一种用于加速契达干酪成熟的修饰性瑞士乳杆菌

摘要

本发明提供了一种经热应激改造后的修饰性瑞士乳杆菌。所述修饰性瑞士乳杆菌通过如下方法制备获：得以瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)为出发菌株，经高密度培养后，在50～80℃下热应激处理5～100秒。实验表明，本发明修饰性瑞士乳杆菌能够显著加快契达干酪的成熟，可以使契达干酪的成熟时间缩短至2个月，并且在质地和口感上保持了原有的特点和风味。

说明书

技术领域

本发明涉及一种经热应激处理后的修饰性瑞士乳杆菌。

背景技术

契达干酪原产于英国的契达村，属细菌成熟的硬质干酪，因现在美国大量生产，故又称“美国干酪”。成品指标一般为水分39％，脂肪32％，蛋白质25％，食盐1.4％～1.8％。香味浓郁，色泽呈白色或淡黄色，质地均匀，组织细腻，具有该干酪特有的纹理图案。

契达干酪的制作通常包括：原料乳的预处理，发酵剂和凝乳酶的添加，切割、加温搅拌及排除乳清，凝块的反转堆积，破碎与加盐，压榨成型以及成熟等步骤。整个成熟期长达6个月以上。若在4～10℃条件下，则成熟期需6～12个月。因此，如何提高成熟速度，是契达干酪制作亟待解决的问题。

在契达干酪加速成熟领域，采用修饰性发酵剂的方法中常用的菌种包括乳球菌混合菌株(mixed lactococci strains)，德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.bulgaricus)，干酪乳杆菌(L.casei)，瑞士乳杆菌(L.helveticus)。瑞士乳杆菌是其中一个重要的菌种，发明人尝试通过提供一种新的经热应激修饰后的菌株，以达到加快契达干酪成熟的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的经热应激修饰的瑞士乳杆菌，用于提高契达干酪的成熟速度。

本发明以瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)作为出发菌，采用活化培养至活力恢复，并进行高密度培养，经过热应激参数优化筛选后，发现采用一定参数条件应激修饰后的瑞士乳杆菌能够显著加快契达干酪成熟。本发明热应激处理菌株的条件是在50～80℃下处理5～100秒，优选60～70℃下处理10～40S，更优选在65℃下处理30S。

具体而言，从原始冻干菌株出发获得本发明菌株的方法包括如下步骤：

1.菌株活化

菌株：瑞士乳杆菌纯菌株冻干粉

活化培养基：8％～15％的脱脂奶培养基

活化培养温度：25～45℃

活化培养时间：2～48小时

2.菌株高密度培养

培养基配方：8％～15％脱脂奶，酵母提取物0.1％～5.0％，蛋白胨0.1％～5.0％，CaCO₃  0.1％～5.0％，乳糖0.1％～5.0％，K₂HPO₄0.05％～5.00％。

培养温度：25～45℃

培养时间：8～72小时

经8～72小时培养后，菌体密度达到10⁸～10¹⁰cfu/ml。

3.热应激修饰菌株制备

采用蠕动泵、精密水浴锅、冰浴等组合设备进行热处理。

热处理温度：50～80℃

热处理时间：5秒～100秒

保存条件：-20℃～4℃，3天～6个月。

目标菌株选择：具有较高细胞胞内肽酶活力的乳酸菌，瑞士乳杆菌为首选。

上述方案具有良好的可重复性。经热应激处理后得到的菌株可以使契达干酪的成熟时间缩短至2个月。本领域技术人员应当理解，本发明也可以直接使用已活化的菌株或经高密度培养的菌株进行热应激处理。

本发明中，若未特别指明，百分比用“％”符号表示，是指重量的比例；但溶液的百分比，是指溶液100ml中含有溶质若干克。

本发明通过对瑞士乳杆菌在特定条件下进行热激处理获得了能够显著提高干酪成熟的修饰性菌株，可以使契达干酪的成熟时间缩短至2个月，并且在质地和口感上保持了原有的特点和风味。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明采用如下方法进行热应激处理：

1.菌株活化至活力恢复

2.高密度培养至菌株密度达到108～1010cfu/ml

3.采用一定的热激条件(热激温度与时间)进行热激处理

4.研究处理后的菌株性质(与干酪加工与成熟相关的性质)：包括产酸能力、活菌数、蛋白水解能力、脂肪分解能力、酶活力水平等，并经实际应用在干酪制作中测定对成熟的影响。

在本发明使用瑞士乳杆菌，经活化培养后，优化了菌株高密度培养条件，使菌体密度达到10⁸～10¹⁰cfu/ml。通过热应激温度与时间两因素的优化与筛选，确定了热应激条件的范围，对热应激的菌株相关性质及对契达干酪成熟的影响进行了研究。研究后发现，采用某一条件范围内的热应激菌株，可以明显提高契达干酪的成熟，缩短成熟时间。

实施例1

本例以瑞士乳杆菌冻干菌株(6024，购自中国工业微生物菌种保藏中心)作为对象来制备本发明菌株。制备方法包括如下步骤：

1)活化培养：将原始菌种在无菌条件下分别接种于8％的脱脂奶培养基上，在25℃条件下培养2天；

2)高密度培养：将步骤1)培养的菌种在无菌条件下分别接种1％于液体培养基中(含酵母提取物0.1％，蛋白胨0.1％，CaCO₃ 0.1％，乳糖0.1％，K₂HPO₄ 0.05％，pH＝5.6)。在25℃条件下，在全自动生化反应罐里培养72小时，培养结束时菌悬液中活菌数达10⁸～10¹⁰cfu/ml。

3)热应激处理：将步骤2)获得的菌悬液，进行热处理，处理条件为60℃，30秒。

4)菌株保存：0-4℃冷藏3天。

实施例2  干酪应用实验

本例采用实施例1制得的瑞士乳杆菌，来考察其在干酪加工中的应用效果。

实验材料：瑞士乳杆菌(6024)、实施例1制得的瑞士乳杆菌、发酵剂(购自科汉森公司)、凝乳酶(购自科汉森公司)、纯牛奶

实验方法：

实验分组：实验组(添加实施例1制得的瑞士乳杆菌)、阴性对照(添加未经处理的瑞士乳杆菌6024)、空白对照(未添加瑞士乳杆菌)

干酪加工方法：

Cheddar干酪的制作参照Wilkinson(1994)等人的方法，略有修改。新鲜牛乳标准化(调整蛋白/脂肪＝0.80)后，放入干酪半自动制造机的不锈钢槽中进行干酪制作。首先标准化后的原料乳经64℃30分钟巴氏杀菌，冷却至30℃接入1％(v/v)发酵剂菌种(等体积热激修饰后菌株同时加入作为实验组)，经40-50分钟保温后加入凝乳酶和0.01％(w/v)氯化钙，继续恒温培养40-60分钟待凝乳形成后，用不锈钢切刀切割成0.5cm见方的小块。切割后的小凝块在干酪槽中在50分钟内从30℃均速升至38℃，并保温15-30分钟后开始出料。之后，排出乳清、堆叠，缓慢收缩乳粒待pH降至5.5-5.6时加入食用盐(0.15-0.30g/100ml原料乳)，并继续搅拌至混合均匀。装入不锈钢模具内并采用柱塞式压力设备进行压榨。制好的成品真空包装后，4-7℃保存。

结果：从进入成熟期后，定期检测干酪成熟的相关指标，包括可溶氮水平、质构特性、微观结构，结果表明：加入热激菌株与未添加相比，干酪的制作工艺不改变，成品组分无显著差异。而其它成熟指标则表明热激菌株的添加具有促进干酪成熟的作用，如表1所示。

表1干酪成熟对比实验

从上表可以看出，实验组56天成熟时，干酪成熟的相关指数，如水溶氮水平、磷钨酸可溶氮、质构特性(硬度)与84天对照组成熟干酪相当，感官检验无不良风味。同时，采用透镜电镜分别观察实验组与对照组干酪在成熟56天和84天时的干酪微观结构，观测到的结果与上述结论一致。

而阴性对照组，由于添加了未经热激处理的菌株，在干酪制作过程中产酸过快，使得凝乳、热煮、保温、堆叠等过程时间进程缩短，强烈干扰制作过程，造成制作完成时终产品质地变软，风味不良，产生酸苦味等严重质量缺陷，无法食用，不能做为干酪成品。

实施例3  菌种制备

本例以瑞士乳杆菌冻干菌株(10532，购自中国农业微生物菌种保藏中心)作为对象来制备本发明菌株。制备方法包括如下步骤：

1)活化培养：将原始菌种在无菌条件下分别接种于15％的脱脂奶培养基上，在45℃条件下培养2小时；

2)高密度培养：将步骤1)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基中(含酵母提取物5.0％，蛋白胨5.0％，CaCO₃ 5.0％，乳糖5.0％，K₂HPO₄ 5.00％)。在45℃条件下，在全自动生化反应罐里培养8小时，培养结束时菌悬液中活菌数可达10⁸～10¹⁰cfu/ml；

3)热应激处理：将步骤2)获得的菌悬液，进行热处理，处理条件为70℃，8秒；

4)菌株保存：-20℃冷冻保存6个月。

将上述方法制备得到的菌剂用于契达干酪的制备中(同实施例2)，结果表明，与未添加热激菌种相比，契达干酪的成熟时间缩短了1个月。

实施例4  菌种制备

本例以瑞士乳杆菌冻干菌株(1.1877，购自中科院微生物菌种保藏中心)作为对象来制备本发明菌株。制备方法包括如下步骤：

1)活化培养：将原始菌种在无菌条件下分别接种于10％的脱脂奶培养基上，在30℃条件下培养10小时；

2)高密度培养：将步骤1)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基中(含酵母提取物2.0％，蛋白胨5.0％，CaCO₃2.0％，乳糖3.0％，K₂HPO₄2.00％)。在30℃条件下，在全自动生化反应罐里培养24小时，培养结束时菌悬液中活菌数达10⁸～10¹⁰cfu/ml；

3)热应激处理：将步骤2)获得的菌悬液，进行热处理，处理条件为60℃，50秒；

4)菌株保存：-20℃冷冻保存6个月。

将上述方法制备得到的菌剂用于契达干酪的制备中(同实施例2)，结果表明，与原始菌种相比，契达干酪的成熟时间缩短了1个月。

在菌种制备过程中，发明人意外获得一株综合性状较好的菌株，与原始菌种相比，契达干酪成熟的时间缩短了一个半月左右。该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)SY-HSM-LH01保藏号为CGMCC No.3454。