一种同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法

摘要

本发明涉及一种同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法。该方法是将鸡蛋样品经过提取、净化、浓缩后，以乙腈-磷酸二氢钠溶液为流动相，采用C

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法。

背景技术

目前国内外对甲砜霉素、氟苯尼考及代谢产物氟苯尼考胺的残留检测方法虽然有不少报道，但主要集中在水产品的研究，检测方法主要有高效液相色谱紫外检测法(HPLC/UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC/FLU)、高效液相色谱质谱联用检测法(HPLC-MS)。HPLC/UV法样品杂质峰较多，干扰较大，对样品的净化要求较高，而且紫外检测器的灵敏度较低。HPLC-MS法虽然灵敏度很高，但是其价格昂贵，很难在实际生产中普及。HPLC/FLU法灵敏度高，样品杂质峰较少，对样品的净化要求较低。HPLC/FLU法同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留国内尚未见报道。

发明内容

为了使待测组分峰与杂质峰完全分开，且均为基线分离峰，使检测限低于0.1个MRL_S，使定量限低于0.2个MRL_S，本发明提供了一种高效液相色谱荧光检测法，能同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留。

本发明所采用的技术方案是：一种同时检测鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留的方法，是将鸡蛋样品经过提取、净化、浓缩后，以乙腈-磷酸二氢钠溶液为流动相，采用C₁₈柱(5μm，250mm×4.6mm)，流速为1.0～1.2mL/min，在激发波长225nm、发射波长为285nm处用荧光检测器检测；其中所说的乙腈-磷酸二氢钠溶液为0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.1％三乙胺，乙腈和NaH₂PO₄溶液体积比为30～35∶70～65。

本发明中鸡蛋样品提取、净化、浓缩可采用常规的乙腈、丙酮提取，但因乙腈、丙酮提的回收率低，所以本发明推荐使用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取，具体操作是：将鸡蛋制成匀浆后，加入30％-50％乙腈溶液中混匀，再用体积比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取振荡萃取，离心，将上清液移出，重复萃取3-4次，合并上清液，即得提取液；提取液在氮吹仪上吹干，用乙腈溶解残渣，再用经纯乙腈饱和的正己烷重复脱脂，然后氮吹仪上再次吹干，用30％-35％乙腈溶液溶解残渣，离心，过滤，得滤液，即浓缩液。浓缩液即可用于HPLC检测。

本发明方法与HPLC/FLU法检测水产品中甲砜霉素、氟苯尼考及代谢产物氟苯尼考胺的方法相比：(1)流动相不同。本方法选择的流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.1％三乙胺)(体积比30～35∶70～65)，报道的流动相为乙腈-乙酸铵溶液(0.025mol/L，含0.01mol/L庚烷磺酸钠)(体积比15∶85)，本方法所用离子对试剂十二烷基硫酸钠比庚烷磺酸钠便宜很多；(2)出峰顺序不同。本方法选择的流动相分析出峰顺序为甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺，而报道的流动相分析出峰顺序为甲砜霉素、氟苯尼考胺、氟苯尼考，相比之下本方法峰形相对较好，分析时间缩短；(3)检测波长不同。本方法采用荧光检测器检测(激发波长225nm，发射波长285nm)，报道的方法采用荧光检测器检测(激发波长224nm，发射波长295nm)，相比之下本方法灵敏度高。

附图说明

图1是鸡蛋空白对照样品色谱图；

图2是TAP(200μg/L)+FF(200μg/L)+FFA(40μg/L)标准溶液色谱图(25μL进样)；

图3是.TAP(100μg/kg)+FF(100μg/kg)+FFA(20μg/kg)空白鸡蛋添加色谱图(100μL进样)；

图4是口服给药样品色谱图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为质量百分浓度。

1.实验鸡的饲养、给药和样品采集

1.1实验鸡选择及分组

选取28周龄京海黄鸡175只，体重1.75±0.20kg，随机分成7组，每组25只，单笼饲养。A、B、C组为甲砜霉素试验组，D、E、F组为氟苯尼考试验组，G组为空白对照组。给药前分别称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。

1.2给药剂量、途径及样品采集

各试验组产蛋鸡投药剂量如表1所示。给药前先将甲砜霉素和氟苯尼考灌注于空心胶囊中，然后分别直接投入到鸡的嗦囊中。试验组每天给药一次，给药时间均在上午8:00-9:00，连续5d，自给药日起至停药后15d内收集每天的鸡蛋。

表1给药方案

2(1)乙酸乙酯-乙腈-氨水提取、净化与浓缩步骤：

①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

②准确称取2.0-3.0g鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中；

③加入1-1.5mL 30％-50％乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；

④加入4-6mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2，V/V)，旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；

⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至20-25mL玻璃管中；

⑥重复提取3-4次，合并上清液；

⑦在35-55℃水浴中，用氮气吹干；

⑧加入1.0mL-1.5mL乙腈溶解，涡旋振荡混匀1-2min；

⑨加3.0-5.0mL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；

⑩在35-55℃水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；

上机前用1.0mL 30％-35％乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；

12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

(2)乙腈提取、净化与浓缩步骤：

①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

②准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；

③加入1mL 35％乙腈溶液置漩涡混合器上混匀；

④加入4mL乙腈，涡旋振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；

⑤6000-8000r/min离心10-15min，上清液转移至25mL玻璃管中；

⑥重复提取3-4次，合并上清液；

⑦在35-55℃水浴中，用氮气吹干；

⑧加入1.0mL乙腈溶解，旋涡振荡混匀1-2min；

⑨加3.0mL饱和正己烷(用纯乙腈饱和)脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；

⑩在35-55℃水浴中，用氮气吹干；冷冻保存；

上机前用1.0mL 35％乙腈溶解，转移至1.5mL离心管中；

12000-13400r/min离心15分钟，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

(3)丙酮提取、净化与浓缩步骤：

①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

②用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；

③准确称取2.0g鸡蛋匀浆样品，放于50mL具塞离心管中；

④加入2mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液，旋涡振荡混匀1-2min；

⑤加入4mL丙酮旋涡振荡混匀1-2min，再用超声波振荡萃取15min；

⑥6000-8000r/min离心5min；

⑦将溶液转移到另一支15mL离心管中；

⑧再向溶液中加入3mL二氯甲烷，旋涡振荡混匀1min，再用超声波振荡萃取15min；

⑨6000-8000r/min离心5min；

⑩弃去上层水相，置45℃氮吹仪上吹干；

(11)用1mL 35％乙腈溶解残渣，涡旋振荡混匀1min；

(12)加入3mL正己烷(用纯丙酮饱和)涡旋振荡混匀1min，脱脂，弃去上层正己烷，重复脱脂2次；

(13)水相转移至1.5mL离心管，上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

3回收率的测定  准确称取3.0g匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置50ml聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液，使得空白空白蛋液中甲砜霉素添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg；氟苯尼考添加量分别为0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg；氟苯尼考胺添加量分别为0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg。每个添加量设6个平行，经上述样品的提取、净化和浓缩后，进样80μL作HPLC检测。HPLC检测条件：色谱柱为C18，5μm，250mm×4.6mm；流动相为乙腈∶NaH₂PO₄溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.10％三乙胺)＝30～35∶70～65(V/V)，用85％H₃PO₄调pH至4.5-4.8；荧光检测器，激发波长225nm，发射波长285nm；流速：1.0～1.2mL/min；柱温：25～30℃。根据峰面积计算添加回收率。本发明方法提取样品的结果见表2。乙腈、丙酮提取样品的结果见表3、表4。

表2鸡蛋中TAP、FF和FFA的添加回收率及变异系数(n＝6)

表3鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n＝6)

表4鸡蛋中甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及变异系数(n＝6)

4、色谱条件

色谱柱：C18，5μm，250mm×4.6mm；

流动相：乙腈∶NaH₂PO₄溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸钠和0.10％三乙胺)＝30～35∶70～65(V/V)，用85％H₃PO₄调pH至4.5-4.8；

检测器：荧光检测器，激发波长225nm，发射波长285nm；

流速：1.0～1.2mL/min；

柱温：25～30℃。

5定量方法

标准曲线的绘制用35％乙腈分别将甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺储备液稀释成质量浓度为10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、0.025mg/L，10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、0.01mg/L和2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025mg/L的系列工作标准液，进行HPLC色谱分析。每个浓度点重复测定3次，取平均值绘制色谱峰面积(S)-浓度(C)标准曲线。

检测限及定量限的确定

(1)向空白鸡蛋中加入定量的药物标准品混匀，配置成药物浓度在标准曲线末端并逐渐降低的一组样品，然后对每种浓度样品测定6次，以测定结果的精密度(RSD)达到≤20％和准确度达到(平均浓度偏离配置浓度)达到≤±20％时，样品中药物的最低浓度为定量限(LOQ)。

(2)测定时记录各浓度样品每次测定得到的药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，然后取S和N的平均值，以能达到以其平均值之比等于3时样品最低药物浓度为检测限(LOD)。

6精密度的测定

日内精密度

方法：将高、中、低三种浓度的样品，每种样品分别测定6次，在同日内早、中、晚用同一条标准曲线及同一台仪器设备分别进行分析测定。

日间精密度

方法：将高、中、低三种浓度的样品，每种样品分别测定6次，在一周内不同日用不同的标准曲线分别进行分析测定。

本发明采用荧光检测器检测(激发波长225nm，发射波长285nm)，与紫外检测器检测(λ＝224nm或225nm)相比，样品杂质峰少，干扰少，可将甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺与鸡蛋样品中其它组份完全分开，甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺保留时间分别为4.5、8.0和11.0min左右，色谱峰峰形较佳，且均为基线分离峰，空白鸡蛋样品提取液在上述保留时间无干扰峰出现，见图1-4。筛选出的高效液相色谱荧光检测(HPLC/FLU)方法，甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺灵敏度高、最低检测限分别为5、5、1μg/kg。甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺分别在0.025～10.0、0.01～10.0、0.0025～5.0mg/mL范围内线性关系良好(r＝0.9997，r＝0.9998，r＝0.9998，n＝7)，可满足鸡蛋中甲砜霉素、氟苯尼考和代谢物氟苯尼考胺残留检测的要求。其结果见表5。

表5TAP、FF和FFA的回归方程和相关系数、线性范围、检测限