用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法

摘要

本发明总体涉及用于治疗致病性阴道生物被膜的方法和组合物。更具体地讲，本发明涉及包含硼酸和二乙胺四乙酸(EDTA)组合的药用组合物和使用此类组合物治疗或预防生物被膜形成的方法，该生物被膜形成与阴道感染例如细菌性阴道病(BV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)、毛滴虫病或混合感染有关。

说明书

发明领域

本发明总体涉及用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法。

发明背景

依照疾病控制中心(CDC)，阴道炎是育龄妇女极常见的诊断疾病，致使每年有超过1千万人去诊所看病。绝大多数的阴道炎病例涉及三种感染之一：细菌性阴道病(BV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)(亦称为″阴道酵母感染″)和毛滴虫病。细菌性阴道病占所有感染的约40-45％，而VVC和毛滴虫病分别占约20-25％和15-20％。在某些情况下，阴道炎的病因可混合。不幸的是，阴道炎的全国性监视数据缺乏，因为无可报告的疾病；然而，由National Health and Nutrition ExaminationSurvey对BV的患病率评估显示在全美国年龄在14-49岁之间的人口中近三分之一(29％)的妇女呈该感染阳性。

虽然许多FDA批准的疗法可用于治疗阴道炎，但是由于抗治疗生物体和复发和持续感染的比率增加，常常使治疗具有挑战性并进一步复杂化。此外，有不断增加的科学证据鉴定这些感染为更严重的健康并发症的重要危险因素，尤其在怀孕期间。据报导，去诊所看病和自我治疗阴道炎的直接费用估计是每年多于10亿美元；然而，涉及继发性并发症(例如，在怀孕中发病、盆腔炎症性疾病和手术后感染)和丧失劳动能力的间接费用远远更大。

因此，这些感染的公共健康含意是明显的，并对改善的治疗方法存在需要。

生物被膜相关性感染于1978年首次描述，现在认为是多于60％的人类感染尤其是其持续性感染和复发性感染的诱发因素。对于由细菌和真菌生物引起的宽范围的慢性感染，包括皮肤创伤和烧伤、中耳炎、牙周病、心内膜炎、泌尿道感染和装置相关性感染(例如，导管、心脏瓣膜)，已经描述了生物被膜，但是不认为在阴道感染的病因中是重要的，因此，实际上阴道炎治疗领域的技术人员还没有解决这一问题。

生物被膜是嵌入保护性表多糖(即，碳水化合物)基质的高度组织的微生物群体，该基质通过粘附蛋白附着至无活性和活的膜表面(即，固着的群)。与其自由漂浮的或″浮游生物的″微生物相反，众所周知生物被膜相关性微生物耐抗微生物治疗-最高达1000倍或更大-是许多复发性感染和顽固性感染的病源。认为其持续性部分涉及基因的上调，该基因赋予高度不同的和抗药的生物被膜表型，该生物被膜表型维持生物被膜群落的生长和存活。这包括生物被膜基质材料的形成，这限制了抗微生物剂的渗透，干扰正常宿主的防御机制，并产生基本上不耐杀灭的″耐药株(persister)″生物。

生物被膜在固体表面上迁移离开高应力区域的能力-称为群游的能力-及其慢生长速率也被认为有助于其致病性和持续性。证据进一步表明，建立的生物被膜通过用作保护这些生物体不被免疫系统和常规抗微生物治疗破坏的屏蔽贮器，而在其它次级病原体例如病毒的持续性中起作用。

硼酸(Boric acid)或硼酸(boracic acid)[B(OH)₃]是有弱抗微生物性质的弱无机酸。在体外，硼酸对白色念珠菌(C.albicans)以及非白色念珠菌种属包括热带念珠菌(C.tropicalis)、光滑念珠菌(C.glabrata)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)的临床分离株具有弱的抑制真菌能力(Shubair，1990；Prutting 1998)。同时，硼酸也在体外显示对常见的细菌性病原体包括葡萄球菌和链球菌、绿脓秆菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)和变形菌(Proteus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和肠杆菌(Enterobacter)属具有抑菌活性(Meers 1990)，硼酸的抗菌作用起效慢，这与许多抗生素相反，似乎独立于细胞生长，因为已经显示分裂期细胞和静止期细胞同样受影响(Meers 1990)。硼酸的弱抗微生物性质使它令人惊讶，硼酸将对阴道感染的治疗有效，尤其是天然抗药的、持续的和复发的那些阴道感染。

硼酸也显示其它生物作用。例如，已经显示硼酸在钙的调节中起作用，并通过作用于胞外基质形成和生长因子合成(Dzondo 2002)而刺激创伤愈合。也已经显示硼酸在前列腺癌细胞系中具有抗增殖作用，且在胃损伤的动物模型中具有细胞保护作用(Barranco 2006)；(Alsaif2004)。也有证据进一步表明，硼酸具有抗病毒活性，尤其是对单纯疱疹病毒(Skinner 1979；Rodu 1988)。在分子水平上，硼酸结合顺式-二醇化合物，包括涉及细胞代谢和信号传导的膜多糖和核酸的碳水化合物部分(例如，RNA、NAD、ATP)，这可部分解释所报导的硼酸对膜和细胞功能的作用(Kim 2006)；而硼酸与乙二胺四乙酸(EDTA)的组合已经证明，在体外对角膜的膜渗透性具有独特的协同作用(Kikuchi2005)。

发明概述

本发明总体涉及意外的发现，由于其作为阴道生物被膜破坏者的角色，硼酸可用于治疗和/或预防阴道感染。我们假定，生物被膜在阴道感染中，尤其在阴道炎中，更具体地讲，在细菌性阴道病(BV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)(亦称为″阴道酵母感染″)和毛滴虫病中起重要作用。

在一个实施方案中，本发明涉及药用组合物，该组合物用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜，包含硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。

在本发明药用组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg-约10g，更优选约0.1mg-约1g，甚至更优选约1mg-约250mg。

在本发明药用组合物中，EDTA的量优选为约0.001mg-约1g，更优选约0.01mg-约250mg。

在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1∶1-约1000∶1。

在另一个实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2∶1-100∶1。

在另一个实施方案中，本发明的药用组合物还包含一种或多种生物活性剂，该生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油、锌离子和镓。

在另一个实施方案中，本发明的药用组合物还包含至少一种添加剂，该添加剂选自胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂和生物粘附剂。

在一个实施方案中，本发明的药用组合物还包含适用于阴道和/或外阴给药的药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括在无任何治疗量的乙酸存在下，将治疗有效量的硼酸给予有需要的患者。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将治疗有效量的包含硼酸和EDTA的药用组合物给予有需要的患者。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将药用组合物每日一次至每日三次施用至阴道和/或外阴。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括将药用组合物间断地例如每周两次施用至阴道和/或外阴，作为预防性治疗。

在另一个实施方案中，将本发明的药用组合物局部施用至患者的阴道和/或外阴。

药用组合物可以以下的形式施用：栓剂、乳膏剂、软膏剂、固体(例如，片剂、胶囊剂、胚珠制剂(ovule)、栓剂)、溶液剂、混悬剂、凝胶剂、泡沫剂、膜或脂质体组合物。药用组合物也可包含在阴道环、棉塞、栓剂、海绵、枕垫、粉扑或渗透泵系统内。

本发明的药用组合物可以与其它药物活性化合物例如与甲硝唑共给药(co-administered)。

也可利用各种聚合物、纤维、树脂、蜡、油或药物化学领域的技术人员所使用的其它药物赋形剂，将药用组合物的剂型配制成缓释形式，以产生药用组合物活性组分的延长释放。

在一个实施方案中，阴道感染是细菌感染。

在另一个实施方案中，阴道感染是外阴阴道念珠菌病。

在还另一个实施方案中，阴道感染是毛滴虫病。

在还另一个实施方案中，阴道感染是病毒感染。

如果不适当的治疗，那么阴道感染可能导致泌尿道感染。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及泌尿道感染的治疗和预防。

在还另一个实施方案中，阴道感染由选自细菌、真菌、寄生虫和病毒的两种或多种病原体引起，并称为混合感染。

在另一个实施方案中，本发明涉及制品，该制品包含包装材料和在该包装材料内的本发明药用组合物。药用组合物以足以治疗患者的阴道感染或致病性阴道生物被膜的量，优选以相当于至少一个单位剂量的量存在。包装材料包含标签，该标签指示药用组合物可以用于治疗阴道感染和相关的致病性阴道生物被膜。优选标签包括其它印刷标记例如成分列表、制造商的名称和地址等。优选包装材料也包括印刷的插入物，包括负责药品管理的政府机构可能要求的关于组合物的详细信息、其用于治疗阴道感染和致病性生物被膜的给药方法、副作用、禁忌症等标记。

附图简述

图1是说明BV病原体共生关系的图；

图2是用生物被膜负荷的log对数减少对未治疗的生物被膜对照，来举例说明硼酸和EDTA对白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的作用的图。

图3是用生物被膜负荷的log对数减少对未治疗的生物被膜对照，来举例说明硼酸和EDTA对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的作用的图。

图4是Kaplan-Meier图，该图举例说明用硼酸治疗的顽固性BV妇女的治愈概率。

发明详述

定义

当用于本文时，″生物被膜″是指表面附着、高度结构的一种或多种微生物群体，其陷入促进在表面例如阴道粘膜上附着、建群和生长的自产生外泌多糖基质内，并显示不同的生物被膜表型。

当作为活性剂涉及化合物时，申请人打算使术语″化合物″或″活性剂″不仅包括具体的分子实体，而且还包括其药学上可接受的药理活性盐。

当用于本文时，术语″治疗″和″处理″是指导致症状的严重性和/或频率降低、症状和/或潜在原因消除、防止症状和/或其潜在原因的发生和/或改善。因此，用本发明所述组合物″治疗″患者包括在易感个体中预防特定的病症，以及处理有临床症状的个体，以抑制或引起病症或疾病的消退。治疗可以包括预防、治疗或治愈。例如，生物被膜的治疗包括在对生物被膜的发育敏感的患者中预防生物被膜形成，以及通过抑制、控制或引起潜在疾病的消退来治疗具有生物被膜的患者。

当用于本文时，术语″阴道″将包括阴道区域，一般也包括外阴、前庭和子宫颈。

术语″阴道感染″包括任何阴道区域包括外阴、前庭和子宫颈的任何感染性病症，包括生物被膜相关性感染。该术语也包括多重阴道感染。

术语″破坏″将包括对生物被膜施加任何和所有的损害。

本发明药用组合物的术语″治疗有效量″是指以可适用于任何药物治疗的合理的利益/风险比，组合物足以治疗病症的量。然而，应理解，本发明组合物的每日总用量将由主治医师在可靠的医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体有效剂量水平将取决于各种因素，包括被治疗的病症和病症的严重性；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所使用的特定化合物的给药时间、给药途径和排泄速率；疗程；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；和在医学领域中熟知的相似因素。例如，组合物的起始剂量低于达到预期疗效所需的水平，并逐渐增加剂量直至达到预期效果，这完全在本领域的技能范围内。

当用于本说明书和权利要求书时，单数形式″一″和″该″包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，涉及″生物活性剂″包括两种或多种生物活性剂的混合物，涉及″药学上可接受的赋形剂″包括此类赋形剂的混合物等。

本发明涉及用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的药用组合物，该组合物包含硼酸和EDTA。

在本发明的药用组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg-约10g，更优选为约0.1mg-约1g，甚至更优选为约1mg-约250mg。

在本发明的药用组合物中，EDTA的量优选为约0.001mg-约1g，更优选约0.01mg-约250mg。

在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1∶1-约1000∶1。

在另一个实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2∶1-100∶1。

本发明的药用组合物还可包含一种或多种生物活性剂，该生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油、锌离子和镓。这些生物活性剂可增强和/或补充硼酸和EDTA的生物被膜破坏作用。

例如，可将镓添加至药用组合物，以通过靶向致病性微生物的铁代谢，并用其在生物被膜形成中的信号传导角色进行干扰，来增强硼酸和EDTA的生物被膜破坏作用。

可添加锌离子或其盐，以增强硼酸和EDTA的生物被膜破坏作用。

可将表面活性剂添加至药用组合物。表面活性剂可通过进一步降低表面张力，并促进活性物质的分散，来提供组合物与阴道粘膜的更佳的表面接触，或可具有抗生物被膜性质，这可补充所述硼酸和EDTA组合物的那些性质。可添加的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸盐和涤波(teepol)等。

本发明的药用组合物还可包含其它添加剂，例如胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂和生物粘附剂。

本发明的药用组合物还包含适用于阴道和/或外阴给药的药学上可接受的载体。

本发明的组合物可包括生理上可耐受的防腐剂。

合适的生理上可耐受的防腐剂包括抑菌剂、防腐剂、抑制剂等，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯(对羟基苯甲酸酯类)；没食子酸丙酯；山梨酸及其钠盐和钾盐；丙酸及其钙盐和钠盐；6-乙酰氧基-2，4-二甲基-m-二烷；2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇；水杨酰苯胺例如二溴水杨酰苯胺和三溴水杨酰苯胺、1-(3-氯烯丙基-3，5，7-三氮杂-1-氮杂金刚烷(azanidadamantane)氯化物的顺式异构体；六氯苯；苯甲酸钠；酚类化合物例如丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、氯代甲酚和溴代甲酚和氯代与溴代-oxylenols；季铵类化合物例如苯扎氯铵；芳族醇类例如2-苯基乙醇和苯甲醇；氯代丁醇；喹啉衍生物例如碘代氯代羟基喹啉等。优选，基于组合物的总重量计，所包含防腐剂的量约0.05％重量-约0.2％重量。

可包括于本发明药用组合物中的药学上可接受的赋形剂包括例如在本领域中熟知的生理上可耐受的表面活性剂、溶剂、润肤剂、着色剂、香料等。优选组合物具有在约3.5-约7范围内的pH值，更优选在约4-4.5的范围内。

本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将治疗有效量的硼酸给予有需要的患者。

本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将治疗有效量的硼酸和EDTA给予有需要的患者。

不受任何具体理论的束缚，认为硼酸可通过以下机理起作用：优先与致病性生物被膜基质的顺式-二醇碳水化合物组分结合，并刺激蛋白酶的合成，从而破坏生物被膜的结构完整性和其与阴道粘膜的粘附。硼酸也可在BV生物被膜中提供另外的优点，因为其通过形成硼酸铵而具有化学″俘获″氨的能力(Thiex NJ等，2002)。该关联性涉及所述阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)(BV生物被膜的主要细菌成分)与二路普雷沃氏菌(P.bivia)(一种次级BV病原体)的共生关系(Pybus 1997)。体外研究表明，阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)利用二路普雷沃氏菌(P.bivia)代谢的氨副产物而茁壮成长，同时二路普雷沃氏菌(P.bivia)利用阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)代谢的氨基酸副产物而茁壮成长。图1用图显示该共生关系。因此，硼酸的阴道给药可通过俘获氨，并耗尽细菌生长和生物被膜形成与存活所需的必需BV营养物质的阴道微环境，而中断该共生关系。

本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染的方法，该方法包括将治疗有效量的药用组合物给予患者，所述组合物包含硼酸和EDTA。

在本发明的药用组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg-约10g，更优选为约0.1mg-约1g，甚至更优选为约1mg-约250mg。

在本发明的药用组合物中，EDTA的量优选为约0.001mg-约1g，更优选约0.01mg-约250mg。

在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1∶1-约1000∶1。

在另一个实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2∶1-100∶1。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将药用组合物每日一次至每日三次施用至阴道和/或外阴。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括将药用组合物间断地例如每周两次施用至阴道和/或外阴，作为预防性治疗。

本发明的药用组合物局部施用至患者的阴道和/或外阴。

所述药用组合物可以以下的形式施用：栓剂、乳膏剂、软膏剂、固体(例如，片剂、胶囊剂、胚珠制剂和栓剂)、溶液剂、混悬剂、凝胶剂、泡沫剂、膜或脂质体组合物。乳膏剂和软膏剂可例如用水性或油性基质来配制，且添加合适的增稠剂和/或胶凝剂。施用本发明组合物的一种技术是利用单次使用的小包(packet)(例如小信封样结构等)，该小包含预定的单一单位剂量。小包最初密封，但在使用时，通过撕裂、切割等，在小包中期望或计划好的位置打开，然后，如标记的那样可直接给予内容物。

药用组合物也可包含在阴道环、棉塞、栓剂、海绵、枕垫、粉扑(puff)或渗透泵系统内。

本发明的药用组合物可以与其它药用组合物，例如与甲硝唑共给药。

也可利用各种聚合物、纤维、树脂、蜡、油或药物化学领域的技术人员所使用的其它药物赋形剂，将药用组合物的剂型配制成缓释形式，以产生药用组合物活性成分的延长释放。

在一个实施方案中，阴道感染是细菌感染。

在另一个实施方案中，阴道感染是外阴阴道念珠菌病。

在还另一个实施方案中，阴道感染是毛滴虫病。

在还另一个实施方案中，阴道感染是病毒感染。

如果不适当治疗，阴道感染可能导致泌尿道感染。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及泌尿道感染的治疗和预防。

在还另一个实施方案中，阴道感染由选自细菌、真菌、寄生虫和病毒的两种或多种病原体引起。

当用于治疗与生物被膜形成相关的阴道感染时，此类方法和药用组合物可以与其它抗微生物疗法，包括抗细菌药、抗真菌药、抗寄生虫药或抗病毒药组合使用，以增强其抗微生物效力和/或减少其剂量需要。

此外，也可将本发明的方法和药用组合物用作其它药物，例如抗生素、抗真菌药、抗寄生虫药和抗炎药的载体材料，因此进一步拓宽了组合物的药物效力。

给予人或低等动物的本发明组合物的每日总剂量可以为约100mg/天-约15g/天。更优选的剂量可以为约500mg/天-约5g/天。如果需要，为了给药的目的，可以将每日有效剂量分成多个剂量；因此，单剂量组合物可包含此类量或其约数，以组成每日剂量。

本发明也涉及制品，该制品包含包装材料和在该包装材料内的本发明药用组合物。药用组合物以足以治疗患者的阴道感染和/或破坏致病性阴道生物被膜的量，优选以相当于至少一个单位剂量的量存在。包装材料包含标签，该标签指示药用组合物可以用于治疗阴道感染和/或破坏致病性阴道生物被膜。优选，标签包括其它印刷标记例如成分列表、制造商的名称和地址等。优选包装材料也包括印刷的插入物，包括负责药品管理的政府机构可能要求的关于组合物的详细信息、其用于治疗致病性阴道生物被膜和阴道感染的给药方法、副作用、禁忌症等标记。

如实施例所示，提供的组合物和方法证明本发明方法和药用组合物的意外的有利性质。提供的实施例仅用于举例说明的目的，无意限制本发明，除非在权利要求中另外说明。

实施例1

通过硼酸和EDTA来破坏白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜

A)实验方法：

使用CDC生物膜反应器(Biosurface Technologies Corporation)，在体外研究硼酸和EDTA在各种试验浓度下，单独和组合对白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的生物被膜破坏作用。实验在Bozeman，Montana的生物被膜工程中心进行。基于其重现性和提供抗微生物剂评价所需的一致生物被膜样品和生长条件的能力，来选择CDC生物膜反应器方法。作为生物被膜实验的前奏，利用标准的MIC方法，建立硼酸和EDTA对两种试验生物的浮游生物(即自由漂浮的对生物被膜相关的)MIC值。与白色念珠菌(C.albicans)相反，硼酸和EDTA对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值以前没有报导。

CDC反应器由悬挂于汽门盖(ported lid)的8个聚碳酸酯取样管支持器组成。各支持器容纳3个分开的取样管。将具有取样管支持器和取样管的盖子(lid)(共24个)装入有侧壁排卸孔的1升玻璃容器内。通过使液体生长培养基循环经过容器来形成生物被膜，而混合和剪切力由通过磁性搅拌板旋转的磁性搅拌棒/叶片产生。

在与本发明有关的生物被膜实验的制备中，通过将1mL冷冻的储液添加至9mL生长培养基(在50％BHI肉汤+1％淀粉中的阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)ATCC#14018，或在50％SD肉汤+1％蔗糖中的白色念珠菌(C.albicans)ATCC#96113)，并在37℃温育24小时，来制备白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的过夜培养物。白色念珠菌(C.albicans)在常压条件下生长，而阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)在加入5％CO₂的情况下生长。

一旦过夜培养物准备好，就将24个聚碳酸酯取样管置于CDC生物膜反应器取样管支持器内，并使用活动扳手固定。然后将流入/流出的管端阻止并夹住，使整个容器高压灭菌20分钟。将合适的培养基直接加入反应器内，到流出侧臂(约350mL)。反应器然后用4mL的过夜培养物接种。为了有助于最佳的生物被膜生长，使白色念珠菌(C.albicans)反应器在常压条件下在37℃温育，且按最低的设置连续搅拌24小时。将阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)反应器置于5％CO₂恒温箱中，且按最低的设置连续搅拌120小时。该生物被膜形成期称为″分批模式″。在分批模式完成之后，生长培养基开始按1mL/min流动，再通过蠕动泵持续流动24小时。

下一步，将24个生物被膜覆盖的取样管从CDC反应器中无菌移除，并置于24孔板内，且各孔含有2mL的试验溶液。使试验溶液按一式三份运行，并包括不同浓度的硼酸(BA)和EDTA或其组合。基于目前治疗标准的用于各自感染的生长对照和活性剂对照也包括在内。选择8μg/mL浓度的氟康唑作为白色念珠菌(C.albicans)的治疗对照。这表示在生物流体和组织包括阴道分泌物和组织中达到的药物水平范围的较高端(4.12-8.08μg/mL)，然后以400mg的最大日剂量口服给予氟康唑(超过目前FDA批准用于阴道念珠菌病的剂量的两倍)。用于阴道加德纳氏菌(H.vaginalis)的活性剂对照是192μg/mL浓度的甲硝唑。该浓度部分基于在该研究中发现的甲硝唑对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值(128μg/mL)，并表示落在由其它研究者报导的MIC值的较高端的保守水平。也应注意，该水平比用批准的750mg BV方案(Flagyl)所达到的甲硝唑的峰全身水平高超过8倍。

将各试验溶液溶于适当的介质，并在使用前过滤灭菌。然后，使板在适当的生长条件下温育24小时。在24小时处理期之后，通过除去孔内的溶液并添加2mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)，来冲洗所有的取样管。重复该操作，总共冲洗两次。然后，将取样管无菌转移至含10mL无菌PBS的15mL无菌锥形瓶。将管旋涡振荡30秒，超声处理2分钟，然后再旋涡振荡30秒。将细胞悬液连续稀释，并接种在琼脂上(白色念珠菌(C.albicans)为SD琼脂，阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)为BHI+1％淀粉)。将板温育24-48小时，菌落计数。结果报告为每cm²菌落形成单位(cfu)的数目，和相对于未治疗的生物被膜对照，生物被膜负荷中平均log对数减少。

B)生物被膜破坏：

在这些实验中，硼酸和EDTA对已建立的生物被膜显示显著的影响，完全超出了活性剂对照所观察到的结果，并始终在有效杀灭所需的3-log阈值以上(即，杀菌活性对抑菌活性)。事实上，活性剂对照-两种FDA批准的抗微生物剂-对各自的致病性生物被膜均没有可感知的影响。

对于白色念珠菌(C.albicans)，如图2所示，硼酸和EDTA的组合观察到协同作用。

图2是举例说明硼酸和EDTA对白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的作用的图。如图2所示，当硼酸和EDTA按其浮游生物MIC值(分别为1.56mg/mL和0.78mg/mL)组合时，与较高浓度的各活性剂单独相比，达到了3.67cfu/cm²的生物被膜负荷的最大log对数减少。这表示与未治疗的生物被膜对照相比，生物被膜负荷减少99.8％，并显示硼酸，尤其是当与EDTA组合时，给予抗白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的杀真菌活性。这些发现是值得注意的，基于硼酸抗浮游生物细胞的弱抑制真菌活性是完全出乎意料的，且意外地与FDA批准的抗微生物剂抗易感浮游生物病原体所报告的log杀灭率的数值相符-一般在约2-4log减少的范围内。

用硼酸与EDTA的组合抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜获得了清楚的协同作用，显示出甚至更令人印象深刻的结果。图3是以生物被膜负荷中log对数减少来说明该作用的数据图。40mg/mL浓度的硼酸与10mg/mL浓度的EDTA组合导致阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的完全根除，而这些活性剂按其低浮游生物MIC值-分别为3.125mg/mL和0.19mg/mL的组合-与未治疗的生物被膜对照比较，导致生物被膜负荷降低99.7％。形成鲜明的对比，甲硝唑活性剂对照对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜几乎没有影响，与硼酸和EDTA组合相比，差异相当显著。并且，这些发现是无先例的，基于硼酸的弱抗微生物性质和为该研究建立的这些活性剂抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值是不能预测到的。

当认为杀菌剂(例如β-内酰胺类抗生素)需要其浮游生物的MIC高达1000倍(或以上)的浓度，以有效抑制按生物被膜生长模式的易感生物时，用本发明活性剂抗假丝酵母(Candida)和加德纳菌(Gardnerella)生物被膜两者的浮游生物MIC值获得的意外的协同作用是值得注意的。这些发现支持所提出的硼酸作为生物被膜破坏剂的作用机制。

根据以下事实，结果相当值得注意：基于这些活性剂的相对弱的抗微生物活性和在该研究中首次建立的抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值，将不会预测到生物被膜破坏。

这些数据的治疗相关性在于三个方面：1)与可利用的疗法相比，抗生物被膜相关性阴道感染的出色临床效力；2)由于极低的活性剂浓度和急剧降低的局部和全身暴露风险，患者的安全性改善；和3)发展继发性感染(尤其是外阴阴道念珠菌病)的可能性低，该继发性感染常使阴道炎治疗复杂化。

比较实施例

为了比较的目的，参考以下研究：Swidsinski等，在口服甲硝唑标准治疗之后粘附的阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)生物被膜持续在阴道上皮上。Am J Obstet Gynecol 2008；198(1)：97.el-6，该研究根据标准口服甲硝唑治疗后的阴道活组织检查评价BV生物被膜特征。在该研究中，18个BV患者用甲硝唑，每日两次，口服给予500mg，治疗7天，并使用标准临床和微生物学方法评价，以证实诊断和评价临床反应。要求各患者返回，以便单个跟踪随访，在此她们进行阴道活组织检查，这允许使用荧光原位杂交技术的阴道生物被膜的直接显影。在治疗第3天或治疗完成后第7、14、21、28或35天，这6个可能的时间点之一，妇女被随机指定返回，以进行跟踪随访。

结果证明，在各时间点，基于标准的临床和微生物学方法的BV消退。然而，阴道活组织检查结果显示了不同的图像，显示核心致病性细菌，尤其是阴道加德纳氏菌(G vaginalis)和阿托波氏菌(Atopobium)，在粘附的生物被膜中持续累积，随着时间变得更加显著。尤其是，采用常规的浮游生物MIC测试，从这些妇女获得的所有阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)分离株对甲硝唑显示良好的敏感性。这可很好地解释标准BV治疗所报告的低治愈率，并将这些结果与这些介入不能有效地破坏潜在的致病性生物被膜进一步联系起来。在该比较实施例中获得的结果与在实施例中所显示的结果形成明显对比，显示用硼酸和EDTA的组合完全根除阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜，并验证了甲硝唑的最低影响。

实施例2

通过使用硼酸治疗高度顽固性、复发性BV患者

在复发性BV患者组中，进行使用硼酸的回顾性病例调查。硼酸用作抗微生物剂，作为6个月连续治疗方案的一部分。为了有资格进行方案治疗，所有妇女以前均失败于甲硝唑阴道凝胶剂的诱导和长期维持方案，并因此具有高度耐药性感染。

除硼酸之外，所使用的所有其它抗微生物剂也均被FDA批准用于BV。6个月的方案如下：

1.诱导：口服甲硝唑或替硝唑，每日两次，持续7-10天

2.硼酸治疗：每日将600mg明胶胶囊插入阴道，持续21天

3.维持：甲硝唑阴道凝胶剂，每周两次，持续5个月

在6个月结束时结果显示，临床治愈77％(24/31)的患者-即，对于用于BV的Amsel氏临床标准来说无症状和阴性。在9个月(即，在维持之后3个月)67％保持治愈。缓解的持续时间中位数是8.7个月。值得注意的是，在硼酸治疗期间没有发生治疗失败，且无患者经历二次酵母感染，或因为不良事件或对方案的任何组分不耐受而中断。

为了进一步验证这些发现，在非常顽固性BV妇女中，进行使用硼酸的预期设计的临床研究。与回顾的病例组相似，硼酸用作抗微生物剂，作为连续治疗方案的一部分；然而，在该研究中登记的妇女不同于以下病例组中的那些：在这些病例组中，她们的感染对治疗甚至更具有抗性-在登记之前的12个月内，所有的妇女均在至少三种以前的抑制性方案中失败。同样，所有患者均具有充分的感染症状，有恶臭排出物，并符合所有四种临床诊断标准(Amsel氏)，包括在阴道湿载片(mount)检查中有≥20％的线索细胞。

总共58个患者采用标准口服剂量的硝基咪唑治疗(甲硝唑或替硝唑)，进行″开放式(open label)″治疗，每日两次，持续7天，然后，每日将600mg硼酸明胶胶囊插入阴道，持续21天。然后，将确定为临床治愈的患者置于甲硝唑阴道凝胶剂的维持方案，每周两次，再持续最长达5个月。

在硝基咪唑/硼酸诱导之后，8％的低临床失败率早就显示令人印象深刻的结果。类似地，在甲硝唑凝胶剂维持时，突破性感染格外低，仅12％。如图4所示，在12、16和28周之后，在这些顽固性病例中，累积的治愈比意外地高-分别是87％、78％和65％。同样，缓解的持续时间中位数是9个月，这与在初始病例组中所记录的相似(8.7个月)。

当与用标准疗法治疗的原发性、非并发性BV妇女所报告的30％-70％短期治愈率，和在9个月内复发的高度可能性-最高达80％并列出现时，这些发现最令人印象深刻。

比较实施例

为了比较的目的，参考Sobel JD等，用0.75％甲硝唑阴道凝胶剂抑制疗法来预防再发生细菌性阴道病，Am J Obstet Gynecol 2006；194：1283-1290，该文献报告了在复发BV的妇女中，更严格的甲硝唑阴道凝胶剂对照临床研究的结果，使用与以上实施例所述相似的治疗方案，但不含硼酸。

该研究涉及10天甲硝唑阴道凝胶剂诱导期，然后是4个月、每周两次的维持方案，和3个月无治疗的跟踪期。在4个月的维持期结束时，临床治愈了74.5％(38/51)的患者。然而，在维持之后的3个月，保持治愈的概率仅为34％，且缓解的持续时间中位数为4-5个月(相对于在实施例中8.7-9个月)。在维持期期间发生的突破性感染比率是25％。这与在实施例中所报告的(低于其一半，为12％)形成了鲜明的对比。此外，在比较实施例中，59.3％的妇女在研究期间的某一点需要VVC的抗真菌治疗，而在病例组中，无妇女具有二次酵母感染¹。

实施例与比较实施例之间的差异是显著的，特别是考虑到这些患者中有许多是因为甲硝唑阴道凝胶剂的更严格的对照维持研究失败而招募的。在实施例中硼酸的相对贡献及其作用机制仍然未知，但给体外发现提供了临床支持，在该体外发现中硼酸具有治疗相关性生物被膜破坏性质，该性质由于添加EDTA而增强。在实施例中记录到的没有并发VVC可能与硼酸的抗真菌活性有关，并代表了硼酸优于目前批准的BV疗法的另一个重要优点。

¹说明：在实施例的预期部分中，将一些患者置于预防性抗真菌治疗中，这预先排除了该并发症的准确评价。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的药用组合物，所述药用组合物包含用量足以破坏所述致病性阴道生物被膜的硼酸和治疗有效量的乙二胺四乙酸(EDTA)。

2.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含生物活性剂，所述生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油和锌离子。

3.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含添加剂，所述添加剂选自胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂和生物粘附剂。

4.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含适用于阴道和/或外阴给药的药学上可接受的载体。

5.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含另外的治疗活性物质。

6.权利要求1的药用组合物，其中硼酸的量为约0.01mg-约10g。

7.权利要求1的药用组合物，其中硼酸的量为约1mg-约250mg。

8.权利要求1的药用组合物，其中EDTA的量为约0.001mg-约1g。

9.权利要求1的药用组合物，其中EDTA的量为约0.01mg-约250mg。

10.权利要求1的药用组合物，其中硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1∶1-约1000∶1。

11.一种用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，所述方法包括在无任何治疗量的乙酸存在下，将治疗有效量的硼酸给予有需要的患者。

12.权利要求11的方法，其中所述硼酸治疗感染，所述感染选自细菌感染、外阴阴道念珠菌病、毛滴虫病、病毒感染、混合感染和泌尿道感染。

13.权利要求11的方法，所述方法还包括给予生物活性剂，所述生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油和锌离子。

14.权利要求11的方法，其中将所述硼酸局部施用至阴道和/或外阴。

15.权利要求11的方法，其中所述硼酸以以下形式局部施用：乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、片剂、胶囊剂、胚珠制剂、栓剂、溶液剂、混悬剂、泡沫剂、膜或脂质体组合物，或包含在阴道环、棉塞、栓剂、海绵、枕垫、粉扑或渗透泵系统内。

16.权利要求11的方法，所述方法还包括给予治疗有效量的EDTA。

17.一种用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，所述方法包括将组合物给予有需要的患者，所述组合物包含治疗有效量的硼酸和EDTA。

18.权利要求17的方法，其中所述组合物治疗感染，所述感染选自细菌感染、外阴阴道念珠菌病、毛滴虫病、病毒感染、混合感染和泌尿道感染。

19.权利要求17的方法，所述方法还包括给予生物活性剂，所述生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油和锌离子。

20.权利要求17的方法，其中将所述硼酸局部施用至阴道和/或外阴。

21.权利要求18的方法，其中硼酸的量约为其用于感染的浮游生物MIC值，且EDTA的量约为其用于感染的浮游生物MIC值。

22.一种制品，所述制品包括包装材料和在所述包装材料内的权利要求1的药用组合物。

23.权利要求5的药用组合物，其中所述另外的治疗活性物质为5-硝基咪唑。

24.权利要求23的药用组合物，其中所述另外的治疗活性物质为甲硝唑。

25.权利要求23的药用组合物，其中所述另外的治疗活性物质为替硝唑。

26.权利要求11的方法，所述方法还包括将另外的治疗活性物质给予所述患者，所述另外的治疗活性物质选自甲硝唑和替硝唑。

27.权利要求17的方法，所述方法还包括将另外的治疗活性物质给予所述患者，所述另外的治疗活性物质选自甲硝唑和替硝唑。