一种发酵法去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法、一种饲用发酵棉菜粕蛋白原料及其应用

摘要

本发明公开了一种发酵法去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法、一种饲用发酵棉菜粕蛋白原料及其应用。是将棉粕、菜粕混合后，先加入料水和复合酶制剂，再接种能产蛋白酶菌或/和产乳酸菌及分解硫代葡萄糖甙或/和棉酚的微生物菌种，然后进行发酵得到处理后得到的棉菜粕，从而得到无毒高营养饲用发酵棉菜粕蛋白原料，并将其作为蛋白原料组分按15％的添加比例形成棉菜粕动物饲料。本发明利用现代生物技术解决了棉菜粕利用率低，在饲料中添加量少及存在有毒物质的危害等问题，缓解我国饲料蛋白质资源的不足。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种发酵法去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法，以及优质无毒的饲用发酵棉菜粕蛋白原料。

背景技术

据专家预测，2030年我国人口达到最高峰16亿时，粮食的总需求量为7.43亿吨，超过目前生产能力的50％。同时耕地面积进一步缩小，大约只有现在的80％。虽然有关专家指出，通过增加复种指数和利用科学技术提高单产，我国粮食产量在2030年可望达到7.1亿吨，但这仍存有明显变数。到2010年、2020年、2030年，我国粮食原粮需求的38％、43％、50％将用作饲料。可以说，21世纪中国的粮食问题，实际上是解决养殖业所需的饲料粮问题。

我国饲料的发展与饲料资源尤其是蛋白质资源不足的矛盾

畜牧业生产总成本的60-80％来自饲料，饲料工业是畜牧业的重要环节和基础。我国饲料工业在全国统计的38个工业行业中排名第23位，成为了国民经济中新的重要基础产业。2009年我国饲料工业总产量突破1.4亿吨大关，仅次于美国，为世界第二大饲料生产国。“十一五”期间我国将迎来国民经济增长的黄金时期，国家将继续大力发展饲料工业，努力开发饲料资源、增加饲料产量、提高饲料转化效率，推进畜牧业经济又好又快发展。

当前影响我国畜牧业发展速度和质量的一个重要因素是饲料原料总量不足。饲料工业的主要原料为谷物原料(占60％)、蛋白质原料(占30％)和添加剂等。由于我国人多地少的国情，粮食、经济与饲料作物三元种植结构不平衡矛盾长期以来无法得到有效解决，原料供应成为饲料工业发展的瓶颈，尤其是蛋白质饲料原料不足，现在是、将来也是限制我国饲料工业发展的最重要因素。

目前，我国饲料工业使用的蛋白类原料主要包括植物蛋白、动物蛋白和微生物蛋白三大类。植物蛋白类原料主要是各类饼、粕等，干物质中粗蛋白≥20％，粗纤维≤18％，豆粕是目前用量最大的植物蛋白原料；动物蛋白类原料主要有鱼粉、乳清粉、血粉、肉骨粉、蹄甲羽毛粉等，由于生物安全问题，血粉、肉骨粉等已很少在饲料中添加；微生物蛋白是指酵母、藻类等单细胞发酵产物。2005年我国蛋白类饲料原料缺口达1000万吨左右，据专家预测，到2010年-2020年，我国蛋白类饲料原料缺口将达2400万吨-4800万吨。饲料生产企业不得不耗费大量外汇进口国外鱼粉、大豆等蛋白类原料。据海关统计，2009年我国进口大豆4255万吨，比上年增长13.7％；

配合饲料的生产成本居高不下，大批进口造成国际市场价格的不断攀升使国内饲料生产企业处于亏损的边缘。因此，必须加速非常规蛋白资源的开发与利用，降低对国际市场的依赖度。从我国目前实际情况看，豆粕紧俏，而棉菜籽饼粕利用率却不高，棉菜籽饼粕作为一种理想的、新的蛋白资源开发潜力巨大。

我国棉菜粕资源及饲料应用存在的问题

棉粕是棉籽提取油脂后的产品，棉籽中含棉仁约50-55％，棉仁中含粗脂肪30-35％，粗蛋白35-38％，提油后的棉粕中含有丰富的蛋白质。由于一般油脂加工厂加工棉籽主要目的是提炼棉油，棉粕是其副产品，普通棉粕含有棉酚等有毒物质，可造成动物生长受阻、生产能力下降、贫血、呼吸困难、繁殖能力下降甚至不育，严重时可造成死亡。因此，棉籽饼(粕)在饲料中的添加量很小，一般为3％～4％，不少地方把棉籽饼粕当作肥料还田。但是，棉粕中粗蛋白含量较高，接近豆粕，达到39-43％，作为一种潜在的蛋白资源，我们的认识还有待进一步提高。我国是世界上主要产棉大国，国家统计局《2007年国民经济和社会发展统计公报》显示，2007年全国棉花种植面积559万公顷(8381万亩)，棉花总产760万吨，棉籽总产量1300多万吨。目前我国棉籽作为饲料原料的利用率不足15％，与此形成对照的是我国饲料蛋白原料严重不足，制约着畜牧业生产的发展。棉籽出粕率50％，如果全国的棉籽资源得到充分利用，每年可得到约550万吨棉粕，可替代豆粕和鱼粉，缓解我国饲料蛋白原料的供需矛盾。

油菜是我国最重要的油料作物，年均种植面积1.1亿～1.2亿亩，总产1000万吨左右，均居世界首位。油菜籽榨油后约有60％的菜籽饼粕，我国每年菜籽饼粕产量高达600多万吨。

菜籽饼粕蛋白质含量在35％～45％左右，其中可消化的蛋白质占粗蛋白的百分比却较低。菜籽蛋白质含有大量必需氨基酸和含硫氨基酸，组成的特点是含硫氨基酸含量高，碱性氨基酸含量亦高，而精氨酸含量低，氨基酸组成基本合理，与国际卫生组织、国际粮农组织所推荐的最佳氨基酸比例十分接近。菜粕中还含有较丰富的钙、磷、镁、硒等矿物元素和多种维生素，营养价值极高。

菜粕中含有多种微量元素，每千克粕中，含铁180mg，铜6.6mg，锰4.3mg，硒0.98mg，硒的含量是常用植物饲料中最高的，硒在体内呈一种水溶性抗氧化物质状态，具有防止机能衰老的功能。菜粕中，还含有多种维生素。每千克饼粕含VB1 1.7mg，VB23.6mg，烟酸1500mg，泛酸86mg，胆碱630mg。胆碱可防止脑细胞衰老，可增强智力。

但菜粕中含有纤维素、硫葡萄糖甙(简称硫甙)、植酸、单宁、芥子碱等抗营养因子，其中主要是纤维素和硫甙。硫甙本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、恶唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥子碱阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。另外，菜籽蛋白在榨油的过程中，蛋白质，特别是赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸受到一定程度破坏，不仅含量降低，更严重的是它和其他物质结合，可降解成新的抗营养因子，使菜籽榨油后的饼粕作饲用时，受到限制，在饲料中的添加比例在5％左右。

棉菜粕主要营养特点

棉菜粕的蛋白质含量为35％-45％，是高蛋白质含量的植物性原料，氨基酸种类比较全面，但组成比例不太理想，动物必需的一些氨基酸含量偏低，但两者有一定的互补性。棉菜粕氨基酸含量及与豆粕的比较见表1。

棉籽饼、粕蛋白质氨基酸组成不太理想，精氨酸含量高达3.6％-3.8％，而赖氨酸含量仅有1.5％-1.9％，只有大豆饼、粕的三分之二。蛋氨酸、色氨基酸也不足，约0.4％。同时，赖氨酸的利用率较差。

菜籽蛋白氨基酸组成也有一定的缺陷，赖氨酸、精氨酸和色氨酸含量偏低，但含硫的胱氨酸和蛋氨酸含量分别为2.02％、1.6％，而大豆蛋白分别为1.4％、1.3％，菜籽蛋白明显高于大豆蛋白。

表1  大豆饼粕与棉菜粕氨基酸含量的比较

  饲料名称  大豆饼  大豆粕  棉籽粕  棉籽粕  菜籽粕  干物质  89.0  89.0  90.0  88.0  88.0  粗蛋白质  41.8  44.2  43.5  36.3  38.6  精氨酸  2.53  3.38  4.65  3.94  1.83  组氨酸  1.10  1.17  1.19  0.90  0.86  异亮氨酸  1.57  1.99  1.29  1.16  1.29  亮氨酸  2.75  3.35  2.47  2.07  2.34  赖氨酸  2.43  2.68  1.97  1.40  1.30  蛋氨酸  0.60  0.59  0.58  0.41  0.63  胱氨酸  0.62  0.65  0.68  0.70  0.87  苯丙氨酸  1.79  2.21  2.28  1.88  1.45  酪氨酸  1.53  1.47  1.05  0.95  0.97  苏氨酸  1.44  1.71  1.25  1.14  1.49  色氨酸  0.64  0.57  0.51  0.39  0.42  缬氨酸  1.70  2.09  1.91  1.51  1.62

菜粕中毒物和抗营养物质的结构和作用机理

菜粕中含有纤维素、硫葡萄糖甙(简称硫甙)、植酸、单宁、芥子碱等抗营养因子，其中主要是纤维素和硫甙。硫甙本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、恶唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥子碱阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。

纤维素

纤维素是菜粕中的一种主要成分，菜粕中的纤维成分包括纤维素、半纤维素、木质素及较大量的戊聚糖和果胶，含量达10％以上。双低菜粕中的高纤维主要来自壳中，壳占双低菜籽的16％，占菜籽粕的25％～30％。双低菜粕中含有8％～10％蔗糖，2％～3％寡聚糖，20％～30％非淀粉多糖(NSP)和5％～8％的木质素、多酚类物质。降低菜粕中的纤维，是提高双低菜粕中氨基酸消化率的重要手段。由于双低菜粕中纤维对单胃动物营养物质消化率和利用率的显著影响，纤维被认为是双低菜粕中最重要的抗营养因子。同时，纤维还影响铜、锌、镁等矿物元素的利用率。

硫葡萄糖甙及其降解产物

油菜中的硫葡萄糖甙或称硫葡萄糖苷(thioglucoside，glucosinolate)，简称硫甙或硫苷，是由非糖部分和葡萄糖部分通过硫苷键联结起来的，常以钾盐形式存在，它本身并无抗营养作用，但在加工过程中，自身的内源酶(芥子酶)使之水解为苷元和葡萄糖，而苷元极不稳定，可迅速降解为恶唑烷硫酮(oxazolidinethio，简写为OZT)、异硫氰酸酯(isothiocyanate，简写为ITC)等有毒物质。一般认为，硫甙的抗营养作用是由两方面引起的，一是完整硫甙在盲肠以前的消化道直接被吸收，二是硫甙在微生物作用下降解后被吸收。硫甙的分解产物OZT和ITC是重要的有毒产物，与碘的吸收利用有关，会导致甲状腺肿大。OZT被称为致甲状腺肿素，ITC则会严重影响饲料适口性，同时也会对消化系统表面有破坏作用。

硫甙的酶解方式在含硫甙的植物中，都含有该糖甙伴存的酶，成为硫葡萄糖甙酶，它有4种同功酶F-IA，F-IB，F-IIA，F-IIB，其最适作用的pH为7.0。硫甙在酶的催化下水解为葡萄糖和不稳定的非糖基部分，并随pH值的不同或在某些催化剂的作用下，形成不同的降解产物。分解方程式如下：

除了植物体内的内源硫甙酶可以酶解硫甙外，某些肠道细菌的酶系统也显示出硫甙酶的相同活性。另外，某些真菌也具有水解硫甙的能力。

芥子碱及其降解产物

菜籽饼粕中含有约1％～1.5％的芥子碱(Sinapin)。芥子碱为4-羟基-3，5-二甲氧基苯丙烯胆碱，分子式为C16H2506N，相对分子量为327。它能溶于水，不稳定，容易发生非酶催化水解反应，生成芥子酸(Sinapic acid)和胆碱(Choline)。芥子碱有苦味，是引起菜籽粕适口性不良的主要因素，还会降低菜籽蛋白的利用率。

单宁、植酸和酚类

单宁是络合的多酚类化合物，相对分子质量由500到6000之间。菜籽种皮中单宁含量最高，单宁能与蛋白质络合，改变天然蛋白质的性质。单宁或酚酸除了容易与蛋白质结合，还能与蛋氨酸结合，会降低蛋白质的营养价值。菜子粕中有0.3-1％的单宁，不仅使粕的适口性变差，而且影响蛋白质的消化吸收。单宁主要抑制植酸酶、转氨酶、乳酸脱氢酶的活性。

植酸在菜粕中含量是2％～4％，它是强的金属络合剂，能与多种金属离子螯合。植酸可与蛋白质结合成复合物，或与蛋白质、金属离子形成三元复合物，使蛋白质和金属元素的有效利用率降低，从而大大降低其利用价值。植酸无论与哪种营养素结合，都会使被络合物质难被动物消化吸收。当饲料中植酸含量较高时易造成禽畜缺锌、铜、钙等无机元素。在饲料中添加多量菜粕会在动物体内产生毒性，主要表现为厌食、消瘦、呆滞、皮毛粗糙等。

菜粕中含有约2％～4％的酚类物质，其中大部分是小分子的酚类物质(芥子碱)，其余为多酚类物质。由于酚类物质具有刺激性气味和苦涩味，用作饲料时会影响适口性。酚类物质是抗营养物质，能与蛋白质形成致密的鞣质，还能与蛋白质、金属元素结合形成三元复合物，影响动物对蛋白质和微量元素的吸收，降低蛋白质和金属元素的有效利用率。酚类物质在中性和碱性条件下很容易发生氧化和聚合作用，使饼粕变黑，如果制成的菜籽蛋白中其含量高，也会造成蛋白颜色发暗，影响蛋白的利用。

棉粕中抗营养因子的结构与作用机理

棉酚及其衍生物

棉酚的分子式如下所示：

棉酚(gossypol)，俗称棉毒素，是锦葵科棉属植物色素腺体产生的多酚二萘衍生物，分子式为C₃₀H₃₀O₈，分子量518.5，有三种异构体。棉酚存在于棉花的根、茎、叶和籽实中，属于棉籽色素腺体中的一种黄色色素，是含有6个羟基的多环醛(Benedict et al.，2006)。

棉酚及其衍生物占色素腺体质量的20.6％-39.0％。棉酚易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂，不溶于低沸点的石油醚和水，其在不同的溶剂中所得晶体的熔点均不同。棉酚含量约占棉粕干物质量的0.03％-2.0％，并以结合棉酚(bound gossypol，BG)和游离棉酚(free gossypol，FG)两种状态存在。通常将棉酚和氨基酸或其他物质的结合物称作结合棉酚，把具有活性羟基和活性醛基的棉酚称作游离棉酚。游离棉酚分子结构中的活性基团(醛基与羧基)对动物毒性较大。结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，毒性很小。一般情况下游离棉酚约占棉仁干重的0.85％，结合棉酚约占棉仁干重的0.15％左右。

尽管棉酚毒性作用的机制还没有彻底弄清楚，但借助现代生物学技术的研究表明，棉酚通过对膜基质及蛋白质分子的结合，以及通过负离子自由基机制对膜相结构的破坏和对电子传递体系的干扰，从多方面干扰细胞的代谢，尤其是与Ca²⁺依赖性蛋白激酶有关的代谢。

棉酚主要由其活性醛基和活性羟基产生毒性及引起多种危害。大部分棉酚被家畜摄入后，在消化道中形成结合物直接排出，只有小部分被吸收。游离棉酚的排泄比较缓慢，在体内有明显的蓄积作用，因此，长期采食棉籽饼会引起慢性中毒。游离棉酚对动物的危害作用主要表现在：(1)对动物细胞、血管和神经造成危害：游离棉酚进入消化道后，可刺激胃肠黏膜，引起胃肠炎。吸收入血液后，可增强血管壁的通透性，促使血浆和血细胞向周围组织渗透，使受害组织发生浆液性浸润、出血性炎症和体腔积液。游离棉酚易溶于脂质，能在神经细胞中积累而使神经系统的机能发生紊乱。(2)干扰动物体正常的生理机能：游离棉酚在体内可与许多功能性蛋白和一些重要的酶结合，使其丧失活性。游离棉酚还可与铁结合，干扰血红蛋白的合成，引起缺铁性贫血。(3)对雄性动物的生殖机能造成影响：游离棉酚能破坏睾丸的生精上皮，导致精子畸形、死亡甚至无精子。因此，游离棉酚可降低繁殖力，甚至造成公畜性不育。(4)影响鸡蛋品质：产蛋鸡饲喂棉籽饼粕时，产出的蛋经过一定时间的贮藏后，蛋黄中的铁离子与游离棉酚结合，形成黄绿色或红褐色的复合物。当饲粮中游离棉酚的含量达50mg/kg时，蛋黄就会变色。(5)影响氨基酸的效能：在棉籽榨油过程中，由于受湿热的作用，游离棉酚的活性醛基可与棉籽饼粕中的赖氨酸结合，发生美拉德反应，大大降低了棉籽饼中赖氨酸的可利用率。

而牛、羊等反刍动物，却对游离棉酚有较大的耐受能力，Reize等研究了反刍动物对棉酚的解毒机理，认为这是由于其胃中的微生物和酶的作用，使棉酚破坏并随着纤维素而水解，最后转入真胃中，从而产生所谓的棉酚耐受性。

GB13078-91规定了游离棉酚在各种饲料中的安全使用限量(如表2所示)。

表2  游离棉酚的允许量

棉粕中的其它抗营养因子

除游离棉酚外，棉粕中的主要抗营养因子还有：环丙烯脂肪酸(CPFA)、植酸(phytic acid)、单宁(tannin)、非淀粉多糖(non-starchpolysaccharine，NSP)及各类不溶于水的低聚糖。

环丙烯脂肪酸(CPFA)主要有两种：苹婆酸(Sterculic acid)和锦葵酸(malvalicacid)(张继东等，2006)。它主要对禽类的蛋品质及生理产生不良影响：母鸡摄入环丙烯脂肪酸后，可以降低该母鸡的繁殖力以及产蛋性能。环丙烯类脂肪酸还可改变脂肪的代谢和脂肪酸组成，引起肝细胞坏死，不正常的糖原沉积，胆管增生及纤维化等病理反应。

植酸(phytic acid)又称肌醇六磷酸，广泛存在于植物体中，它是植物性饲料中有机磷的主要存在形式，在棉粕中的含量约为2.9％-4.8％(张继东等，《棉籽饼粕中天然抗营养因子的危害机理及消除措施》，畜牧与饲料科学，2006，27卷第3期，P53-55)。棉粕中的磷酸大多以植酸形式存在，使得畜禽的饲料中大量的植酸磷因不能被利用而从粪便中排出，造成土壤和水源环境的污染。植酸的存在降低了棉粕中微量矿物质与蛋白质的营养效价(Cheryan，《Fate of Phytic Acid in ProducingSoy Protein Ingredients》，Journal of the American Oil Chemists’Society，2007，84(4)：369-376)，影响机体的正常代谢与生殖能力。

单宁(tannin)又称鞣酸，在棉粕中含量平均为0.3％。它干扰蛋白质的利用，在畜禽体内可与蛋白质形成难以利用的络合物，影响饲料的适口性，使饲料产生涩味(吕忠进，1992)。单宁还可阻止钙的吸收，引起蛋白质消化酶、脂肪酶和淀粉酶的失活，以至于影响动物的生长和食物的转化。

非淀粉多糖(non-starchpolysaccharine，NSP)是植物源蛋白中普遍存在的一类抗营养因子。棉粕中的非淀粉多糖主要包括纤维素、半纤维素、果胶等。非淀粉多糖是植物细胞壁的主要成分，导致饲料营养物质无法释放，从而降低了动物对饲料营养物质的利用率。

低聚糖类物质广泛存在于各种植物性饲料中，棉粕中的低聚糖主要是棉籽糖和水苏糖，含量分别约为6.91％和2.36％。这类低聚糖物质不溶于水，所以它不能被单胃家畜消化吸收；增加了小肠内容物的渗透性和液体的保持力，因而减少了营养物质的水解作用；同时由于营养物质水解作用的减弱，增加了小肠内容物的含量，刺激小肠蠕动反射，因而增加了肠道内饲料运转速度，影响了动物对营养物质的充分吸收。

棉菜粕中的营养成分包括有：35～45％的蛋白质，1～3％的脂肪，10～15％的碳水化合物，还有多种矿物质、维生素及动物体内必需的氨基酸，营养成分比较齐，是重要的植物性蛋白饲料源。如上所述，棉菜粕在营养的平衡上、尤其是氨基酸平衡方面各自存在一定缺陷，且含有对动物有毒有害的物质以及存在多种抗营养因子，主要是：纤维素、硫葡萄糖甙(简称硫甙)、植酸、单宁、芥子碱、棉酚、、环丙烯脂肪酸等抗营养因子，他们的存在，一方面对动物体内某些消化酶起抑制作用或与营养物质络合成不易消化的成分等，使得豆粕的消化率和动物的吸收率下降。另一方面，对动物体内的某些器官起破化作用，对动物的生理、生长、健康造成不良影响。

针对我国饲料资源严重短缺的现状，在明确我国饲料资源存量基础上，发展和集成我国常规能量、蛋白质饲料资源替代技术和非常规饲料资源开发利用的关键技术成果，建立我国新型饲料资源开发与产业化的技术体系，提高我国常规和非常规饲料资源的开发利用水平，增加饲料原料供给，以缓解我国饲料资源短缺是我国饲料业发展的重要战略，也是今后饲料行业的主要工作任务。

发明内容

为能很好的利用现有资源，本发明的目的之一是提供一种去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法。

本发明发酵法去除棉菜粕毒物和提高营养价值的方法，是将棉粕和菜粕混合后，先加入水和复合酶制剂，再接种能产蛋白酶菌或/和产乳酸菌及分解硫代葡萄糖甙或/和棉酚的微生物菌种，然后进行发酵得到发酵产物。

其中，所述复合酶制剂是同时含有高活性纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶的饲用或食用复合酶制剂，添加比例为混合原料(干重)的0.1～10％。

复合酶制剂A组成：按重量纤维素酶30％、木聚糖酶25％、葡聚糖酶25％、蛋白酶20％；复合酶制剂B组成：按重量木聚糖酶30％、葡聚糖酶30％、淀粉酶20％、蛋白酶20％。

其中，所述微生物菌种选自酵母菌、乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌中的单株菌种或其组合，所接种菌种量按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量(干重)的百分比为0.5～100％。

所述微生物菌种优选为多种菌种的组合，所接种的菌种按含有菌种的培养基(培养液)重量占棉菜粕原料重量(干重)的百分计，分别为酵母菌0.5～50％，乳酸杆菌1～50％，地衣芽孢杆菌0.5～50％，沼泽红假单胞菌1～50％。

所述发酵温度为30℃～55℃。

所述棉粕和菜粕混合重量比为9∶1～1∶9。

混合棉菜粕与水的重量份数比为1∶0.2～1.5。

具体的，上述方法包括如下步骤：

1)将棉粕、菜粕按重量比9∶1-1∶9混合成原料加入发酵罐；

2)按重量比1∶0.2～1.5在棉菜粕混合原料中加入水，然后按混合原料的0.1～10wt％比例加入复合酶；

3)将带培养基的菌种加入发酵罐；

4)控温发酵：发酵温度为30～55℃，发酵时间为45～84小时，得到发酵产物。

发明另一目的在于提供一种饲用发酵棉菜粕蛋白原料及其应用。

该饲用发酵棉菜粕蛋白原料是由上述方法制备得到的发酵产物，其中粗蛋白含量达到42％以上，硫甙、棉酚、芥子碱和环丙烯脂肪酸等有毒有害物质的降解或去除率可达到50％以上，植酸降解率达到100％完全去除。

该棉菜粕蛋白原料是通过多菌株混合发酵技术，消除了棉粕和菜粕中棉酚、植酸、环丙烯脂肪酸、硫甙、和芥子碱等有毒有害物质，并显著改善了蛋白和碳水化合物的生物利用率，可作畜禽饲料的优质蛋白原料。因此，含有15wt％以上该饲用发酵棉菜粕蛋白原料而形成的无毒高营养棉菜粕动物饲料是本发明的重要应用。

采用上述技术方案，本发明将棉粕和菜粕混合成棉菜粕，最大程度发挥了两者营养上的互补；同时，借助两种原料混合时的稀释效应使它们的有毒有害成分含量降低(降低一倍或以上)；本发明利用微生物发酵棉菜粕混合原料，进一步去除棉粕和菜粕中的有毒有害物质及抗营养因子，并将蛋白质大分子降解为小肽等，提高了蛋白质及NSP类营养物质的消化利用率。加工后的产品，有毒有害成分降解率达到50％以上，植酸降解率达到100％完全去除，安全性显著增加；产品粗蛋白质含量达到42％以上，蛋白质的生物利用率提高，达到豆粕的水平；在配合饲料中的添加比例由原来的5％左右提高到15％以上。该方法相对物理、化学、作物育种等方法具有如下特点：1.经济、成本低、不需要加热或添加化学试剂；2.无化学残留物，应用安全；3.不影响饲料营养成分，不降低营养价值，且使营养物质更易被动物吸收；4.与添加单一的酶制剂相比，可以同时消除多种抗营养因子；5.棉菜粕细胞壁破坏更加彻底，内容物更易释放，有利于动物更加快速的吸收营养物质；6.增加了微生物活的菌体，有利于动物肠道7.发酵过程中分解大分子蛋白产生多种小肽，有利于动物茁壮成长。本发明利用现代生物技术解决了棉菜粕利用率低，在饲料中添加量少及存在有毒物质的危害等问题，在一定程度上可以缓解我国饲料蛋白质资源的不足。本发明在产业化实施中可产生明显的经济效益，产品的应用同时将下降饲料的成本，为用户增加效益，还有助于减少豆粕的进口，获得明显的社会效益。此外，本发明的方法易于掌握、工艺稳定，直接得到的产品消除了棉菜粕毒物，是满足动物健康成长的、富有营养的、质优价廉的、安全的植物性饲料，能替代豆粕等高价格的蛋白质饲料。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

本发明首先针对棉粕和菜粕各自存在的营养上的缺陷和它们在营养上的互补性，将两者以一定比例混合成棉菜粕，同时，借助两种原料混合时的稀释效应使它们的有毒有害成分含量降低(降低一倍或以上)；在此基础上，利用微生物发酵技术对棉菜粕混合原料进行发酵处理，进一步去除棉籽饼粕及菜籽饼粕中的有毒有害物质及抗营养因子，并将蛋白质大分子降解为小肽等，提高蛋白质及NSP类营养物质的消化利用率。

本发明方法包括如下步骤：

a、准备棉菜原料：棉菜粕原料来源于粮、油食品加工企业，优选的原料如新疆生产建设兵团农六师新湖绿业油脂公司的棉粕、湖北天发股份有限公司出产的菜粕，分别符合GB/T 21264-2007饲料用棉籽粕标准和GB/T 23736-2009饲料用菜籽粕标准要求的原料，也可以选用一般饲料用棉、菜粕原料；在工业生产中，尽可能对不同批原料的营养成分和毒物及抗营养因子进行抽查测定，以便选择合理经济的工艺参数(包括是否选定单株或多株菌种混合发酵工艺，以及菌种与原料的配比等参数)；本发明中棉粕、菜粕可选用的比例为按重量9∶1-1∶9。

b、在棉菜粕混合原料中加入料水和复合酶：料水是自来水，优选为灭菌自来水(如高温灭菌或紫外线灭菌自来水)，还可以是蒸馏水；水与原料混合均匀后，置于发酵池中，采用假底可通风的发酵池，还可是其他发酵装备，如固体发酵罐，装料厚度优选为25～50厘米；混合原料与料水的重量比为1∶0.2～1.5。在混合原料中再加入复合酶制剂，复合酶制剂A组成：纤维素酶30％、木聚糖酶25％、葡聚糖酶25％、蛋白酶20％；复合酶制剂B组成：木聚糖酶30％、葡聚糖酶30％、淀粉酶20％、蛋白酶20％。复合酶制剂添加比例为棉菜粕混合原料重量(干重，不含料水)的0.1-10％。

c、接种菌种：主要选择能产蛋白酶菌或/和产乳酸菌及分解硫葡萄糖甙菌或/和分解棉酚的微生物菌种，其他对植酸、芥子碱、环丙烯脂肪酸等抗营养因子有消除作用的微生物菌种也在选择之列；本发明的微生物菌种主要选自酵母菌，乳酸杆菌，地衣芽孢杆菌，沼泽红假单胞菌；可以单株发酵，最好是多种菌种混合发酵，按主要消除何种毒物抗营养因子为目的来确定混合菌种的种类和配比；菌种预先按说明书接种在各自培养基中进行培养，使用时，将菌丝以及培养基一同加入发酵罐；其中酵母菌，地衣芽孢杆菌的培养基为液体种子培养基-PDA培养基，或固体菌种培养基如麦麸；乳酸杆菌培养基为6～12％脱脂无糖奶粉溶液；沼泽红假单胞菌的培养基为光合细菌培养基；菌种的来源可以非常广泛，如可选用华中农业大学培育的菌种。使用混合菌种时，接种量按菌种和相应培养基总重量占棉菜粕原料重量(指干重)的百分比计算，分别为酵母菌0.5-100％，地衣芽孢杆菌0.5-100％，乳酸杆菌1-100％，沼泽红假单胞菌1-100％。

d、控温发酵：发酵温度为30～55℃，发酵时间为45～84小时，控温方法为间歇通风式，所述通风是指人为提供发酵所需的氧气，可以是鼓入的空气，或压缩氧气；不通风发酵时，发酵全过程自然升降，发酵时间适当长些；当环境温度过高或过低时，应在通风时采取降温、翻珑或升温保温等相应措施；所述的控温发酵温度范围和时间范围，不计算温度低于30℃环境下的其温度和响应时间。取全部发酵产物作为成品(湿料)；

e、成品处理：所述成品处理是指发酵后的工艺，依次包括烘干、粉碎、检验、包装等工序制得产品；产品可以是粉状物，也可以制粒；对于采取即时使用的用户，产品也可以不烘干，采取保鲜措施，直接运出，限定期限内使用。产品质检指标为：蛋白质含量大于等于42wt％，硫甙、棉酚、芥子碱和环丙烯脂肪酸的去除或降解率达到50％以上，植酸降解率100％。

以下以具体实施例进一步说明本发明。下述实施例1-25采用本发明的最佳实验方案，本领域的普通技术人员能够依据本发明公开的内容显而易见地想到一些雷同、替代方案，均应属于本发明的公开内容。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

用本发明的方法制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白，参照上述描述，具体包括以下过程和参数：

1)准备棉菜粕原料：棉粕和菜粕按重量比1∶9混合为10kg棉菜粕原料。

2)混合原料装入发酵罐中，装料厚度在25～50厘米，然后加入8kg(原料与料水的重量份数比为1∶0.8)料水搅匀，料水为高温灭菌自来水；然后加入10g(按混合棉菜粕原料的0.1wt％)复合酶制剂A。

3)接种微生物菌种，本实施例中使用混合菌种，将各菌种(带培养基)逐一加入发酵罐中，所接种的菌种按含有各菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量(干重，本例为10kg)的百分计，分别为酵母菌(PDA培养基)0.5％.乳酸杆菌(培养基为6～12％脱脂无糖奶粉溶液)1％，地衣芽孢杆菌(培养基为麦麸)0.5％，沼泽红假单胞菌(光合细菌培养基)1％。

4)控制发酵，发酵温度为30℃，间歇式鼓入空气，发酵时间70小时，全部发酵产物(湿料)作为成品。

5)成品处理：A.将发酵产物采取保鲜措施，限定期限内直接使用。

B.将发酵产物烘干、粉碎到粉状，分装成产品使用。

C.将发酵产物烘干、粉碎到粉状，再放入制粒机，制粒，分装成产品使用。

实施例2、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶1.3；

步骤3)中接种的菌种和接种量分别为酵母菌4％，乳酸杆菌5％，地衣芽孢杆菌4％，沼泽红假单胞菌5％。

步骤4)中发酵温度为55℃，发酵时间为60小时。

实施例3、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉粕、菜粕原料的比例为重量比9∶1。

步骤2)中料水为紫外线灭菌自来水，原料与料水的重量份数比为1∶0.2，复合酶制剂B添加量为1.0％。

步骤3)中接种的菌种和接种量分别为酵母菌1％，乳酸杆菌50％，地衣芽孢杆菌1％，沼泽红假单胞菌50％。

步骤4)发酵温度为30℃，发酵时间为84小时。

实施例4、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例3相同。其中区别是：

步骤4)中通入压缩氧气发酵，发酵温度55℃，发酵时间50小时。

实施例5、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉、菜粕原料的比例为重量比5∶5。

步骤2)中料水为蒸馏水，原料与料水的重量份数比为1∶1.5，复合酶制剂A添加量为5.0％。

步骤3)中接种的菌种和接种量分别为酵母菌50％，乳酸杆菌1％，地衣芽孢杆菌50％，沼泽红假单胞菌1％。

步骤4)中发酵温度为30℃，发酵时间为70小时。

实施例6、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例5相同。其中区别是：

步骤4)中发酵温度为55℃，发酵时间为45小时。

实施例7、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉、菜粕原料的比例为重量比7∶3。

步骤2)中料水为紫外线灭菌自来水，原料与料水的重量份数比为1∶1.0，复合酶制剂添加量B为10％。

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，分别为酵母菌2％，乳酸杆菌5％，地衣芽孢杆菌2％，沼泽红假单胞菌5％。

步骤4)中发酵温度为50℃，发酵时间为60小时，不通风发酵，发酵全过程自然升降，当环境温度过高或过低时采取降温、翻珑或升温保温措施以维持发酵温度。

实施例8、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例7相同。其中区别是：

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶1.5。

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，分别为酵母菌3％，乳酸杆菌4％，地衣芽孢杆菌3％，沼泽红假单胞菌4％。

步骤4)中发酵温度为38℃，发酵时间为72小时。

实施例9、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉、菜粕原料的比例为重量比3∶7。

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶0.8，复合酶制剂A添加量为0.5％。

步骤3)中发酵装备为固体发酵罐，所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，分别为酵母菌2％，乳酸菌4％，地衣芽孢杆菌2％，沼泽红假单胞菌2％。

步骤4)中发酵温度为40℃，发酵时间为74小时。

实施例10、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例9相同。其中区别是：

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶1.3。

步骤4)中发酵温度为47℃，发酵时间为68小时。

实施例11、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)棉、菜粕原料的比例为重量比9∶1。

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶1.0，复合酶制剂A添加量为2.5％。

步骤3)中发酵装备为固体发酵罐，所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，分别为酵母菌0.5％，乳酸杆菌1％，地衣芽孢杆菌0.5％，沼泽红假单胞菌1％。

步骤4)中发酵温度为45℃，发酵时间为68小时。

实施例12、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例11相同。其中区别是：

步骤4)中发酵温度为56℃，发酵时间为64小时。

实施例13、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉、菜粕原料的比例为重量比4∶6。

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶0.8，复合酶制剂B添加量为2.5％。

步骤3)中发酵装备为固体发酵罐，所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，为酵母菌(含PDA培养基)50％。

步骤4)中发酵温度为50℃，发酵时间为65小时。

实施例14、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种为单一酵母菌(含PDA培养基)，接种量为棉菜粕原料重量的100％。

步骤4)中发酵温度为45℃，发酵时间为72小时。

实施例15、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，乳酸杆菌50％。

步骤4)中发酵温度为45℃，发酵时间为72小时。

实施例16、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，乳酸杆菌加入量为100％。

步骤4)中发酵温度为50℃，发酵时间为65小时。

实施例17、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，地衣芽孢杆菌50％。

步骤4)中发酵温度为45℃，发酵时间为72小时。

实施例18、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，地衣芽孢杆菌加入量为100％。

步骤4)中发酵温度为50℃，发酵时间为65小时。

实施例19、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，沼泽红假单胞菌50％。

步骤4)中发酵温度为45℃，发酵时间为65小时。

实施例20、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例13相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，沼泽红假单胞菌加入量为100％。

步骤4)中发酵温度为50℃，发酵时间为65小时。

实施例21、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例1相同。其中区别是：

步骤1)中棉、菜粕原料比例为重量比6∶4。

步骤2)中原料与料水的重量份数比为1∶1.0，复合酶制剂B添加量为3.5％。

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，酵母菌1％，乳酸杆菌50％。

步骤4)中发酵温度为30℃，发酵时间为60小时。

实施例22、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例21相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，酵母菌25％，地衣芽孢杆菌25％。

步骤4)中发酵温度为47℃，发酵时间为45小时。

实施例23、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例21相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，乳酸杆菌5％，沼泽红假单胞菌35％。

步骤4)中发酵温度为40℃，发酵时间为50小时。

实施例24、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例21相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，酵母菌1％，乳酸杆菌50％，地衣芽孢杆菌25％。

步骤4)中发酵温度为35℃，发酵时间为55小时。

实施例25、制备无毒高营养棉菜粕动物饲料蛋白

制备过程与实施例21相同。其中区别是：

步骤3)中所接种的菌种按含有菌种的培养基重量占棉菜粕原料重量的百分计，乳酸杆菌50％，地衣芽孢杆菌5％，沼泽红假单胞菌40％。

步骤4)中发酵温度为40℃，发酵时间为55小时。

产品的检测：

原料及产品中有毒物质及抗营养因子的检测

方法：参照标准有：GB/T 13086-1991饲料中游离棉酚的测定方法。GB/T18634-2002饲用植酸酶活性的测定分光光度法。GB/T 6434-2006饲料中粗纤维的含量测定过滤法。GB/T6432-1994饲料中粗蛋白的检测方法。

检测结果：原料和产品检测数值参见表3所列。

结果分析：以上检测结果表明，利用本发明的方法可以有效的提高产品粗蛋白质含量，达到42％以上，硫甙、棉酚、芥子碱和环丙烯脂肪酸等有毒有害物质的降解或去除率可达到50％以上，植酸降解率达到100％完全去除。当原料配比合适，水分适当，发酵温度正确，菌种组合搭配合理，如实例3和实例4中的棉酚、环丙烯脂肪酸和硫甙的降解去除率达到了90％以上，如实例8、实例11、实例24和实例25的粗蛋白含量达到了50％以上。

产品的应用效果：

本发明产品主要作为优质蛋白质原料组分用于添加在动物饲料中，由于本发明消除了棉菜粕中的毒物抗营养因子，并通过发酵使棉菜粕蛋白质发生一定程度的分解，获得一种积累乳酸等多种有益代谢产物，和大量有益活菌的优良蛋白，因此可以突破原有棉菜粕在饲料中用量(5％)限制，在饲料中较大量(至15％)添加仍然安全，可较大比例替代豆粕等高价格蛋白质饲料。本发明产品经东北、华中、华南数地区在肥育猪、肉鸡和奶牛养殖试验结果表明，应用该产品替代部分豆粕和鱼粉、骨粉、血粉可以提高动物的生长效果，减少腹泻，提高成活率，明显的降低饲料成本，取得显著的经济效益。

表3  无毒高营养棉菜粕动物饲料的有毒物质及抗营养因子检测结果