肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir与Tccp的重组蛋白

摘要

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(Tccp)重组蛋白的制备方法及应用，属于生物技术领域。取tir和tccp基因C端序列串联克隆，获得pGEM-T-tir-tccp重组质粒，构建重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp，转化入感受态细胞BL21(DE3)中，获得重组菌株，经IPTG诱导后获得高效表达。本发明制备的重组蛋白Tir-Tccp具有良好的免疫原性，可诱导机体产生高滴度的保护性抗体。Tir-Tccp可作为研制亚单位疫苗的候选多价融合蛋白，为预防和治疗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染提供了技术平台和防控手段。

说明书

一、技术领域

本发明涉及肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白制备方法及应用，属于生物技术领域。

二、背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7作为一种食源性致病菌被认识已经有20余年的历史，是引起人出血性结肠炎(HC)的主要病原菌，还可在5％～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可致死亡。近20余年来，EHEC O157:H7引发的食物中毒在世界各地包括我国都有不同规模的暴发流行。目前该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，受到广泛关注。但对其感染尚无有效防治方法，研究证明抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者并发HUS的危险性增加。目前还没有理想的疫苗可用于EHEC感染的防治，为此，尽快研制出切实有效的能够切断传染源以彻底清除病原菌的有效疫苗成为当前该领域的研究重点。

转位紧密粘附素受体(Translocation intimin receptor，Tir)为O157:H7的转位跨膜衔接蛋白，是紧密素的主要受体，由EHEC O157:H7毒力岛LEE岛上的tir基因编码。该蛋白通过EHEC III型分泌系统(type III Secretion System，TTSS)分泌并转位至宿主细胞中，参与细菌的紧密粘附、肌动蛋白聚合基座形成A/E损伤。Tir全基因为1677bp，编码含559个氨基酸残基，分子量为72kDa的蛋白质。

内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(Tir couple cytoskeleton protein，TccP)是近年来在EHEC O157:H7中新发现并确定的一种毒力因子，由O157:H7基因组内编号为Z3072的开放阅读框序列编码，分子内含有数个富含脯氨酸的重复片段，该重复片段由47个氨基酸残基组成，C末端15个氨基酸也是一个截短的重复片段。不同菌株来源的TccP的重复片段数目不同，由2-8个不等。该蛋白通过III型分泌系统转导进入宿主细胞，在EHEC O157:H7定植感染过程中起重要作用。国际参考菌株EDL933EHEC TccP基因全长1155bp，编码含384个氨基酸残基，分子量为42.5kDa的蛋白质。

三、发现内容

技术问题本发明目的在于表达EHEC O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白，研究其免疫原性，进而为研制EHECO157:H7的基因工程亚单位疫苗奠定基础，为更加安全而有效的防控O157:H7感染提供技术手段。

技术方案本发明的具体实施方案如下：

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白制备方法与应用，其特征在于，所说的重组蛋白为构建的重组菌BL21(pGEX-4T-1-tir-tccp)所表达。重组蛋白的制备方法包括：

(1)获取tir和tccp基因C端序列，并串联克隆入pGEM-T载体

根据GenBank公布的EHEC O157:H7 EDL933菌株Tir基因序列(AF125993)和TccP序列(NP_288437)分别设计并合成两对特异性引物，以O157:H7 EDL933菌株煮沸制备的DNA为模板，分别扩增tir和tccp基因C端1243bp和825bp序列，引物序列如下：

Tir-P1：5’-tacggatccactcttaacaggcagattgg-3’

Tir-P2：5’-cgaaagcttcgttatcagtagtatccc-3’

TccP-P 1：5’-accaagcttcccattcggcatcatttc-3’

TccP-P2：5’-cggctcgaggcttagatgtattaatgcc-3

Tir-P1和TccP-P2引物两端分别加限制性酶切位点BamH I和XhoI及保护性碱基，Tir-P2和TccP-P1引物两端加相同的限制性酶切位点Hind III及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。tir/tccp基因PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃1min，60℃/58℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，以双蒸水为阴性对照；

Tir-P1和Tir-P2、TccP-P1和TccP-P2两对引物扩增获得相应大小的目的条带为1243bp和825bp，并分别用质量比1％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的Extraction buffer后56℃作用10min，转移融化的液体于微型柱子(2mL)，并6000g离心1min，弃液体，加入500ul的Extraction buffer，12000g离心30s，再弃液体，加入wash buffer 750ul，12000g离心30s，弃液体，空管12000g离心30s，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入30ul Elution buffer，12000g离心30s，收集离心液，即为经过纯化的1243bp和825bp片段，命名为tir414和tccp275片段；

将Hind III酶切tir414和tccp275片段各1.6μL，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.0μL，双蒸水4.8μL同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取tir414-tccp275的过夜连接产物3.0μL，与2×Rapid Ligation Buffer5.0μL、T4DNALigase 1.0μL和pGEM-T载体1.0μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接18h-24h，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切，37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条2068bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pGEMT-tir414-tccp275；

(2)pGEX-4T-1-tir-tccp重组质粒的构建

pGEMT-4T-1-tir414-tccp275重组质粒和表达载体pGEX-4T-1质粒分别用BamH I、Xho I双酶切，回收tir-tccp重组基因和pGEX-4T-1酶切片段，T4DNA酶连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp，连接反应体系：10×T4 DNA Ligasebuffer1.0μL，T4 DNALigase1.0μL，pGEX-4T-1酶切片段3.0μL，目的片段1.2μL，灭菌ddH₂O 3.8μL。上述试剂混匀后于4℃连接18h～24h，将连接产物转化于感受态BL21(DE3)中，构建含重组菌株BL21(pGEX4T-1-tir-tccp)，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Xho I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可出现2068bp片段，即获得阳性重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp；

(3)Tir-TccP重组融合蛋白的表达

挑取经过酶切鉴定为阳性的单菌落，37℃振荡培养过夜，同时转化pGEX-4T-1空质粒做阴性。将培养菌液按2％体积比接种于LB(Amp工作浓度为100μg/mL)液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀≈0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，之后在30℃继续培养7h进行诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE。诱导菌液离心收集菌体重悬于PBS缓冲液中，超声裂解后，10000g离心20min，收集上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，以确定表达目的蛋白存在形式，在上清中可以清晰看到分子量大小为102kD目的蛋白，表明表达蛋白主要以可溶性形式存在于菌体蛋白中，占菌体总蛋白的25％，即为Tir-TccP重组蛋白。

有益效果本发明的特点和优点如下：

1、本发明针对EHEC O157:H7重要的粘附因子串联构建了融合型重组菌。利用PCR，获得tir和tccp两个基因片段，并通过串联，最终克隆入表达质粒pGEX-4T-1中，成功构建pGEX-4T-1-tir-tccp，转化入BL21中获得重组菌，即BL21(pGEX-4T-1-tir-tccp)。

2、本发明成功获得BL21(pGEX-4T-1-tir-tccp)，经过37℃高密度发酵培养，30℃IPTG的诱导获得高效表达，表达量约占全菌蛋白的25％，经过纯化后获得重组融合型蛋白，即Tir-TccP重组蛋白。

3、本发明对纯化后的Tir-TccP重组蛋白制备了基因工程疫苗，免疫了BALB/c小鼠，明确了上述表达的重组蛋白具有良好的抗原性，为更加安全而有效的防控肠出血性大肠杆菌的感染和致病提供了有效的技术方法。

四、附图说明

图1：tir和tccp基因PCR扩增片段。

M：markerDL5000；1：tir基因；2：tccp基因

图2：pGEX-4T-1-tir-tccp重组质粒酶切鉴定图谱。

1：marker DL15000；2：marker DL2000；3：pGEX-4T-1-tir-tccp重组质粒BamH I/Xho I

图3：pGEX-4T-1-tir-tccp重组菌SDS-PAGE。

M：低分子量标准蛋白质；1：pGEX-4T-1空载体诱导后；2：pGEX-4T-1-tir-tccp诱导前全菌蛋白；3-6：分别为pGEX-4T-1-tir-tccp诱导全菌蛋白

图4：Tir-TccP融合蛋白免疫小鼠血清IgG抗体消长规律曲线。

图5：小鼠粪便排菌量变化趋势图。

五、具体实施方式

1、获取tir和tccp基因，并串联克隆入pGEM-T载体

根据GenBank公布的EHEC O157:H7 EDL933菌株(上海三踏生物科技有限公司)Tir基因序列(AF125993)和TccP序列(NP_288437)分别设计并合成两对特异性引物，以O157:H7 EDL933菌株制备的DNA为模板，分别扩增tir和tccp基因C端1243bp和825bp序列，引物序列如下：

Tir-P1：5’-tacggatccactcttaacaggcagattgg-3’

Tir-P2：5’-cgaaagcttcgttatcagtagtatccc-3’

TccP-P 1：5’-accaagcttcccattcggcatcatttc-3’

TccP-P2：5’-cggctcgaggcttagatgtattaatgcc-3

Tir-P1和TccP-P2引物两端分别加限制性酶切位点BamH I和XhoI及保护性碱基，Tir-P2和TccP-P1引物两端加同样的限制性酶切位点Hind III及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点。tir/tccp基因PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃1min，60℃/58℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，以双蒸水为阴性对照；

Tir-P1和Tir-P2、TccP-P1和TccP-P2两对引物扩增获得相应大小的目的条带为1243bp和825bp，并分别用质量：体积(W/V)比1％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的Extraction buffer后56℃作用10min，转移融化的液体于微型柱子(2mL)，并6000g离心1min，弃液体，加入500ul的Extraction buffer，12000g离心30s，再弃液体，加入wash buffer 750ul，12000g离心30s，弃液体，空管12000g离心30s，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入30ul Elution buffer，12000g离心30s，收集离心液，即为经过纯化的1243bp和825bp片段，命名为tir414和tccp275片段；

将Hind III酶切tir414和tccp275片段各1.6μL，T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1.0μL，双蒸水4.8μL同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜；取tir414-tccp275的过夜连接产物3.0μL，与2×Rapid Ligation Buffer5.0μL、T4 DNALigase 1.0μL和pGEM-T载体1.0μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接18h-24h，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切，37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条2068bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pGEM-T-tir414-tccp275；

2、pGEX-4T-1-tir-tccp重组质粒的构建

pGEMT-4T-1-tir414-tccp275重组质粒和表达载体pGEX-4T-1质粒(Novagen公司)分别用BamH I、Xho I双酶切，回收tir-tccp重组基因和pGEX-4T-1酶切片段，T4DNA酶连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp，连接反应体系：10×T4 DNALigase buffer1.0μL，T4 DNA Ligase1.0μL，pGEX-4T-1酶切片段3.0μL，目的片段1.2μL，灭菌ddH₂O 3.8μL。上述试剂混匀后于4℃连接18h～24h，将连接产物转化于感受态BL21(DE3)中，构建含重组菌株BL21(pGEX4T-1-tir-tccp)，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Xho I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可出现2068bp片段，即获得阳性重组质粒pGEX-4T-1-tir-tccp；

3、重组菌的构建、重组融合蛋白的表达和纯化

挑取经过酶切鉴定为阳性的单菌落，37℃振荡培养过夜，同时转化pGEX-4T-1空质粒做阴性。将培养菌液按2％体积比接种于LB(Amp工作浓度为100μg/mL)液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀≈0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，之后在30℃继续培养7h进行诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE。诱导菌液离心收集菌体重悬于PBS缓冲液中，超声裂解后，10000g离心20min，收集上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，以确定表达目的蛋白存在形式，在上清中可以清晰看到分子量大小为102kD目的蛋白，表明表达蛋白主要以可溶性形式存在于菌体蛋白中，占菌体总蛋白的25％，即为Tir-TccP重组蛋白。

4、EHEC O157:H7重组蛋白Tir-TccP重组蛋白基因工程疫苗的制备

将上述纯化的重组蛋白与佐剂(ISA 50v，法国Seppic公司生产)按照4.6∶5.4的比例进行混合乳化制成油乳剂，其中重组蛋白的终浓度为150μg/mL。

5、免疫试验

(1)实验动物  选取雄性BALB/c小鼠(扬州大学)20只，18g-22g/只。

(2)实验动物的前处理  在攻毒前所有组均给予5g/L链霉素溶液饮用3d，3d后粪检肠道排菌少于10³CFU/g，灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。以排除肠道正常菌群，为O157:H7在小鼠体内驯化一个定居和生长的环境，在肠道中成为优势菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前断水断食12h，攻毒后6h恢复饮水饮食，防止攻毒后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。

(3)免疫攻毒和分组情况  将20只小鼠随机分为2组，每组10只，即实验组应用制备的基因工程苗，而对照组用等量的无菌PBS替代。采用背部及腹部皮下多点注射方式进行免疫，共免疫三次，免疫时间为0，2，4周，免疫剂量为30ug/只。三免7天后进行灌胃攻毒，剂量约为1×10¹⁰CFU/只。攻菌后密切观察各组小鼠的行为、摄食情况及精神状态的变化，详细统计各组小鼠死亡情况，并每隔两天收集小鼠新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。

(4)免疫后血清中Tir-TccP特异性IgG抗体的检测

小鼠首免后，每隔一周对小鼠采取断尾方式采血制备血清，应用间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清IgG抗体效价。

ELISA检测具体步骤如下：(1)ELISA抗原包被板的准备：将抗原用包被液稀释至2.5ug/mL，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。PBST洗板3-4次。每孔加入200μl的5％脱脂奶粉，37℃温箱封闭2h，PBST洗板3-4次后，-20℃保存备用。(2)血清特异性抗体IgG的检测：以抗体稀释液二倍比稀释待检血清与阴性血清，从1∶50至1∶102400，分别加入按(1)包被的ELISA板，100μl/孔，同时置于37℃孵育1.5h。PBST洗板3-4次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶20000)，100μl/孔，置于37℃孵育45-60min，PBST洗板3-4次。加入TMB底物显色液，100μl/孔，室温避光反应5-10min。2mol·L^-1硫酸终止液50μL终止反应，以PBS孔作空白对照，在酶标测定仪上测定各孔OD450值。以OD测定/OD阴性＞2.1判断为阳性。

(5)免疫效果确定依据

①抗体变化  利用ELISA检测两次免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明，首免后14d后即可检测到Tir-TccP特异性抗体，并逐渐上升，在二免后14d检测抗体达到较高值，与对照组相比，P/N＞2.1，免疫组血清成阳性，说明此重组蛋白通过该种免疫方式可诱发小鼠产生Tir-TccP特异性IgG抗体，图4。

②攻毒保护情况  三免后7天攻毒，结果显示免疫组小鼠存活率为10/10，对照组存活率为5/10。

③排菌量变化  攻毒后24h开始采集粪便，之后每隔两天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37℃培养18～24h，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为O157:H7。免疫组排菌时间缩短，免疫组攻毒之后第8d检测不到O157:H7，而对照组于第14d仍能检测到排菌，图5。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>肠出血性大肠杆菌O157：H7 Tir与Tccp的重组蛋白

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

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<212>DNA

<213>人工

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<221>Tir-P1

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cgaaagcttc gttatcagta gtatccc                                       27

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<212>DNA

<213>人工

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<221>TccP-P1

<222>(1)..(27)

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accaagcttc ccattcggca tcatttc                                       27

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<213>人工

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<221>TccP-P2

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