二者构成了益生菌穿过肠道时以及食物发酵过程中和食物储存期间限制益生菌存活的主要生物学屏障(实施例5，表6)。例如，该菌株在pH值2.0-2.5下孵育90分钟后仍保持56-86％的活力和生长能力。因此，该菌株比所分离的其他菌株更可能存活并发挥功能，从表6中可以看到一些目前已商业化的益生菌。该菌株还可以抵抗体内胃肠转运。以发酵奶的形式每日两次以10⁷-10⁸cfu/ml的剂量施用4周后，其可在粪便中发现，且与最初浓度(不摄入益生菌产品)相比其浓度增加至少1个对数单位。所选择的双歧杆菌可以在构成用于其摄入的理想载体材料的多种食品及饮品中生长并保持活力。例如，它们能够使牛奶发酵并凝固，其可用于制备发酵奶和其他奶衍生品。它们还能够抵抗为生产和保存食品、补充剂以及药物制剂所进行的技术处理，例如冷冻干燥和冷藏的温度，以确保其产业开发。

本发明的一个特定方面包括本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的衍生生物活性化合物用于制备食品形式的配制物的用途。

这样，本发明的微生物可以构成所配制食品的一部分，除了其通常的营养价值以外，还提供降低风险和提高与谷蛋白摄入相关疾病之患者健康状况的有益作用。

本发明的另一个特定方面包括本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的衍生生物活性化合物用于生产营养保健品形式的配制物的用途，所述营养保健品定义为存在于非食品基质中的天然生物活性物质，其对与谷蛋白摄入相关疾病的患者产生有益作用，降低其风险并改善其健康状况。

在利用本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的衍生生物活性化合物来制备饮食或食品补充剂时，其组成中可以包括该微生物或其衍生生物活性化合物，从而以健康为目的对膳食进行补充，且在特定情况下，用于对与谷蛋白摄入相关疾病之患者产生有益作用，降低其风险并改善其健康状况的目的。

本发明的另一个特定方面包括本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的生物活性化合物用于生产药物制剂的用途。这时，其可以用于制备生物活性组合物，该组合物能够用作药物，产生降低风险和改善与谷蛋白摄入相关疾病之患者健康状况的有益作用。

在本发明的另一个特定实施方案中，本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的生物活性化合物可以用于生产益生菌和/或合生元(益生菌和益生元(prebiótic)的组合)，其中以合适的量和条件掺入适量的微生物(例如活的或冻干的)，所述条件使所述微生物能够对优选与谷蛋白摄入相关食物变态反应之患者发挥有益或治疗作用，从而降低其风险并改善其健康状况。

本发明的最后一个特定目的包括本发明的微生物、本发明的菌株或本发明的生物活性化合物用于制备新型食品的用途。所述新型食品是指自1997年5月15日起在欧洲联盟未被人们一般消费的任何食品或成分，其对与谷蛋白摄入相关疾病之患者产生有益作用，降低其风险并改善其健康状况。

具体实施方式

实施例1.选择能够调节外周血单个核细胞(PBMC)中细胞因子产生的双歧杆菌属菌株的步骤

1.制备双歧杆菌和其他肠道乳酸菌的培养物和上清液

将菌株接种于含有0.05％半胱氨酸(MRS-C)的10ml MRS生长培养基(Scharlau Chemie S.A.，Barcelona，Spain)(1％)中，培养24小时，并在厌氧条件下于37℃孵育22小时(AnaeroGen；Oxiod，Basingstoke，UK)。通过离心(6,000g，15分钟)收集细胞，用PBS(10mM磷酸钠，130mM氯化钠，pH 7.4)清洗2次并重悬于含有20％甘油的PBS中。将这些悬液的等份试样以液氮冻存于-80℃。通过在MRSC板上于孵育48小时后计数来测定在冷冻-解冻循环后的有活力细胞的数目。在所有情形下活力均高于90％。每份等份试样用于一次试验。为了评价死细菌的作用，将一些等份试样冷冻灭活(-20℃进行3次冷冻循环并解冻)和热灭活(80℃，30分钟)。用NaOH调节所获得上清液的pH值至7.2，并通过过滤(0.22μm孔径，Millipore，Bedford，MA)进行酯化，以除去可能存在的有活力细胞。将无细胞之上清液的等份试样储存于于-80℃备用。

2.分离并刺激PBMC

从4名健康志愿者(平均年龄30岁，24-40岁之间)的外周血中分离PBMC至加有肝素的管中。通过Ficoll梯度离心(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)分离出PBMC。用RPMI 1640培养基(Cambrex，New York，USA)清洗细胞，并调整密度至每ml RPMI 1640培养基(另外含有10％胎牛血清(Gibco，Barcelona，Spain)，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(Sigma))中含1×10⁶个细胞。在有或者没有刺激剂的情况下，将PBMC在平底24孔聚苯乙烯板(Corning，Madrid，Spain)中在37℃下于5％CO₂条件下孵育24小时。将1×10⁶CFU/ml的活细菌或死细菌悬液用作刺激物，其上清液体积为150μl。将浓度为1μg/ml的大肠杆菌O111:B4的经纯化脂多糖(LPS)(Sigma，St.Louis，MO)用作阳性对照。作为阴性对照，测定了未经刺激的PBMC中细胞因子的产生。每次实验中对每种类型的刺激物测试两次。离心收集培养物的上清液，分级并以等份试样储存于-20℃直到细胞因子的检测。

细胞因子测定

按照厂商的说明书，利用ELISA Bioscience试剂盒(BD Biosciences，San Diego，CA)测量了上清液中细胞因子(IL-1、IFN-γ、IL-10和TGF-β)的浓度。

表1.双歧杆菌和其他肠道乳酸菌的免疫调节特性。有活力细菌的PBMC对细胞因子产生的影响。

ND，未检测

-，未评价

¹本发明的菌株(IATA-ES1)，²双歧杆菌IATA-A2，³长双歧杆菌ATCC15707，⁴双歧杆菌BIR-324，⁵长双歧杆菌W11，⁶长双歧杆菌BB536，⁷罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1V。

实施例2.选择能够水解和运输谷蛋白肽并进而减少其毒性的双歧杆菌的步骤

通过对广谱和特异性胞内肽酶水解肽中引起谷蛋白免疫原性和毒性应答之含脯氨酸肽序列的活性进行定量来测量菌株水解谷蛋白来源之蛋白和肽的能力。通过离心(于4℃，9000g，10分钟)收集在MRSC中生长16-18小时的细菌培养物的细胞，用50mM pH为7的Tris缓冲液清洗2次并重悬于与最初培养物体积相比浓缩10倍的同种缓冲液中。用Bead-Beater(Biospec Products，USA)机械破碎细胞，其中每体积细胞加入2倍体积的玻璃珠且实施2次脉冲，每次1.5分钟。离心(8000g，10分钟)以去除不溶性片段和细胞，所得到的上清液用作进行活性测定的酶提取物。所测试的底物如下：Leu-对硝基苯胺(-pNA)，用于检测具有广泛特异性的氨基肽酶；Leu-Leu-Gly，用于检测具有广泛特异性的氨基肽酶和三肽酶；Suc-Ala-Pro-pNA，用于检测脯氨酰内肽酶；Pro-AMC，用于检测亚氨基肽酶；Gly-Pro-AMC，用于检测X-脯氨酰-二肽基-肽酶；Val-Pro，用于检测脯氨酸二肽酶；和Pro-Gly，用于检测脯氨酸肽酶。在底物来源于对硝基苯胺的情况下，反应混合物由200μl含有0.5mM底物的50mM磷酸缓冲液(pH 7.2)和50μl酶提取物组成。将反应混合物于37℃最多孵育30分钟。用分光光度计(550 Microplate Reader，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)于419nm处监测底物的水解和对硝基苯胺的释放。肽水解通过L-氨基酸氧化酶测定来检测(Hejgaard，1978，Rapad assay todetect peptidases in colum effluent fractions using L-amino acid oxidase.Analytical Biochem 90：835-839)。将浓度为0.05mM的100μl反应缓冲液与50μl酶提取物孵育20分钟。随后加入100μl L-氨基酸氧化酶试剂，孵育5分钟后测量530nm的吸光度。利用BioRad市售试剂盒(Hercules，CA，USA)以布拉德福德(Bradford)法测定蛋白质浓度。1个活性单位定义为能够于37℃在1分钟内水解1μmol底物的酶量。活性表示为U/mg蛋白质。

通过电泳测定菌株运输和水解来源于所消化的麦醇溶蛋白的肽的能力。在这种情况下，调整细胞悬液至655nm时的光密度为4，相当于10⁹cfu/ml，并与3种不同的麦醇溶蛋白水解物一起孵育，所述水解物在加入了0.2％葡萄糖的PBS中的终浓度为300-600μg/ml。通过以下方法刺激胃肠消化过程而获得麦醇溶蛋白水解物(Sigma，St.Louis，MO)：A).将100g麦醇溶蛋白在含有2g经纯化胃蛋白酶的1升0.2N HCL(pH：1.8)中于37℃消化2小时(该水解物称为G-P)。B).将所得到的消化产物用2NNaOH将pH值调节至8，然后通过加入2g胰蛋白酶进行消化(该水解物称为G-P+T)。C).随后用2g胰酶处理经双重消化的样品，并在pH8的条件下搅拌2小时(该水解物称为G-P+T+X)。每个消化步骤后均于10.000g离心10分钟，上清液储存于-20℃，以用于进一步测试。将经消化的样品通过在100℃孵育30分钟进行灭活。将细菌悬液在3种麦醇溶蛋白水解物(A、B和C)存在下在厌氧条件下于37℃孵育6小时。按照生厂商的说明，利用市售系统LIVE/DEAD BacLight试剂盒(Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)进行显微检查，以测定孵育过程中活力的变化。在Olympus BX 51落射荧光显微镜(Tokyo，Japan)下进行活细菌(绿色)和死细菌(红色)计数。在所有情况下，在孵育后检测活力的最小损失(0.0-11.5％)。在孵育后进行离心，以去除不溶性细胞和蛋白质，上清液通过过滤(0.22μm孔径，Millipore，Bedford，MA)进行酯化(esterizaron)，以去除可能存在的有活力细胞。通过评价用于肽分离的常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％)和Tris-Tricine凝胶电泳(预制凝胶(ready gel)，10-20％线性梯度，4％浓缩胶(stacking gel)，Bio-Rad，Barcelona，Spain)中条带消失的情况，测定了菌株运输和利用不同麦醇溶水解物的能力。通过考马斯亮蓝R-250染色使蛋白质可见。利用ELISA夹心R5测定(CentroNacional de Biotecnología，Madrid)评价了在所选择细菌的作用下，由麦醇溶蛋白的运输和消化产生的毒性表位的减少。

表2.双歧杆菌和肠道来源的乳杆菌菌株对合成底物的肽酶活性

＊平均值±SD.

-，未评价

¹本发明的菌株(IATA-ES1)，²双歧杆菌IATA-A2，³长双歧杆菌ATCC15707，⁴罗伊氏乳杆菌LM1V

实施例3.免疫活性细胞与所选择的具有免疫调节特性之双歧杆菌属菌株共孵育对由麦醇溶蛋白引起的免疫应答的调节作用

将所选择的菌株的悬液(10⁶-10⁹CFU/ml)以及其他用于比较目的的菌株悬液与如实施例3描述得到的不同麦醇溶蛋白水解物(P、P+T和P+T+P)以及浓度为10⁶cfc/ml的PBMC共孵育24小时。在不加入细菌和大肠杆菌O111:B4之LPS的情况下，将不同麦醇溶蛋白水解物用作对照刺激物。还检测了不加入任何刺激物时细胞因子的基线产生情况。PBMC的分离、对细胞因子的刺激和检测如实施例1中描述。

表3.在胃肠条件下和双歧杆菌以及来源于肠的其它乳酸菌存在下麦醇溶蛋白消化产物刺激PBMC产生细胞因子。

ND，未检测

¹本发明的菌株(IATA-ES1)

²双歧杆菌IATA-A2

³罗伊氏乳杆菌LM1V

实施例4.所选择的双歧杆菌抑制具有致病潜力的乳糜泻患者之肠道微生物群分离物生长的能力

利用以下两种方法测定之前按照实施例1所述步骤根据免疫调节特性选择的双歧杆菌属菌株的抗微生物活性：(i)双层技术；和(ii)琼脂扩散技术。

利用双层技术，以从乳糜泻患者肠道微生物群中分离的具有致病潜力的细菌作为指示物微生物，全面评价了每种菌株的抗菌活性。双歧杆菌以约2cm的间隔成直线生长于MRS-C板上，在优化条件下孵育16小时，并用氯仿抑制其继续生长。将指示物微生物按10⁴-10⁵CFU/ml的浓度接种于10ml合适的半固体琼脂上，随后倾倒至保护性微生物的琼脂层上，并在厌养条件下于37℃下孵育。24小时后测量双歧杆菌培养线周围的抑制环。

使用琼脂扩散技术来评价由于具有蛋白质性质(protein-nature)之化合物的分泌而引起的抗菌活性。将每种双歧杆菌的24小时培养物以1％接种于10ml MRS-C生长培养基上，并于37℃孵育16小时。通过离心(12.000g，15分钟，4℃)获得上清液，并通过冷冻干燥浓缩。将冻干样品重悬于1ml 50mM磷酸缓冲液(pH值6.5)中，用NaOH中和至pH值为6.5，以消除发酵所产生的有机酸的影响，并过滤除菌。这些样品中包含粗提取物，其中测定了由双歧杆菌产生的抗菌蛋白质的可能活性。将浓度为10⁴-10⁵个细胞/ml的指示物微生物接种于10ml合适的半固体琼脂上，随后倾倒至相同培养基的琼脂固体层上。凝固后打出5mm的孔，向其中加入40μL每种双歧杆菌的无细胞且经中和的提取物。使其在4℃扩散4小时，随后在指示物微生物或致病微生物的最适条件下孵育。孵育后测量孔周围的抑制环。

表4.双歧杆菌培养物对从乳糜泻患者中分离的潜在致病菌的抑制作用

表5.双歧杆菌培养物的上清液对从乳糜泻患者中分离出的潜在致病菌的抑制作用

实施例5.评价双歧杆菌对胃肠应激条件的抵抗作用

对于每种回收的菌株，测定所分离的双歧杆菌对胃液酸性条件(其构成摄入益生菌后限制其活力的第一道生物学屏障)的抵抗作用。为此，在含有3g/L胃蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中制备每种菌株的细胞悬液(10⁸个细胞/ml)，用HCl将pH值调节至2，并于37℃孵育总共120分钟。在不同的时间点(0、90和120分钟)(包括胃排空的平均时间(90分钟))取等份试样通过在琼脂MRS-C板上计数来测定活力。随后，研究了抗酸性pH菌株对其他应激条件(例如胆汁、NaCl和高温)的耐受力。为了解所研究菌株对胆汁的耐受力，评价了其在加入不同浓度(0.5-1.5％)Ox-gall(Sigma，Sl Louis，MO)的MRS-C中的生长能力。向每种培养基的200μL等份试样中以1％接种24小时的培养物，置于多孔板中并于37℃孵育。利用550 Microplate Reader分光光度计(BioRad，Hercules，CA)测定655nm的吸光度，以监测其生长。

表6.胃条件对双歧杆菌菌株的生长能力和活力的影响

＊活力：表示为利用LIVE/DEAD BacLight试剂盒系统(Molecular Probes)在pH为7.2的PBS的细胞悬液中检测的活力百分数(认为是100％)。

生长能力：以Log cfu/ml表示，其通过在MRSC琼脂板上计数而测定，并表示为PBS中细胞悬液重新计数的百分数(认为是100％)。

＊’结果的平均标准偏差：通过3次独立试验获得

nd，未测定

-，未检测到

表7.双歧杆菌属菌株对所存在胆汁盐的耐受性

＊数据以生长速度(h^-1)的百分数表示，其中认为无胆汁时的生长速度为100％。结果的平均标准偏差通过3次独立的实验获得。

实施例6.所选择的双歧杆菌的分离和鉴定

从健康哺乳期婴儿的粪便中分离出双歧杆菌属菌株，所述婴儿在分析前至少1个月没有摄入过含有双歧杆菌的食物，且没有接受过任何抗生素治疗。将样品保存于4℃，并在采集后2小时内对其进行分析。每种样品取2g，以含有130mM浓度NaCl的10mM磷酸缓冲液(PBS)进行稀释，并用Lab-Blender 400匀浆器(Seward Medical，London，UK)均浆3分钟，随后以蛋白胨水稀释。将不同的十倍制稀释的0.1ml等份试样接种于含有0.05％半胱氨酸(Sigma，St.Louis，MO；MRS-C)和80μg/ml莫匹罗星(mupirocin)的MRS琼脂(Man Rogosa and Sharpe；Scharlau，Barcelona)上。在厌氧条件下(AmaeroGen，Oxoid，UK)于37℃孵育48小时后，选择独立的菌落并通过研究其经革兰氏染色的形态学来确定其身份。利用属特异性PCR证实独立菌落的身份，其中根据Kaufman等人描述的方法(1997，identification and quantification of Bifibobacteriumspecies isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targed probes bycolony hybridization and PCR.Appl.Environ.Microbiol.63：1268-1273)，利用引物(LM26和LM3)扩增核糖体16S RNA基因的1.35kb片段。同时从总DNA中进行16S rRNA基因的测序。利用引物27f和1401r扩增了经测序的片段，并用GFX^TMPCR市售系统(Amersham，Bioscience，UK)进行了纯化。还可以按照其他作者描述的方法(Jonson，1994.Similarityanalysis of rRNAs.In Methods for General and Molecular Bacteriology；Gerhard，P.；Murray，R.G.E.；Wood，W.A.；Krieg，N.R.，Eds.AmericanSociety for Microbiology，Washington，DC.Pp 683-700；Satokari等，2001.Bifidobacterial Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCRand Denaturating Gradient Gel Electrophoresis.Appl.Environ.Microbiol.67，504-513；Favier等，2002.Molecular Monitoring of Succession ofBacterial Communities in Human Neonates.Appl.Environ.Microbiol.68，219-22)利用引物530f和U-968f进行测序。利用自动化DNA测序仪ABI3700(Applied Biosystem，Foster City，CA)进行测序。通过BLAST算法在GenBank数据库中检索最接近的相关序列(Altschul等，1990.Basic localalighment search tool.J.Mol Biol.215，403-410)。

实施例7：评价双歧杆菌属菌株调节由患有活动性疾病并接受了无谷蛋白饮食治疗后的乳糜泻个体之肠道微生物群改变所引起的促炎性应答的能力

1.制备肠道双歧杆菌培养物和粪便样品以用于评价

将双歧杆菌属菌株以1％接种于含有约0.05％半胱氨酸(MRS-C)的10ml MRS生长培养基(Scharlau Chemie S.A.，Barcelona，Spain)中培养24小时，并在厌氧条件下(AnaeroGen；Oxiod，Basingstoke，UK)于37℃孵育22小时。通过离心(6,000g，15分钟)收集细胞，用PBS(10mM磷酸钠，130mM氯化钠，pH值7.4)清洗2次并重悬于含有20％甘油的PBS中。将等份试样的该悬液用液氮冻存并保存于-80℃。将细胞孵育48小时后于MRSC板上重新计数，以测定冷冻-融解循环后有活力细胞的数目。在所有情况下其活力都高于90％。每次试验使用一份等份试样。

将来自患有活动性疾病(诊断时)且接受了至少2年无谷蛋白饮食治疗之乳糜泻患者的粪便用磷酸缓冲液1/10稀释，在匀浆器中匀浆3-5分钟并冻于-20℃，以用作外周血单个核细胞的刺激物。另外取健康个体的粪便样品作为对照。

2.分离并刺激PBMC

从4名健康志愿者(平均年龄30岁，24-40岁之间)的外周血中分离PBMC至加有肝素的管中。通过Ficoll密度梯度离心(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)分离出PBMC。用RPMI 1640培养基(Cambrex，New York，USA)清洗细胞，并调节密度至每ml RPMI 1640培养基(另外含有10％胎牛血清(Gibco，Barcelona，Spain)，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(Sigma))中含1×10⁶个细胞。在存在或不存在刺激剂的情况下，将PBMC在平底24孔聚苯乙烯板(Corning，Madrid，Spain)中在37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。在存在或不存在30μl 1×10⁶CFU/ml的活细菌细胞悬液的情况下，利用健康个体、活动性乳糜泻患者和非活动性乳糜泻患者之粪便的提取物作为刺激物。用浓度为1μg/ml的大肠杆菌O111:B4的经纯化脂多糖(LPS)(Sigma，St.Louis，MO)作为阳性对照。测定未经刺激的PBMC中细胞因子的产量作为阴性对照。每次实验中对每种类型的刺激物一式两份进行测试。通过离心收集培养物的上清液，分级并以等份试样储存于-20℃直到细胞因子检测。

3.测定细胞因子以及细胞活化的标志物

根据生厂商的说明，利用Bioscience的ELISA试剂盒(BD Biosciences，San Diego，CA)测定上清液中细胞因子(IFN-γ、IL-10和TGF-β)的浓度。利用经FITC标记的抗CD4、CD8和CD86抗体(eBioscience，San Diego，CA)和流式细胞仪(Flow cytometerXL-MCL；Bechman Coulter，Florida)检测不同的淋巴细胞群及其活化。免疫应答中由核因子(NF)κB介导的信号转导途径的作用通过加入其抑制剂(乳胞素，lactacistina)而测定。

结果

乳糜泻患者的粪便显示出微生物群组成的变化，其在PBMC中诱导产生的促炎性细胞因子(TNF-α和IFN-γ)高于健康个体，而抗炎细胞因子IL-10则低于健康个体。与对照粪便相比，它们还增加了对活化T细胞而言所必需的表面分子CD86的合成。与双歧杆菌共孵育可以调节由乳糜泻患者粪便微生物群诱导的促炎性细胞因子谱，减少TNF-α和IFN-γ的合成并增加IL-10的合成。乳胞素存在时细胞因子的合成受到抑制，这表明NFκB参与了双歧杆菌发挥的免疫调节作用。

实施例8.体外消化过程中产生的麦醇溶蛋白级分的表征和通过双歧杆菌及其生物学作用使来源于麦醇溶蛋白胃肠消化之肽减少的表征

1.麦醇溶蛋白的胃肠消化

使用麦醇溶蛋白的市售配制物(Sigma，G3375)，其中含有4种异构体：α-/β-、γ-和ω-麦醇溶蛋白，这些蛋白的全部氨基酸序列均是已知的。

在pH值为3的等渗盐溶液(140mM NaCl，5mM KCl)中配制市售麦醇溶蛋白提取物的不同等份试样溶液(150mg)，在浴锅中使混合物加热至55℃30分钟并同时搅拌。利用胃蛋白酶(Sigma，P7000)(800-2500UI/mg蛋白)、猪胰酶(P1750)(活性，4×USP)和胆汁提取物(B3883)对样品进行经刺激的胃肠消化过程。

在离心管(50ml)中进行胃消化(胃蛋白酶，在0.1M HCl中，pH值为3，1小时，搅拌)。随后，在用透析膜(Spectra/Por 2.1，Spectrum Medical，Gardena，CA)(孔径为15KDa)制备的二室系统的上部隔室(供给室)(1.5ml)中进行肠消化阶段(胰酶-胆汁，在0.1M NaHCO₃中，pH 6.9-7，2小时，搅拌)。下部隔室(接收室)中装有盐水溶液(1ml)。一旦消化过程完成，就利用一种市售试剂盒(Sigma，TP0200)基于Lowry法对经胃肠消化之样品和经透析样品之上清液(4000rpm/5分钟/4℃)中的总蛋白质含量进行定量。

2.体外消化过程后麦醇溶蛋白级分的色谱分析

为了分析麦醇溶蛋白，利用反相色谱法。利用Hewlett Packard 1050HPLC设备在BioBasic C18柱(5μm 4.6×250mm)中进行分离。所使用的流动相由(A)含0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的15％(v/v)乙腈(ACN，HPLC级)水溶液和(B)含0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)ACN水溶液组成。所使用的洗脱梯度如下：0-5分钟.，线性梯度至5％溶剂B；5-12分钟.，线性梯度至20％溶剂B。色谱柱用100％的溶剂B清洗5分钟，并用初始条件重新平衡3分钟。样品经尼龙膜(13mm 0.22μm Millex GN，Millipore)过滤。每次处理分析3个独立的等份试样(100μl)。监测210nm处紫外区的吸光度。

3.反相色谱技术联用电喷雾-MsMs(RP-HPLC-ESI-MS/MS)鉴定麦醇溶蛋白的肽序列

利用与四极离子阱质谱仪(Esquire-LC-Ms(n)，Bruker Daltonics，Bilerica，MA)相连的Agilent HPLC系统设备在BioBasic C18柱(5μm4.6×250mm)中进行色谱分离。所使用的色谱洗脱梯度如前一部分所述。分析时，在大约5×10^-3巴的压力下使用氮气作为雾化干燥气，使用氦气作为分子碰撞气体。碰撞的毛细管电压保持在4kV。在500-5000的质量/负荷(mass/load)范围内监测质谱。该方法显示15个光谱的平均质量分析(Ms)以及5个光谱的连续质量分析(Ms(n))。进行连续质量分析的离子流限度为5000，并且以0.39-2.6V的电压升幅以m/z 4.0的片段范围分离前体离子。利用生厂商提供的分析软件(Data Analysis version 3，BrukerDaltonics)对m/z光谱数据进行加工和转换。利用分析软件(BioToolsversion 2.1(Bruker Daltonics))确定光谱Ms(n)的肽序列。

4.经胃肠消化的麦醇溶蛋白与双歧杆菌共孵育的作用

在存在或不存在肠道双歧杆菌(例如本发明的菌株)的情况下，将第1部分中获得的经胃肠消化的麦醇溶蛋白样品共孵育，其置于Caco-2细胞(用作肠上皮细胞模型)转移室(transwell)中培养物的顶部(供应室)。为了评估在存在本发明菌株(IATA-ES1)时麦醇溶蛋白毒性作用的减少，利用ELISA法测定存在或不存在双歧杆菌时底腔(接受室)Caco-2细胞培养物中促炎性细胞因子TNF-α和NFκB的合成(图3和图4)。

结果

经胃肠消化的麦醇溶蛋白样品透析后小于15KDa之蛋白级分的RP-HPLC分析

色谱分离(图2)表明存在5个肽级分，其中主要是#2级分。对存在不同细菌菌株(即本发明的菌株(IATA-ES1))以及双歧杆菌A2(本实验室分离)时来源于麦醇溶蛋白之肽的可透析性研究表明，这些细菌具有对麦醇溶蛋白特别是#2级分的蛋白水解能力。使#2级分减少最多的菌株是本发明的菌株(IATA-ES1)，其在研究条件下使级分减少超过10％。

实施例9.评价双歧杆菌属菌株对参与抗原呈递的树突状细胞中由麦醇溶蛋白引起的成熟和促炎性表型的调节能力

1.制备肠道双歧杆菌培养物和粪便样品以用于评价

将双歧杆菌属菌株以1％接种于含有0.05％半胱氨酸(MRS-C)的10mlMRS生长培养基(Scharlau Chemie S.A.，Barcelona，Spain)中培养24小时，并在厌氧条件下(AnaeroGen；Oxiod，Basingstoke，UK)于37℃孵育22小时。通过离心(6,000g，15分钟)收集细胞，用PBS(10mM磷酸钠，130mM氯化钠，pH值7.4)清洗2次并重悬于含有20％甘油的PBS中。将该悬液的等份试样用液氮冷冻并保存于-80℃。孵育48小时后于MRSC板上计数，以确定冷冻-融解循环后有活力细胞的数目。在所有情况下其活力都高于90％。每份等份试样用于一次试验。在使用细胞作为刺激物前，将其通过离心进行清洗并重悬于PBS中。

2.分离并刺激从外周血中获得的树突状细胞(DC)

从4名健康志愿者(平均年龄30岁，24-40岁之间)的外周血中分离PBMC至加有肝素的试管中。通过Ficoll梯度离心(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)分离PBMC。用RPMI 1640培养基(Cambrex，New York，USA)清洗细胞，并调整密度至每ml RPMI 1640培养基(另外含有10％的胎牛血清(Gibco，Barcelona，Spain)，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(Sigma))中含1×10⁶个细胞。在存在或不存在刺激试剂的情况下，将PBMC在平底24孔聚苯乙烯板(Corning，Madrid，Spain)中于37℃和5％CO₂条件下孵育24小时。在存在和不存在双歧杆菌及其它肠道细菌的情况下，使用麦醇溶蛋白(0.1mg/ml)和IFN-γ(150UI)作为刺激物。使用浓度为1μg/ml的大肠杆菌O111:B4之经纯化脂多糖(LPS)(Sigma，St.Louis，MO)作为阳性对照。作为阴性对照，测定了未经刺激的PBMC中细胞因子的产量。每次实验中对每种类型的刺激物进行一式两份测试。离心收集培养物的上清液，分级并以等分试样储存于-20℃知道进行细胞因子检测。

3.细胞因子及细胞活化标志物的测定

根据生厂商的说明，利用Bioscience的ELISA试剂盒(BDBiosciences，San Diego，CA)测定上清液中细胞因子(IFN-γ、IL-10和TGF-β)的浓度。利用经FITC标记的抗HLA-DR、CD86、CD40和CD83抗体(eBioscience，San Diego，CA)检测活化分子的标记物，并通过流式细胞仪(Flow cytometerXL-MCL；Beckman Coulter，Florida)定量。

结果

本发明的菌株(IATA-ES1)能够使麦醇溶蛋白和其他潜在的促炎性肠道细菌(例如从乳糜泻患者中分离的拟杆菌和肠细菌)刺激树突状细胞后产生的IFN-γ(乳糜泻患者应答于麦醇溶蛋白所产生的主要炎症细胞因子)减少至少10％。与麦醇溶蛋白刺激所产生的作用相比，该菌株还使树突状细胞中抗炎细胞因子IL-10的合成增加至少200％。在存在麦醇溶蛋白和IFN-γ时，本发明的菌株(IATA-ES1)使树突状细胞孵育后诱导的HLA-DR和CD86分子的表达减少15-20％。