细菌中一种黄素依赖型单加氧酶的克隆表达及催化机制研究

摘要

黄素依赖型单加氧酶（FMO，E.C.1.14.13.8）是除了细胞色素P450（CYP450，E.C.1.14.14.1）之外，人类代谢系统中最重要的单加氧酶系统之一，它与外源物的代谢及毒物的多种应答有关。与真核生物的基因组中的FMO相比，细菌的FMO相对稀少，仅仅鉴定到一些典型的FMO。原核生物中第一种鉴定过的FMO蛋白（bFMO）来自噬甲基菌SK1（Methylophaga sp.strain SK1）中，得到可溶性FMO蛋白的X射线结构能够在2.6埃的分辨率上得以呈现。
　　所有哺乳动物的FMO对细胞膜都有着很强的结合，且蛋白水溶性很低，而目前为止没有得到过任何哺乳动物的FMO晶体结构。细菌中的FMO则不存在此类问题，从而更适合于实际应用。又因其区域选择和手性催化，以及稳定性好等特点，在异源生物质代谢、药代动力学和生物催化合成等领域受到了广泛的关注。
　　本课题从原油污染的土壤样品中建立宏基因组文库，分离到一种能使吲哚变蓝的转化子，我们将此功能的fmo基因命名为bfmoⅡ。生物信息学分析表明，bFMOⅡ与之前研究过的bFMO存在着许多差异性，体现在密码子的使用偏好性不同等。序列比对表明，bFMOⅡ的许多结构与已结晶过的FMO蛋白有着很大相似性。系统发育树的构建，证实了原核生物中FMO存在的多样性，这为以后相应研究的进一步开展打下了基础。
　　通过将基因连入克隆载体pMD18-T，导入大肠杆菌DH5α，能将LB培养基中由宿主菌代谢生成的吲哚，进一步转化成生物靛蓝，并对生物靛蓝产量做了初步测定；通过将基因连入载体pET-28a，导入到大肠杆菌BL21（DE3)中，能将吲哚及吲哚类衍生物转化成不同色素，为之前未曾证实过的。
　　本研究建立了一套完整的bFMOⅡ蛋白诱导表达及纯化的方案。在通过对bFMOⅡ蛋白诱导条件的选择，确定了以含质粒pET-28a-FMO的大肠杆菌BL21（DE3）的酶表达体系。优化了诱导表达条件，实验选择了低温诱导（16℃），低浓度的诱导物（终浓度为0.3 mM IPTG），温和的表达环境（130 rpm），经过对诱导后菌体细胞的破壁，得到了大量的可溶性蛋白，为后续蛋白的纯化打下了基础。在酶的分离纯化过程中，通过实验摸索，发现了硫酸铵沉淀为酶纯化过程的关键。通过硫酸铵沉淀，将破壁后的粗酶液中的bFMOⅡ蛋白进行了初步的捕获，得到了满意的实验结果，获得了均质的bFMOⅡ。
　　对纯化后的bFMOⅡ的基本性质进行了研究。通过非变性凝胶电泳得知bFMOⅡ活性状态下，分子量大小约为110 kDa，为同型二聚体，单体分子量约为55 kDa。通过对酶纯化过程中的颜色及对纯酶的全波长扫描，发现bFMOⅡ内含有非共价结合的辅因子FAD，且在纯化过程中容易丢失。通过bFMOⅡ的辅因子定量分析得知，酶中的一个亚基需要结合一个辅因子FAD。
　　对bFMOⅡ设计了四个可能存在的关键位点，并进行了点突变及活性验证。通过观察突变体对吲哚转化的直接影响，确立了快捷的突变体活性检测方法。结果说明，实验所设计的四个位点相对应的氨基酸残基，对bFMOⅡ的活性起着重要的活用。通过同源建模，对bFMOⅡ及同位点的两个bFMOⅡ突变体构建了模型，并对模型结果进行评估，得到了理想的结构。通过对结构中部分突变位点处结构的模拟对比，从理论上初步推测了酶失活的机制。

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第一章 综述

1.1用单加氧酶进行的生物催化

1.2黄素蛋白单加氧酶

1.3 黄素蛋白单加氧酶的分类

1.4 B类黄素蛋白单加氧酶

1.5 细菌中黄素依赖型单加氧酶的研究进展

1.6 本课题的研究意义

第二章 细菌中fmo基因的筛选与分析

2.1 前言

2.2 实验材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 本章小结

第三章 细菌中fmo基因的克隆与质粒的构建

3.1 前言

3.2 实验材料与试剂

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 本章小结

第四章 bFMOⅡ的纯化及相关性质研究

4.1 前言

4.2 实验材料与试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 本章小结

第五章 bFMOⅡ突变株的构建与部分活性位点分析

5.1 前言

5.2 实验材料与试剂

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 本章小结

参考文献

致谢

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