重组人甲状旁腺激素(1－84)非融合表达及规模化制备方法

摘要

重组人甲状旁腺激素(1－84)非融合表达及规模化制备方法，本发明属于基因工程，包括发酵培养基、发酵参数、菌体收集、重组人甲状旁腺激素蛋白提取与纯化以及该蛋白的生物活性检测，本发明诱导表达起始时间为8小时，一次发酵时间为12小时，所收获湿菌重量与发酵液体积比为21.4g∶1L，重组人PTH(1－84)表达量约占菌体总量的25％；经层析柱纯化可获得大于95％的纯度，得率约为湿菌10mg/L发酵液，并建立了OD450nm条件下重组人PTH(1－84)蛋白与cAMP浓度关系方程。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程，特别涉及制备重组人甲状旁腺激素(1-84)的方法。

背景技术

甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH(1-84))是生物体内调节钙、磷代谢的重要因子，它是由甲状旁腺分泌的含84个氨基酸的单链多肽蛋白质，是调节钙、磷代谢及骨转换的最为重要的肽类激素之一。重组人PTH(1-84)技术所遇到问题包括，甲状旁腺激素蛋白的氨基端会引入额外的氨基酸，使其活性降低，而大肠杆菌表达外源蛋白时常常在其氨基端引入甲硫氨酸，但可以利用大肠杆菌的内源性甲硫氨酸氨肽酶去除表达产物的氨基端甲硫氨酸，所以以大肠杆菌作为甲状旁腺激素基因表达载体的宿主细胞是目前常用的PTH(1-84)编码基因和表达载体在体外重组后导入的受体细胞，中国发明专利2006100260199“重组人甲状旁腺激素的制备方法”以及我们在本申请中均用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌表达重组人PTH(1-84)目的基因。但是，甲状旁腺激素基因5’端存在导致易表达无活性8-84氨基酸片段的翻译起始位点，直接用PTH(1-84)与载体拼接转化大肠杆菌进行表达，获得的活性重组人PTH(1-84)蛋白效率不高，由于该原因，上述发明专利中PTH(1-84)的编码基因与质粒Pet32a(+)载体连接转化大肠杆菌的表达数量受到了限制。由于双顺反子表达方式的应用，前导顺反子的有效翻译能打开后续顺反子内的不利二级结构，从而克服不利的二级结构对目的基因本身表达的影响，在提出本申请之前我们以ZL021278563“重组人甲状旁腺激素基因、其表达载体及重组人甲状旁腺激素蛋白的制备方法”，利用双顺反子表达方式合成了重组人甲状旁腺激素编码基因，它包括碱基7至碱基57编码作为前导顺反子的短肽IVSEIQLMHNLGKHLTS，碱基64至碱基70为大肠杆菌SD编码系列，碱基81至碱基332为PTH(1-84)氨基酸的编码序列，在前导顺反子和PTH(1-84)氨基酸编码序列之前的起始密码子ATG以及之后的终止密码子TAA，构建了表达载体，并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)进行培养，以及从培养液中分离目的蛋白，并且完成了实验室阶段纯化试验。但是，该阶段还尚未构成规模化的生产，其发酵培养基为3.5升，重组人PTH(1-84)表达量未超过15％，而分离纯化所用层析谱柱的内径和柱长较小(10mm×60mm)，每次进样处理的菌体仅有1g。

本文中重组人甲状旁腺激素(1-84)缩写为重组人PTH(1-84)或PTH(1-84)。

发明内容

本发明旨在提出重组人甲状旁腺激素(1-84)的非融合表达及规模化制备方法，包括发酵培养基、发酵参数、菌体收集、重组人甲状旁腺激素蛋白提取与纯化以及重组人甲状旁腺激素蛋白的生物活性检测，其生物活性指标为重组人甲状旁腺激素注射剂的临床试验及研究奠定一定基础。

本发明通过以下步骤实现：

(1)用双顺反子表达方式合成的重组人甲状旁腺激素(1-84)编码基因；

(2)将该基因转入受体细胞内构造宿主细胞并在适宜条件下进行培养，经筛选建立表达重组人甲状旁腺激素(1-84)的种子菌；

(3)取种子菌液在培养基R2及配料的发酵罐内按下列参数发酵：

培养温度30℃，pH值6.8～7.2，罐压为常压，通气量、转速与溶解氧联动，溶氧为50％-100％；

本发明特征是：

(4)将800ml种子菌液加入15升发酵罐，该发酵罐内培养基为14升，封罐发酵3小时后流加葡萄糖，pH值为7.0-7.2，发酵8小时后加入0.5MIPTG，IPTG终浓度为1mmol/L，升温至37℃，补加酵母抽提物和酸水解干酪素，诱导表达4小时至菌体停滞生长，离心收集菌体保存；

(5)纯化工艺：

a.用14升发酵液收集菌体后得到约300g的湿菌，菌体按1g/ml用量抽提液(1N HCl/1％NaCl/1％TFA)进行抽提，离心收集上清，沉淀中再加入300ml的抽提液，重复3次，合并收集的上清液；

b.将收集的上清液用Tris.Cl稀释6-8倍上样至用Tris.Cl平衡的SP-Sepharose/BPG柱(100mm×250mm)，用Tris.Cl冲平基线，收集穿透峰，其中，Tris.Cl的pH值为7.5-8.5；

c.将所得穿透峰用盐酸调pH至6.0-7.5，上至用Tris.Cl平衡的CM-Sepharose/BPG柱(100mm×250mm)，用Tris.Cl冲平基线，收集穿透峰，其中，Tris.Cl的pH值为6.0-7.5；

d.将收集的穿透峰加入NaCl，使其终浓度为1M，用NaOH调pH至7.0-8.0，上样至用1M铵盐、pH＝7.0-8.0平衡的Butyl-Sepharose/BPG疏水柱(100mm×200mm)，用pH7.0-8.0、1M铵盐冲平基线，以pH7.5、1M铵盐为A液，pH7.0-8.0的dH2O为B液，梯度洗脱蛋白，收集各洗脱峰，洗脱参数为：Target＝100％、Length＝120min；

e.SDS-PAGE检测目的蛋白，收集目的蛋白洗脱峰，超滤浓缩10倍后上至用缓冲液10mM PBS，2mM EDTA，pH7.2平衡好的凝胶过滤柱Superdex-75(35mm×1300mm)，流速为5ml/min，用缓冲液10mM PBS，2mM EDTA，pH7.2洗脱，收集洗脱峰，分装，冻干。

所述的步骤(5)纯化工艺中，除e点凝胶过滤柱之外，离子交换柱，疏水柱层析的流动相流速为110-150ml/min。

所述的步骤(5)纯化工艺的d点中铵盐为pH7.5浓度1M的(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl或NH₄Ac。

用不同浓度的重组人PTH(1-84)蛋白刺激体外培养的骨肉瘤细胞(MG-63)使其裂解，光密度OD450nm与环腺嘌呤(cAMP)浓度关系为：

y＝0.00114+0.28586/{1+[10∧(x-1.429)0.88]}

其中，光密度OD450nm为因变量y，环腺嘌呤(cAMP)为自变量x。

本发明所达到的效果是：

1.以15升发酵罐和14升培养基R2作为规模化发酵的基础，比实验室阶段的发酵数量增加了3倍；诱导表达起始时间从实验室阶段的10小时缩短为8小时。

2.在发酵过程中流加碱，控制pH值在6.8-7.2范围内，溶氧量不低于50％，适当补充碳源和氮源，经过12小时发酵，一次可获得菌体湿重约300g，即所收获湿菌重量∶发酵液体积为21.4g∶1L，经薄层扫描PTH(1-84)表达量约占菌体总量的25％，使PTH(1-84)蛋白表达量由实验室的15％提高到25％，增加约70％，而菌体活性和密度不受发酵条件的影响。

3.与实验室规模的小量纯化相比，本发明纯化过程所用的层析柱为BPG柱，规格为100mm×250mm，处理的菌体为300g。菌体各组分经过离子交换柱分离、疏水柱层析及凝胶过滤柱Superdex-75纯化，每300g湿菌可获得纯度大于95％的重组人PTH(1-84)约140mg，得率约为10mg/L发酵液。

4.用所获得的重组人PTH(1-84)刺激体外骨肉瘤细胞(MG-63)，测定环腺嘌呤(cAMP)变化数值，取得了在OD450nm光学密度条件下重组人PTH(1-84)蛋白与cAMP浓度关系方程，借以表达重组人PTH(1-84)生物学活性。

因此，本发明建立了稳定的较大生产规模的纯化工艺，使局限于实验室阶段的重组人甲状旁腺激素蛋白方法实现了的规模化制备。

附图说明

图1是疏水柱层析图。

图2是凝胶柱层析图。

图3是纯化工艺电泳图。图中，M为分子量标准，1为诱导前，2为诱导后4小时，3为蛋白抽提液，4为离子交换柱SP穿透峰，5为离子交换柱SP洗脱峰，6为疏水柱洗脱峰浓缩10倍，7为凝胶过滤柱洗脱峰。

图4是cAMP浓度与OD450nm吸收值关系的标准曲线图。

具体实施方式

1.按照ZL021278563“重组人甲状旁腺激素基因、其表达载体及重组人甲状旁腺激素蛋白的制备方法”，采用双顺反子表达方式人工合成重组人甲状旁腺激素编码基因，并构建表达载体pTrePTH(1-84)。

2.用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，用氯化钙法制备感受态细胞，将质粒pTrePTH(1-84)转化入感受态细胞，涂在含100ug/ml氨苄青霉素的LB(1％trypton，0.5％yeast extract，1％NaCl，1.5％agrose)平板上，重组菌落用含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基在30℃培养，经筛选后建立表达人PTH(1-84)的工程菌BL21(DE3)/pTrePTH(1-84)，原始菌种用含50％甘油的LB培养基保存在-70℃，工程菌在含氨苄青霉素的LB平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征，此工程菌每传20代作一次图谱分析，结果与原始菌种一致。

3.培养种子菌：保存的BL21(DE3)/pTrePTH(1-84)菌株挑单菌落接种入200ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，在1升摇瓶中于37℃培养约13小时，注意控制OD(OD600＝0.6-0.8)。

4.工程菌的发酵：将发酵罐中高压好的培养基中加入各种配料配制成发酵培养基R2。

发酵培养基R2配方：

(NH₄)₂HPO₄                        2g/L

KH₂PO₄                            6.75g/L

Citric acid                       0.85g/L

MgSO₄                             1.8g/L

Glucose                           20g/L

CaCl₂                             0.054g/L

ZnCl₂                             0.02g/L

Trace metal                       2ml/L

复合维生素液                      1ml/L

氨苄青霉素                        0.2g/L

Trace metal配方：

Citric acid                       5g

CoCl₂.6H₂O                        2g

MnCl₂.4H₂O                        12g

CuSO₄.5H₂O                        1.85g

H₃BO₃                             2.5g

NH₄MO₇.4H₂O                       1.32g

FeCl₃.6H₂O                        3.4g

复合维生素液(1升)配方：

维生素B1            20g

维生素B2            1.0g

维生素B6            2.5g

维生素B12           0.2g

生物素1             2.5mg

将800ml种子菌液加入15升发酵罐，其中培养基为14升，调pH至7.2，封罐。

发酵参数：培养温度30℃，pH控制在6.8～7.2，罐压为常压，通气量、转速与溶解氧联动，溶氧控制在80％。

发酵3小时后流加葡萄糖，并通过流加碱稳定培养基pH在7.0。发酵8小时后加入0.5M IPTG，使IPTG终浓度为1mmol/L并升温至37℃，诱导表达，同时补加酵母抽提物和酸水解干酪素，在诱导后约4小时停止发酵，OD600达到15.5左右。4℃离心收集菌体。菌体-20℃保存。

(4)将800ml种子菌液加入15升发酵罐，该发酵罐内培养基为14升，封罐发酵3小时后流加葡萄糖，pH值为7.0-7.2，发酵8小时后加入0.5MIPTG，使IPTG终浓度为1mmol/L，升温至37℃，同时补加酵母抽提物和酸水解干酪素，诱导4小时至菌体停滞生长，离心收集菌体保存；

5.纯化

(1)蛋白抽提

14L发酵液收集菌体后得到约300g的湿菌，菌体按1g/ml用量加入300ml抽提液(1N HCl/1％NaCl/1％TFA)进行抽提，离心收集上清，沉淀中加入300ml的抽提液，重复3次，合并收集的上清液。

(2)蛋白纯化

将收集的上清液用Tris.Cl(pH8.0)稀释7倍，将稀释后的蛋白液以150ml/min的流速，上样至预先用Tris.Cl(pH8.0)平衡好的SP-Sepharose/BPG柱(100mm×250mm)，上样结束后，用Tris.Cl(pH8.0)冲平基线，收集穿透峰。

将上一步所得穿透峰用盐酸调pH至7.0，并且上至预先用Tris.Cl(pH7.0)平衡好的CM-Sepharose/BPG柱(100mm×250mm)，流速为150ml/min，上样结束后，用Tris.Cl(pH 7.0)冲平基线，收集穿透峰。

将收集的穿透峰加入NaCl，使NaCl的终浓度为1M，用NaOH调pH至7.5，将处理好的蛋白液上样至预先用1M(NH4)2SO4(pH7.5)平衡好的Butyl-Sepharose/BPG疏水柱(100mm×200mm)，上样结束后，用1M(NH₄)₂SO₄(pH7.5)冲平基线，以1M(NH₄)₂SO₄(pH7.5)为A液，dH2O(pH7.5)为B液梯度洗脱蛋白，洗脱参数为Flow＝150ml/min；Target＝100％；Length＝120min。

在以上步骤中铵盐也可选用pH＝7.5、浓度1M的NH₄Cl或NH₄Ac。

收集各洗脱峰，SDS-PAGE检测目的蛋白，收集目的蛋白洗脱峰，超滤浓缩10倍，将超滤后的蛋白液上至用缓冲液10mM PBS，2mM EDTA，pH7.2平衡好的凝胶过滤柱Superdex-75(35mm×1300mm)，流速为5ml/min，用缓冲液10mM PBS，2mM EDTA，pH7.2洗脱，收集洗脱峰，分装，冻干，获得纯度96.7％的重组人甲状旁腺激素蛋白(1-84)约140mg。

6.重组人甲状旁腺激素蛋白(1-84)冻干粉的随机抽样测试由中国医学科学院基础医学研究所中心实验室进行，包括对N末端15个氨基酸序列(美国ABI公司PROCISE491蛋白测序仪)，分子量(德国Bruker公司REFLEX_TMIIIMALDI-TOP-MS)及蛋白质等电点(Beckman/PAGESYSTEM5500毛细管电泳仪)项目测试，结果如下表所示：

  测定值  理论值 N端氨基酸顺序  NH₂-SVSEIQLMHNLGKHL  NH₂-SVSEIQLMHNLGKHL 分子量  9426.4Da  9424.7Da 等电点  9.2  9.1

7.重组人甲状旁腺激素蛋白(1-84)蛋白体外生物学活性测定：

将冻干后的PTH(1-84)蛋白样品重新用去离子水溶解，用Lowry法测定蛋白浓度，确定蛋白浓度后将蛋白稀释成浓度25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml蛋白，刺激体外培养的骨肉瘤细胞(MG-63)，该骨肉瘤细胞上的甲状旁腺激素受体结合甲状旁腺激素后激活细胞内腺苷环化酶将导致环腺嘌呤(cAMP)增加；在解裂骨肉瘤细胞细胞(Rabbani et al，J.Bio.Chem.1988，263(3)：1307-1313)后，测定胞内cAMP浓度变化。

cAMP含量的测定方法根据R&Dsysetem公司cAMP检测试剂盒操作说明进行。先绘制cAMP浓度与OD450nm吸收值关系的标准曲线如图4，用该标准曲线通过统计软件拟合出的OD450nm与cAMP浓度方程为：

y＝0.00114+0.28586/{1+[10∧(x-1.429)0.88]}

重组人PTH(1-84)蛋白体外生物学活性测定结果见下表：

Statistics Table of cAmp Assay Standard Curve

根据上述方程换算出使用不同浓度的PTH(1-84)蛋白刺激MG-63后裂解细胞，所产生的cAMP浓度，见下表。

Statistics table of rhPTH Bioassay