焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法。所述试剂盒，其包括：PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成；所述PCR扩增引物的碱基序列为：上游引物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，所述测序引物的碱基序列为ATTGAATCCCAAGTAATC。测试方法按照下列步骤进行：提取DNA、PCR扩增、确定喷碱基顺序为CTGATCTGAC、单链分离纯化、焦磷酸测序反应和确定反应产物。采用本发明进行性别鉴别，是现有鉴定方法的有益补充。

说明书

技术领域

本发明涉及人类基因检测，特别涉及短片段序列的测序分析，具体地说是采用焦磷酸测序法检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法。

背景技术

在法医学实践中，常遇到肢解尸体、高度腐败以及白骨化尸体；在大规模灾难事故中常多人罹难，尸体外表严重毁坏，均对个人识别和性别鉴定造成一定难度。由于在这一类案件中，无法运用形态学的方法进行性别的判断，所以，应用分子生物学的方法对来自人体的生物学检材进行性别鉴定，对案件的侦破起到了重要作用。此外，在一些临床诊断中如胎儿早期诊断和考古学白骨化尸体的鉴别，也都需要区分性别。

牙釉质蛋白基因(amelogenin)，位于人类X染色体p22，编码牙釉质蛋白，并且在Y染色体中心粒附近分布与牙釉质蛋白基因的序列具有90％的同源性的基因。在这两段同源序列中，存在很多多态性位点，同时又有足够长的同源序列设计引物，即用一对引物在一个PCR反应中同时扩增X、Y染色体上的牙釉质蛋白基因，可实现性别判定。1991年，Nakahori等就已报道用牙釉质蛋白基因的一对同源引物进行性别鉴定。此外，Akane(1991)、Bailey(1992)、Sullivan(1993)等也先后都用PCR扩增单拷贝X、Y同源区域进行性别测定。目前最常用的牙釉质蛋白基因的检测方法就是Sullivan法——用同一对引物扩增X、Y同源的牙釉质蛋白基因，引物旁侧同源区内含子1有6-bp的缺失，扩增产物X染色体为106bp，Y染色体为112bp。然而该方法也有其局限性，当被检样品在牙釉质蛋白基因引物结合区存在突变，或者对于性染色体变异的个体，Sullivan法检测易导致无效扩增。而且对于一些疑难案件的高度降解检材而言，该方法的片段长度还是稍显过长以至于不能做出正确的判型。大量研究表明，高度降解DNA检材的检测成功率随PCR扩增产物片段缩短而增高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对常规分型失败的性别鉴定，提供一种焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法，使检测DNA的片段缩短至44/45bp，并且包含3个突变位点和一个插入缺失位点，提高对高度降解DNA分型的成功率。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒，其包括：PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成；所述PCR扩增引物的碱基序列为：上游引物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，所述测序引物的碱基序列为ATTGAATCCCAAGTAATC，所述下游引物标记生物素。

利用上述试剂盒进行性别鉴定的测试方法，按照下述步骤进行：

a)提取DNA，得DNA提取液；

b)PCR扩增

在PCR扩增体系中加入步骤a)中得到的DNA提取液进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、15s，50℃、30s，72℃、15s，进行45个循环；再在72℃保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；

c)确定喷碱基顺序为CTGATCTGAC；

d)单链分离纯化

将步骤b)所得的扩增产物加入结合缓冲溶液和含有偶链亲和素的磁珠，在常温下孵育20min；然后将扩增产物分别在体积比为70％酒精洗涤5秒、变性缓冲液中变性15秒、洗涤缓冲液中洗涤15秒，上述扩增产物变为单链DNA模板，再将所述单链DNA模板转入含有测序引物的退火缓冲溶液中，在80℃杂交3min，冷却至室温，得分离纯化后的单链DNA模板；

e)焦磷酸测序反应

准备好焦磷酸测序反应所用的酶混合物、底物混合物及dNTP，加入试剂舱，将步骤d)中所得的分离纯化后的单链DNA模板放入焦磷酸测序仪，按照步骤c)中设计的喷碱基顺序进行焦磷酸测序反应；

f)确定反应产物

仪器自动对测序结果进行判读，根据测序图谱及结果获得性别信息。

按照上述步骤生成的靶序列分别为：

靶序列X：ATTGAATCCCAAGTAATCGGT-GCCTATCATTGGCTATTCTAGTC；

或靶序列Y：ATTGAATCCCAAGTAATCTGACGACTATCATTGGCTATTCTAGTC。

其相关信息为：X染色体上AMELX的Genbank号为NG_012040，位于11637-11686；Y染色体上AMELY的Genbank号为NG_008011，位于12395-12445。所述靶序列的选择标准：(1)小于50bp；(2)有足够长的同源序列设计引物，即上下游同源区大于18bp；(3)多个点突变和插入缺失位点共同存在；(4)适合设计PCR扩增引物及测序引物。

上述的方法和试剂盒可以用于分析来自人类的血液、骨骼、毛发、肌肉或者组织器官的DNA样品。

下面采用上述方法对100份已知性别的健康无关个体样本(男女各50份)，进行测序分析，验证该方法的准确性：按照常规方法提取100份个体的血液样本，用本发明设计的引物进行扩增，再应用焦磷酸测序技术对扩增产物进行测序，从测序图即可直接判型。

检测结果参见图1-1、图1-2，从图1-1和图1-2的测序结果可看出，AMELX的特异序列为：GGTGC，AMELY的特异序列为：TGACGA；二者的差异为：3个点突变位点——G/T，T/A，C/A，和一个插入缺失位点——…/C。因此，女性(XX)的测序结果为：G/G、T/T、…/…、C/C(参见图1-1)，男性(XY)的测序结果为：G/T、T/A、…/C、C/A(参见图1-2)；图1-1和图1-2分别与图2-1和2-2测序软件设计的预期模型一致。对这100份已知性别DNA样本进行测序，均得到正确的分型，分型成功率为100％。

采用上述方法可对高度降解的检材进行准确分型，完成对不同个体的性别鉴定。下面通过试验数据来说明本发明的优势。

对比试验1

按照常规方法提取8份室外自然条件下放置26周腐败降解的血液样本的DNA，然后分别采用Ampf/STR Identifiler试剂盒和本发明的试剂盒对提取的DNA进行牙釉质蛋白基因的检测。采用本发明的试剂盒和检测方法，8份样本均可正确分型，检测结果参见图3-1a和图3-1b；而采用Ampf/STR Identifiler试剂盒其中有2份样本无法分型，参见图3-2a和图3-2b。

比对试验2

用DNase I制备9个不同时间点(5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min和45min)的人工降解DNA，然后分别采用Ampf/STR Identifiler试剂盒的方法和本发明的试剂盒和方法对人工降解DNA进行牙釉质蛋白基因的检测。

采用本发明的试剂盒和方法的检测结果见图4-1～图4-10，其中图4-1为对比图谱；可以看出，对酶消化5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min和40min的DNA，本发明建立的方法均可对降解DNA进行正确分型，对酶消化45min的DNA，该方法检测未得到产物峰。采用AmpF/STR Identifiler试剂盒的检测结果参见图5-1～图5-10，其中图5-1为对比图谱；可以看出，牙釉质蛋白基因区域仅在酶消化5min和10min的DNA样本有相对荧光单位(Rfu)较低的峰，而且对酶消化15min及以上的DNA均无产物峰。

本发明的方法还有比较好的人类种属特异性，下面通过试验数据来说明。

对所取得的非人类样本，包括大肠杆菌、肠球菌、念珠菌、恒河猴、狗、猪、鸡、牛、兔、鱼，用本方法进行检测。

检测结果见图6-1～图6-10，可看出只有猴在该片段有产物峰，其余样本均没有扩增产物，表明该方法具有较好的人类种属特异性。分析猴的测序结果，发现其既不同于人类男性测序结果，也不同于人类女性测序结果，人类女性(XX)的测序结果为：G/G、T/T、…/…、C/C，男性(XY)的测序结果为：G/T、T/A、…/C、C/A，而猴的测序结果为G/T、T/A、…/C、C/？。应用BLAST比对人类与猴牙釉质蛋白基因核苷酸序列的差异，发现在本实验测序的片段，猴AMELY的序列为TGACGT，与人类AMELY的序列TGACGA仅最后一个碱基不同；猴与人类的AMELX在该段序列均为GGT-GC。据此，可确定本实验中被检猴为雄性，其测序结果与人类男性存在差异，表现在最后一个SNP位点：人类为C/A，猴为C/T。该结果提示，对于雄性个体，应用该方法可区分灵长类与人类DNA。

采用上述方法还可对骨骼样本进行准确分型，完成对不同个体的性别鉴定。下面通过试验数据来说明。

提取5份骨骼检材的DNA，用本方法设计的引物进行扩增，再应用焦磷酸测序技术对扩增产物进行测序，从测序图中即可直接判型。检测结果参见图7-1～图7-5，可以直接看出这5份骨骼样本均能得到清晰的分型结果。

采用本发明有益效果在于：采用本方法对高度降解检材进行检测，其鉴别能力、灵敏度、扩增特异性、准确性、稳定性等方面能满足法医DNA检验实际工作的要求，是现有鉴定方法有益的补充；且其成本低、性能好，由于该方法的高通量更适合应用于大规模灾难事件和法医学群体调查的研究，可广泛用于陈旧骨骼、牙齿、腐败的肌肉、组织等DNA高度降解的检材，以及痕量血痕、指(趾)甲、毛发等低含量DNA检材的性别检测。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1-1和图1-2分别是本发明检测的标准女性和标准男性样品的测序结果；

图2-1和2-2分别是本发明设立的女性和男性的测序模型；

图3-1a和图3-1b是采用本发明的试剂盒对室外自然条件下放置26周的腐败降解的血液样本DNA牙釉质蛋白基因的测序结果；

图3-2a和图3-2b是采用Ampf/STR Identifiler试剂盒对室外自然条件下放置26周的腐败降解的血液样本DNA牙釉质蛋白基因的测序结果；

图4-1～图4-10为采用本发明的试剂盒和方法对DNase I消化9个不同时间点的样本进行牙釉质蛋白基因检测的分型结果；

图5-1～图5-10为采用Ampf/STR Identifiler试剂盒对DNase I消化9个不同时间点的样本进行牙釉质蛋白基因检测的分型结果；

图6-1～图6-10分别为采用本发明的方法对念珠菌、大肠杆菌、肠球菌、鸡、猪、兔、狗、恒河猴、牛、鱼的牙釉质蛋白检测的分型结果；

图7-1～图7-5为采用本发明的方法对5份骨骼DNA牙釉质蛋白基因的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒，其包括：PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成；所述PCR扩增引物的碱基序列为：上游引物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，所述测序引物的碱基序列为ATTGAATCCCAAGTAATC，所述下游引物标记生物素。

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例一

将8份新鲜血液标本分别放置于抗凝管中密闭保存，置于室外自然条件(6月-11月)下放置26周，模拟制备成自然腐败降解检材为例，说明应用焦磷酸测序法检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的方法的应用

a)提取DNA

步骤如下：

1)取适量血痕检材置1.5ml Eppendorf管中；

2)加入1ml无菌水浸泡，室温浸泡15-30min；

3)13000rpm离心3min，去上清液，留100μL液体；

4)加入100μL 10％Chelex-100；

5)56℃保温30min，剧烈振荡10s；

6)100℃保温8min，剧烈振荡10s；

7)13000rpm离心3min，得首次DNA提取液；

8)在首次DNA提取液里直接加入200μL 10％Chelex-100混匀；

9)56℃保温30min，剧烈振荡10s；

10)100℃保温8min，剧烈振荡10s；

11)13000rpm离心3min，得二次DNA提取液，分别用于PCR扩增。

b)PCR扩增

本实施例采用PCR进行扩增(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。扩增体系见表1。

表1PCR扩增的组分、浓度和含量

  组分名称  浓度  含量  10×PCR缓冲溶液  -  4.0μL  PCR扩增引物  10μmol/L  0.8μL  Taq DNA聚合酶  1U/μL  1.2μL  d NTP  10mmol/L  0.8μL  模板DNA  -  2.0μL  MgCl₂  25mmol/L  2.4μL

扩增体系还包括去离子水，其总体积为40μL。

所述PCR扩增引物的碱基序列：上游引物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，其中下游扩增引物标记生物素。引物由上海生工生物技术有限公司合成，上游引物均采用的PAGE纯化的方法，下游标记生物素的引物则采用反向高压液相层析(HPLC)纯化的方法。

PCR扩增步骤：

在ABI 9700PCR扩增仪中进行扩增，热循环参数：95℃、5min预变性；然后在95℃、15s，50℃、30s，72℃、15s，共进行45个循环；72℃，保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物。

在进行焦磷酸反应之前，需要用凝胶电泳进行简单验证。通常情况下，只需要进行琼脂糖凝胶电泳即可，但是本实验的PCR产物只有45bp，用琼脂糖凝胶电泳不能得到较清晰的条带。故本实验在测序之前大部分选择用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证。如果电泳结果得到较清晰的目的条带，且非特异性条带较少不影响测序，即可进行焦磷酸测序反应。

随后进行焦磷酸反应。

c)喷碱基顺序(Dispensation order)

在进行测序之前，需要先获得Dispensation order。打开PyroMark ID软件，点击Simplex Entries，将引物设计软件中所保存的本实验的引物目录引入，程序即可自动生成一个Dispensation order和预期的焦磷酸序列图(Pyrogram)。然后根据本实验的需要简单调整后所得Dispensation order为：CTGATCTGAC。确定喷碱基顺序为CTGATCTGAC；

d)单链分离纯化

首先取扩增产物30μL，加入33μL洗涤结合缓冲液(binding buffer)和2μl含有偶链亲和素(avidin)的磁珠(beads)，在常温下孵育20分钟，使得beads与生物素结合。被固定在磁珠上的PCR扩增产物分别在180mL的70％(体积比)酒精中洗涤5秒、120mL的变性缓冲液(Denaturation buffer，0.2mol/L NaOH)中变性15秒、180mL的1×洗涤液(Washing Buffer，10mM Tris-Acetate)中洗涤15秒，使之变成单链DNA模板。将单链DNA模板转入29μL含1.5μL测序引物(10μmol/L)的退火缓冲溶液(Annealing buffer)中，80℃杂交3min，冷却至室温，得分离纯化后的单链DNA模板，然后即可进行焦磷酸测序反应，其中所述测序引物为ATTGAATCCCAAGTAATC。

e)焦磷酸反应

打开PyroMark ID软件，点击SNP主菜单区下的SNP Runs，点击鼠标右键选择New SNP Run，输入Run Name等反应的信息，选择反应孔。随后切换到设计界面，选择合适的Entry，输入样本信息等。在View菜单中点击run，即可显示本次实验要用到的酶混合物、底物混合物和各种dNTPs的具体用量。将酶混合物，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物混合物APS和荧光素溶于650μL无核酶水中。将酶混合物、底物混合物各3.6μl与1.8μl Annealing Buffer的混合物加入反应孔中，且将四类核苷酸(A、T、C、G)按照系统显示的量分别加入试剂舱固定位置，在软件界面点击运行键Run即可进行测序。

f)确定反应产物

仪器自动对测序结果进行判读，根据测序图谱及结果获得性别信息。

对在室外自然条件下放置26周腐败降解的血液样本的DNA进行测序，参看附图3-1a和图3-1b。可以看出，采用本发明建立的方法，能够对高度降解的血液样本很好地进行分型，能够实现性别鉴定。

实施例二

本实施例以DNase I人工降解9个不同时间点(5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min和45min)后DNA为检材进行测序。

DNA的提取步骤：

1)取25μg DNA，10×DNase I反应缓冲液100μL加蒸馏水配成275μL的体系，移出10μL作空白对照，在剩余的265μL中加入2.5μL DNase I(1U/μL)。

2)将其放置在25℃条件下进行消化，消化至5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min时，于每个时间点移出30μL样本，在移出的样本中加入2μL 25mM的EDTA，70℃孵育15min，终止DNaseI的作用。

3)取10μ样本，分别进行琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸测序技术检测牙釉质蛋白基因。

PCR扩增、焦磷酸反应和检测步骤同实施例一。分型结果参见图4-2～图4-10，采用本发明能够DNase I人工降解的DNA很好地进行分型，完成对个体的识别。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用高通量的焦磷酸测序技术对高度降解的检材能够准确、稳定分型，能够满足法医DNA检验实际工作的要求，可以对每一个个体进行准确的性别鉴定，是现有性别鉴定方法的有益的补充。