原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途

摘要

一种生物工程技术领域的原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途。本发明编码的黄素依赖型单加氧酶能催化吲哚生成靛蓝，基因的核苷酸序列长度为1371个碱基，编码456个氨基酸。所述的基因所表达的酶具有催化吲哚生成靛蓝的能力，含有所述的基因的Escherichia coli转化子能够将培养基中的吲哚高效地转化为靛蓝。本发明通过从土壤样品中提取总DNA，构建宏基因组文库，功能筛选、测序分析获得单组份黄素依赖型单加氧酶基因。此酶有催化吲哚生成靛蓝的潜能。这是国内第一个从原核生物中分离得到的单加氧酶基因，为生物合成染料提供了更加具有应用前景的新酶，同时为染料靛蓝的生物生产提供了更为广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的基因，具体地说，是一种原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途。

背景技术

靛蓝是一种颜色鲜艳而又耐久的蓝色染料，是最早发现的天然染料之一，广泛应用于印染、医药和食品等工业。随着经济的发展和人们认识水平的提高，“天然、无污染”观念深入人心。微生物生长快、培养容易，易于工业化，利用微生物生产天然色素的技术具有广阔的发展前景。基因工程、酶工程、介质工程以及遗传学的不断发展推动了生物合成靛蓝研究的发展。到了本世纪，生物转化合成天然靛蓝开始引起了科学工作者的注意。生物转化生产靛蓝产生的有害废物比化学方法少，既节能又廉价，对保护自然环境、维持生态平衡等方面无疑都是具有重要意义的。

单组份的黄素单加氧酶(FMO)一般都存在于真核生物中，因其区域选择和手性催化，以及稳定性好等特点，在异源生物质代谢、药代动力学和生物催化合成等领域受到了广泛的关注。FMO最初在肝微粒体中被发现，并在所有的哺乳动物及其它的真核生物体中均有发现。在哺乳动物和人类的许多亚型中都存在，并且每种都有其底物特异性及组织局限性。五种FMO基因和六种FMO假基因已经在从人类基因组中分离到，其中FMO3是人类肝脏中最重要的亚型。FMO在细胞色素P450系统的活性的协同下，对人体内的毒物及其它外源物的解毒起着十分重要的作用。这种单加氧酶能够催化与碳键相连的有活力的杂原子，包括氮，硫，磷，硒或者碘。与哺乳动物的FMO不同，酵母中的FMO不能氧化含氮的化合物，而仅仅对生物硫醇有活力。在内质网中，酵母的FMO需要通过提供一个氧化的环境，从而对含二硫键的蛋白进行有效的折叠。在植物中，FMO也能对在植物生长中起重要作用的激素，植物生长素，进行生物合成。基因组序列分析表明，FMO基因同系物在植物基因组中频繁出现，例如在拟南芥中存在29个基因同系物。

2003年，Choi等人在韩国于噬甲基菌SK1(Methylophaga sp strain SK1)中发现第一个细菌中的FMO基因，对其基因的过表达及部分鉴定表明，这种酶能够氧化许多胺类化合物。将这种细菌中得到的FMO基因在大肠杆菌细胞进行重组表达，发现其能够稳定地催化吲哚生成大量的靛蓝。此FMO基因在GenBank数据库中的收录号为AF494423，相关成果发表在Biochem Biophys ResCommun杂志上，噬甲基菌SK1保藏于Japan Collection of Microorganisms，编号为JCM number：14647。

2008年，Alfieri等意大利学者将此FMO蛋白结晶，从晶体结构中的位置来看，烟碱环和其邻近的含NADP⁺的核糖被证明是构成催化位点必需的组成部分，它能有效地稳定被氧化了的中间体。这个发现说明了NADP(H)在起着另一个特别的作用。相关研究结果在Proc Natl Acad Sci杂志上给予了说明。通过对现存的细菌基因组的FMO的特异的序列分析表明，与真核的基因组相比，细菌中的FMO相对稀少，仅仅能够鉴定到一些典型的FMO。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因及用途，本发明是一种原核生物起源的，能催化吲哚生成靛蓝的黄素依赖型单加氧酶的基因FMO，可应用于生物催化合成等领域。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因，其编码的黄素依赖型单加氧酶能催化吲哚生成靛蓝，该基因的核苷酸序列如Seq Id No.1所示，其氨基酸序列如Seq Id No.2所示。

本发明还涉及如上所述的原核生物中单组份黄素依赖型单加氧酶基因的用途，所述的基因所表达的酶具有催化吲哚生成靛蓝的能力，含有所述的基因的Escherichia coli转化子能够将培养基中的吲哚高效地转化为靛蓝。

本发明从被原油污染的土壤中提取总DNA，构建宏基因组文库。从中筛选到一种能使底物吲哚变蓝的活性克隆，测序后得到一种新的细菌中的FMO基因，其碱基序列如序列表所示。该基因与已经报道的细菌Methylophaga sp.SK1的单组份黄素依赖型单加氧酶碱基序列没有相似性，氨基酸序列的相似性仅为73％。

相比于真核生物中的FMO，本发明的FMO更适合进行基因工程菌株的构建，应用于生物催化生产之中，这是因为真核生物的基因在细菌等原核生物中的表达，至今仍存在很多问题，如：稀有密码子的出现导致不能正常翻译；真核生物的蛋白质在细菌中不能进行修饰造成没有活性；真核基因的内含子、启动子、SD序列与细菌的差异等。这一系列问题造成了真核生物FMO基因操作的困难，限制了其在生产中的广泛应用。本发明的FMO则不存在此类问题，而更适合于实际应用。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例从被原油污染的土壤中提取总DNA，产物经过纯化后随机打断，然后将6-8kb DNA片段连接到pUC118 Hinc II/BAP载体上，转化宿主细胞大肠杆菌E.coli B5后构建宏基因组文库。

将从土壤中分离构建的宏基因组文库克隆涂布到含100μg ml^-1氨苄青霉素、20μg ml^-1 IPTG LB琼脂平板上，倒置培养12小时后，向培养皿底盖中加入适量吲哚固体，37℃继续培养。一段时间后，挑取变蓝单菌落，提取重组质粒DNA，纯化后测序。插入片段命名为pBY12-20，经序列比对后获得FMO基因。基因长度1371个碱基，编码456个氨基酸序列。

FMO基因的扩增：

上游引物：5’-CGACGGATCCATGACCACACGCATCGCCATCATCG-3’

下游引物：5’-CAGCCTCGAGTCAGCCCACGGCCTTGATG-3’

反应参数：

94℃变性5分钟，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1.5分钟，35个循环后，72℃延伸10分钟，得到PCR产物。

FMO基因的亚克隆：

将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶后回收目的基因片断，连接到pMD18-T载体上，得到质粒pFMO2-5，转化到感受态大肠杆菌DH5α中。5ml LB_Amp液体摇管培养，1毫摩尔每升IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，37℃过夜培养，有蓝色物质生成。

所述的LB培养基配方为：每1,000毫升去离子水中含有酵母膏10克、蛋白胨10克、NaCl 10克，用NaOH溶液调节pH值为7.0，121摄氏度灭菌15分钟。

LB_Amp液体：LB培养基加入100μg ml^-1氨苄青霉素。

靛蓝产量的测定：

将含质粒pFMO2-5的大肠杆菌DH5α经过LB液体培养基活化后，转接到3个100ml的LB_Amp液体三角瓶中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6左右时，各加入终浓度为1毫摩尔每升IPTG诱导，37℃，200转/分继续培养20小时。

11,000转/分，收获菌体细胞，5分钟离心去上清，蒸馏水洗涤两次后，菌体重悬于30ml DMSO中，样品稀释4倍后，紫外/可见分光光度计测定其620nm处吸光值。

配制靛蓝标准样品，样品浓度分别为0.125mg ml^-1，0.0625mg ml^-1，0.03125mg ml^-1，0.015625mgml^-1，0.0078125mg ml^-1，紫外/可见分光光度计分别测定其620nm处吸光值，绘制标准曲线。

靛蓝样品标准曲线的制作如下表：

  靛蓝标准样品浓度(mg ml^-1)  靛蓝标准样品620nm处吸光值  0.125  3.362  0.0625  1.756  0.03125  0.883  0.015625  0.416  0.0078125  0.209

从以上数据可得靛蓝样品的标准曲线为：y＝0.03678x，R＝0.99963，R²＝0.99926。

100ml LB液体培养基得到的靛蓝产量数据与靛蓝样品的标准曲线比对，确定靛蓝产量。

实施例1

通过pMD18-T载体对FMO进行表达生产靛蓝

方法：将对FMO基因进行扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶后回收目的基因片断，连接到pMD18-T载体上，得到质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α中。5ml LB_Amp液体摇管培养，37℃过夜培养。

将过夜培养的菌液转接到3个100ml的LB_Amp液体三角瓶中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6左右时，各加入终浓度为1毫摩尔每升IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，37℃，200转/分继续培养20小时。

将3个100ml LB液体培养基得到的靛蓝产量数据与靛蓝样品的标准曲线比对，确定靛蓝产量。

所述的LB培养基配方为：每1,000毫升去离子水中含有酵母膏10克、蛋白胨10克、NaCl 10克，用NaOH溶液调节pH值为7.0，121摄氏度灭菌15分钟。

LB_Amp液体：LB培养基加入100μg ml^-1氨苄青霉素。

结果：100ml LB培养基中生物靛蓝的产量约为32mg ml^-1。

实施例2

通过pET-28a载体对FMO进行表达生产靛蓝

方法：将对FMO基因进行扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶后回收目的基因片断，连接到pET-28a载体上，得到质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。5ml LB _Kan液体摇管培养，37℃过夜培养。

将过夜培养的菌液转接到3个100ml的LB_Kan液体三角瓶中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6左右时，各加入终浓度为0.4毫摩尔每升IPTG诱导，16℃，130转/分继续培养20小时。

将3个100ml LB液体培养基得到的靛蓝产量数据与靛蓝样品的标准曲线比对，确定靛蓝产量。

所述的LB培养基配方为：每1,000毫升去离子水中含有酵母膏10克、蛋白胨10克、NaCl 10克，用NaOH溶液调节pH值为7.0，121摄氏度灭菌15分钟。

LB_Kan液体：LB培养基加入100μg ml^-1卡那霉素。

结果：100ml LB培养基中生物靛蓝的产量约为55mg ml^-1。