糯玉米自交系申W22特异分子标记及在其后代品种鉴定中的应用

摘要

本发明公开了一种利用高配合力亲本特异的SSR标记进行糯玉米品种鉴定和种子纯度检验的方法。该方法以糯玉米自交系申W22及其近亲姐妹系、后代、非近源糯玉米以及粮食玉米和甜玉米等60份玉米的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组250对SSR引物进行PCR扩增结合PAGE胶电泳分析，建立了申W22的特异指纹图谱，成功获得了14对特异性高、在杂交后代显性强的SSR引物。应用这14对SSR引物，根据申W22的特异指纹图谱，可以进行申W22后代的品种鉴定和种子纯度检验。通过对以申W22为父本育成的沪玉糯二号、沪玉糯三号随机群体的鉴定，鉴定结果与田间鉴定一致。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及糯玉米自交系申W22(国家品种权号： CNA20010096.3)高度特异遗传稳定的14对SSR标记引物及其在鉴定未知样品是否为糯玉 米申W22的后代品种并判定其种子纯度中的应用。

背景技术

种质资源的鉴定和纯度检验对于农业生产和科研育种都非常重要，根据农艺性状区 分种质资源在多数情况下都很困难。DNA分子标记提供了物种根本的遗传特征，是不同物 种遗传变异的直接反映，因此成为种质资源鉴定最有效途径。目前，有5种常见分子标记 技术应用于品种鉴定，包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SCAR标记。

RFLP(限制性酶切长度多态性)标记方法的缺点是实验操作较繁琐，检测周期长。RAPD (随机扩增多态DNA)技术产生的多态性中等，重复性较差。AFLP(扩增片段长度多态性) 虽然多态性高，但是稳定性不够好。SCAR(序列特异扩增区域)标记是在RAPD技术的基础 上发展起来的，虽然重复性好但只能鉴定少数位点，因此在基因定位和作图中的应用更好。

SSR(simple sequence repeat)称为简单序列重复，又称微卫星DNA，是一种由2-6 个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，它广泛分布于真核生物基 因组中，不仅存在于基因组重复序列区域，也存在于编码基因的调节区。由于重复单元数 目不完全相同，因而形成多态性；且其旁邻多是保守的序列，可以通过设计特异性引物进 行PCR扩增。SSR标记具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、扩增片段稳定精确的 特点，结合SSR多态性及其片段大小，便可建立每一品种的标准图谱，以鉴别品种。相比 来，SSR既有RAPD简单、快捷、经济的优点，又有AFLP多态性高的优点，同时克服了RAPD 和AFLP重复性差的缺点。

玉米基因组包含24-27亿碱基，与人类基因组大小相近、约为水稻基因组的6-7倍。 玉米全基因组约80％由重复序列构成，占7.5％全基因组的编码基因状如小岛散布在长端 重复(LTR，long terminal repeat)-反转座子类重复序列的大海中。玉米基因组的特点使 得利用SSR技术成为进行玉米基因型鉴定的有效手段。

上海农科院育成的糯玉米自交系申W22，具有优质、糯性品质好、早熟性状遗传稳 定、配合力高等特点，于2003年获得国家品种权，品种权代号为CNA20010096.3。以申 W22为父本育成的沪玉糯一号，是我国继苏玉糯1号后第二个国家级审定的鲜食糯玉米杂 交种。随后，又以申W22为父本育成两个更优质的糯玉米品种：早熟白色糯玉米沪玉糯二 号、大穗高产优质白色糯玉米沪玉糯三号品种。这两个品种均通过上海市品种委员会审定， 适宜江南地区春秋季作为鲜食糯玉米栽培，或在适宜地区作为高产蜡质淀粉玉米生产，是 当前的主推品种。2007年统计，以申W22为父本组配的糯玉米新品种沪玉糯一号、二号、 三号，推广种植已遍布我国大陆20多个省(市、自治区)，累计推广达50万亩，农民新 增收入达3亿元以上，产生了显著的社会、经济和生态效益。因此，基于申W22的特异 DNA指纹对申W22及其后代品种的分子鉴定和纯度检验，对于生产栽培者和育种科学家的 实际工作和利益保护具有重要应用价值。

本发明在对覆盖玉米全基因组250对SSR引物筛选的基础上获得SW22可产生特异稳 定多态性、带型组合易于识别、在其后代显性好的14对SSR引物，应用这14对引物可以 成功鉴定申W22及其杂交后代糯玉米品种。

发明内容

因此，本发明一方面提供一种糯玉米品种鉴定或种子纯度检验的试剂盒，所述试 剂盒含有4-14对如下所述的引物对：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、 SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、和SEQ ID NO：27 和28。

在一个优选的实施例中，所述试剂盒包括下述引物对：SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、和SEQ ID NO：27和28。在另一优选的实施例中， 所述试剂盒还包括下述引物对：SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、和SEQ ID NO： 17和18。在更优选的实施例中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9 和10以及SEQ ID NO：23和24。在最优选的实施例中，所述试剂盒包括所述所有14对 引物对。

试剂盒中还可包括抽提样品DNA所需的各种试剂、用于进行PCR扩增的各种试剂以 及进行PAGE电泳所需的各种试剂。这些试剂是本领域技术人员周知的。试剂盒还可包括 指导使用该试剂盒进行检测的说明书。

另一方面，本发明还提供一种鉴定糯玉米品种是否为糯玉米自交系申W22或其后 代的方法，该方法包括：

(1)抽提糯玉米样品的DNA；

(2)用4—14对选自下组的引物对对抽提的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物， 所述引物对选自：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、 SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、和SEQ ID NO：27和28；

(3)将步骤(3)中的扩增产物进行PAGE电泳；和

(4)将所得电泳结果与使用所述引物对扩增自交系申W22所得的电泳结果进行比 较，确定所述样品是否含有与自交系申W22一致的指纹，从而鉴定糯玉米品种是否为 糯玉米自交系申W22或其后代。

在一个优选的实施例中，使用以下引物对进行PCR扩增：SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、和SEQ ID NO：27和28。在另一优选的实施例 中，还进一步使用以下引物对进行扩增：SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、和 SEQ ID NO：17和18。在更优选的实施例中，进一步使用以下引物对：SEQ ID NO：7和8、 SEQ ID NO：9和10以及SEQ ID NO：23和24进行扩增。

在一个具体的实施方式中，使用SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、和SEQ ID NO：27和28进行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定；若为 阳性，进一步用SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、和SEQ ID NO：17和18进 行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定；若为阳性，进一步用SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10以及SEQ ID NO：23和24进行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定； 若为阳性，则使用余下的其它引物对进行扩增，并做出判断。

此外，本发明一个优选的实施例还包括，在前述步骤(4)之后，实施步骤(5)：结 合用所述引物对获得的申W22的配合亲本申W13和W48的指纹图谱，鉴别杂交品种名 称。

再一方面，本发明还提供一种检验糯玉米自交系申W22或其后代种子纯度的方 法，该方法包括：

(1)抽提糯玉米种子的DNA；

(2)用4—14对选自下组的引物对对抽提的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物， 所述引物对选自：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、 SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、和SEQ ID NO：27和28；

(3)将步骤(3)中的扩增产物进行PAGE电泳；和

(4)将所得电泳结果与使用所述引物对扩增自交系申W22所得的电泳结果进行比 较，确定所述样品是否含有与自交系申W22一致的指纹，从而鉴定糯玉米种子是否为 糯玉米自交系申W22或其后代的种子；和

(5)用鉴定为糯玉米自交系申W22或其后代的种子数量除以总的测试种子数量， 计算得到种子纯度。

在一个优选的实施例中，使用以下引物对进行PCR扩增：SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、和SEQ ID NO：27和28。在另一优选的实施例 中，还进一步使用以下引物对：SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、和SEQ ID NO： 17和18。在更优选的实施例中，进一步使用以下引物对：SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO： 9和10以及SEQ ID NO：23和24。

在一个具体的实施方式中，使用SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、和SEQ ID NO：27和28进行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定；若为 阳性，进一步用SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、和SEQ ID NO：17和18进 行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定；若为阳性，进一步用SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10以及SEQ ID NO：23和24进行扩增，若鉴定结果为阴性，可作出判定； 若为阳性，则使用余下的其它引物对进行扩增，并做出判断。

本发明又一方面还提供下述引物对在鉴别糯玉米品种是否为糯玉米自交系申 W22、其配合亲本或其后代，或检验糯玉米自交系申W22、其配合亲本或其后代种子 纯度中的用途：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、 SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、和SEQ ID NO：27和28；

本发明还提供下述引物对：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO： 5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO： 13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、和SEQ ID NO：27和28。

附图说明

附图1显示申W22特异SSR标记引物SW22-1扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图2显示申W22特异SSR标记引物SW22-2扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图3显示申W22特异SSR标记引物SW22-3扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图4显示申W22特异SSR标记引物SW22-4扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图5显示申W22特异SSR标记引物SW22-5扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图6显示申W22特异SSR标记引物SW22-6扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照.

附图7显示申W22特异SSR标记引物SW22-7扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图8显示申W22特异SSR标记引物SW22-8扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图9显示申W22特异SSR标记引物SW22-9扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样品 编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图10显示申W22特异SSR标记引物SW22-10扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样 品编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图11显示申W22特异SSR标记引物SW22-11扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样 品编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图12显示申W22特异SSR标记引物SW22-12扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样 品编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图13显示申W22特异SSR标记引物SW22-13扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样 品编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图14显示申W22特异SSR标记引物SW22-14扩增产物PAGE电泳图谱，其中，样 品编号见表1，样品1为申W22；M为DL2000 marker(从上向下依次为 2000-1000-750-500-250-100bp)；0为负对照。

附图15显示申W22后代阳性品种用SW22-1-14引物鉴定结果图，其中，1代表申W22， 16代表申W13，26代表申W48，H2及H3指沪玉糯二号、三号阳性品种。

附图16显示应用申W22特异SSR指纹鉴定申W22及其后代品种的流程。

具体实施方式

为了进行申W22及其后代品种的快速身份鉴定，申请人致力于全基因组范围筛选特 异SSR标记指纹，成功获得了能够鉴别申W22及其后代的高度特异、稳定遗传的SSR指纹 图谱。依据这些图谱，仅需应用散布于全基因组的14对特异SSR引物，针对样品DNA进 行PCR扩增，后经PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，即可快速鉴别是否申W22品系 糯玉米。结合抽样检测，还可判定申W22糯玉米种子纯度。

发明过程可总括为附图16所示的流程图。

具体地说，首先，从玉米基因组数据库网站(www.maizegdb.org)于全基因组范围、 遵循平均分布原则选择SSR标记引物，每条染色体上各选择25条，10条染色体上共选择 合成了250对SSR标记引物。同时，确定了筛选样品群体并提取了这些自交系玉米的基因 组DNA，包括申W22、申W22同源糯玉米(含全部姐妹自交系4份和杂交后代自交系9份)、 非同源糯玉米自交系26份，以及10份甜玉米自交系和10份粮食玉米自交系。玉米种质 DNA样品编号见表1。

表1：玉米种质资源编号列表

 

编号名称编号名称编号名称编号名称1申W2216鲁糯1号31(SW48/5003)/SW4846H262申W2317SW13/通532(SW48/5003)/紫黑 糯1号           47夏珍3垦糯1号/小黄 糯玉米      18水晶1号/SW1333SW48/紫黑糯1号48H394申W761918姐妹系3433姐妹系49H255申W7720申W7835中糯1号/SW4850粤甜3号6垦糯/(白525/ 红糯)       21SW13/祝西红36申W7151美国AP-789137垦糯/鲁糯1号22SW13/(SW22/小黄 糯)            37申W7252150/AP7JK0348申W5423ZW-1/SW1338申W7353法国CPJ0089申W6524SW13/ZW-139申W7454法国35910(白525/红 糯)/SW22 25SW01/SW1340申W7555(330/Mo17)/Mo171110/SW2226申W4841H3156500312七宝紫糯 /SW22   27SW48/山东黑糯42H33578112/500313SW13/SW2228申W8243美国甜Yellow588112-314SW22/500329SW48/通544H3459黄早41514/SW2230SW13/SW4845H2760黄早4/小黄糯

筛选实验第一步，选取申W22以及非同源糯玉米、粮食玉米、甜玉米各一份的DNA 作为PCR模板，确定了每一对SSR标记引物扩增的最优PCR条件，以及根据扩增产物大小 范围确定PAGE电泳时所需要的时间。其它条件，PCR体系、DNA模板浓度、电泳染色显色 方法一致。

筛选实验第二步，选取申W22、同源糯玉米8份、非同源糯玉米8份、甜玉米2份、 粮食玉米2份共21份DNA样品，对全部250对SSR引物分别进行PCR扩增电泳分析。每 对引物针对这21个样品的扩增分析重复三次，最后剔除了70％在申W22没有特异性、区 分能力弱的标记引物，余下30％即75对SSR标记引物，均能将申W22与半数以上样品区 分开来。

筛选实验第三步，全面筛选。针对申W22、全部同源玉米14份、非同源玉米25份、 甜玉米10份、粮食玉米10份的共60份基因组DNA样品，进行了以上第二步筛选得到的 75对申W22有一定特异性的SSR标记引物的PCR扩增后结合PAGE电泳分析。每对SSR引 物针对60个样品的扩增分析重复三次，最后得到28对申W22高度特异的SSR标记引物， 其中任意4-8对引物组合扩增的指纹图谱可以将申W22与同源非杂交后代姐妹系糯玉米、 本研究所分析的全部非同源糯玉米、粮食玉米和甜玉米区分开来。

筛选实验第四步，针对申W22和全部糯玉米共40份样品DNA，对以上全面筛选得到 的28对SSR标记引物进行PCR扩增电泳分析，剔除了在杂交后代不能稳定遗传、带型组 合过于复杂不易识别、或区分能力冗余的占50％的SSR标记引物对，最后获得了14对SSR 标记引物对。这些引物扩增产物电泳的指纹图谱对申W22及其杂交后代都高度特异，因此 属于特异而又稳定遗传、在杂交后代的双亲组合图谱中易于识别的申W22的SSR标记。运 用这14对SSR标记引物中的4对(SW22-2、SW22-10、SW22-11、SW22-14)可以很好地将 申W22及其后代从所分析的60份不同来源的玉米种质中鉴别出来。在对未知样品进行鉴 别判定时，综合运用这14对SSR标记的引物进行扩增分析，可以使分子鉴定结果更准确 可靠。以上14对引物全面筛选的扩增图谱见附图1-14。引物名称及序列见表2。

表2：申W22糯玉米及其后代品种鉴定SSR标记引物名称及序列

 

引物 编号SSR名称 染色体 位点正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) Z℃ SW22-1 umc1041 1.00-1 .01CATTTCTTAGCACAACGC (SEQ ID NO：1)GCCACTGTGATTTCCCTT (SEQ ID NO：2)54 SW22-2 phi056 1.01 ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC (SEQ ID NO：3)CGCACACCACTTCCCAGA (SEQ ID NO：4)60 SW22-3 mmc0041 1.08 AGGACTTAGAGAGGAAACGAA (SEQ ID NO：5)TTTATCCTTACTTGCAGTTGC (SEQ ID NO：6)54 SW22-4 bnlg1175 2.04 ACTTGCACGGTCTCGCTTAT (SEQ ID NO：7)GCACTCCATCGCTATCTTCC (SEQ ID NO：8)58 SW22-5 umc2011 4.10 GTGCTGCAGTCATTAGGA (SEQ ID NO：9)ATCACATGGTTTTTCAGGT (SEQ ID NO：10)55 SW22-6 nc004 4.03 TGCGAAGAAGCAGTAGCAAA (SEQ ID NO：11)TGGAGGTAGAAGACGCACG (SEQ ID NO：12)58 SW22-7 umc1019 5.06 CCAGCCATGTCTTCTCGTTCTT (SEQ ID NO：13)AAACAAAGCACCATCAATTCGG (SEQ ID NO：14)62 SW22-8 umc2162 6.06 GACGATGACGAACACCGAGC (SEQ ID NO：15)GATGCTGATGACGCTCTACAAGG (SEQ ID NO：16)58 SW22-9 umc1068 7.02 AGTCGTTTTCAAAGGCTGC (SEQ ID NO：17)AGTCACCTCATTTCTTCTGG (SEQ ID NO：18)62 SW22-10 umc1936 7.03 GAGCTCATGTGTATGTGGACGTTG (SEQ ID NO：19)AATAAACAGAGGTAGGTCAGGTCGC (SEQ ID NO：20)62 SW22-11umc13408.05GATGTCTCTATGGAACCCAGCAACAGACGCCTACGAGTACCACAAC58

 

(SEQ ID NO：21)(SEQ ID NO：22)SW22-12mmc01818.06-8 .07   CTAATCACCAACCACCAACAC (SEQ ID NO：23)        AGTCCGTCCTCTGTCCTCGTC (SEQ ID NO：24)         56SW22-13umc11379.08ATCAGTCACTCTTCTGCCTC (SEQ ID NO：25)        TGGATAATGTTGTAGCTGGTC (SEQ ID NO：26)         58SW22-14bnlg15310.06- 10.07 TCCACTGCTCCTCCACTGC (SEQ ID NO：27)       CACTTCAAACTGTCAAATCTCCA (SEQ ID NO：28)           58

Z℃：PCR反应最适退火温度

本文所述“后代”包括申W22的杂交后代，例如沪玉糯二号(H2)、三号(H3)。本 文所用术语“包括”、“包含”、“含有”等还包括“由……组成”、“由……构成”的 含义。此外，本文所用术语，除非另有说明，否则都是本发明所属技术领域中所通用的术 语。

本发明的试剂盒可含有4对以上引物对，包括5、6、7、8、9、10、11、12、13和 全部14对引物对。这些引物对可以任意组合包含于本发明的试剂盒中。这些引物对也可 以任意组合用于本发明的糯玉米品种鉴定和种子纯度检验的方法。

玉米样品的DNA可抽提自叶片、种子、茎、根等。

应理解，在本申请中，所采用的DNA提取、PCR技术中涉及到的条件，例如温度、 试剂、步骤等都是本领域技术周知的。下述具体实施例不是对本发明范围的限制，它们仅 仅是阐述性的。本领域技术人员根据本领域现有技术，在不偏离本申请的精神和范围的情 况下，可对本申请的技术方案做出适当的修改和变动。

实施例1：DNA提取

鉴定单株玉米，取样时剪2厘米长叶片。用TPS提取液(pH8.0 100mM Tris.Cl；pH8.0 10mM EDTA；1M KCL)快速提取DNA，具体操作如下：

1)样品置于1.5ml eppendorf管中，加入200ul TPS提取液，磨棒或枪头使之磨碎；

2)75℃水浴20分钟后离心5分钟：12000rpm，常温；

3)上清夜移至新管，用等体积异丙醇-20℃沉淀20分钟后离心10分钟：12000rpm， 常温；

4)将DNA沉淀用500ul 70％乙醇洗涤离心5分钟：12000rpm，常温；

5)沉淀干燥后用50ul水溶解。

鉴定种子，完全随机取至少20粒种子的胚提取DNA，具体操作方法如下：将每一粒 干种子的胚取下，分别放入96孔深孔板中，每孔加入100μL提取液(0.1M NaOH，0.1‰溴 酚蓝)，盖上封口膜，沸水加热5min，然后每孔分别加入100μL TE缓冲液(pH2.0)，放在 4℃冰箱保存备用。

利用1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察照相，检测DNA质量。

以上DNA提取液分别取2ul直接用于PCR反应。

实施例2：PCR扩增

应用表2中14对引物进行PCR扩增，PCR模板为申W22及主要配合亲本申W13、申 W48以及未知待鉴定玉米种质的基因组DNA。

1)准备大体积的反应混合物，其中包括表3中所有成分、但DNA或引物除外。

2)将反应混合物分装到96孔板内，然后补加对应量的引物或DNA样品。

3)用液体石蜡油封顶。

4)置于PCR仪中。

表3：PCR反应体系组成

“RXN”：指反应体系

5)扩增程序如表4：

表4：Touchdown PCR程序(注：Z值参表2)

6)应结束后，每管加入3-4μl 5×SGB(参表5)混匀备用，如果不能立即使用可先 放置于4℃保存。

表5：5×SGB上样缓冲液配方

实施例3：PCR扩增产物的PAGE胶电泳分析

1)组装垂直板电泳槽：先将封底用的塑料槽条放进电泳槽下部靠内；取两块洗净晾 干的玻璃板【其一两边有毛玻璃(有上下内外之分)，另一顶部有凹口】，合并后(有凹 口的玻璃板应将凹口朝上紧贴电泳槽，有毛玻璃边一侧紧贴凹口玻璃即可)将其置于封底 用塑料槽内；用四枚铁夹将玻璃板固定在电泳仪上，齐下沿夹住，水平向内不可超过毛玻 璃条，纵向两枚夹子排在一起，下边紧上边略松。一侧组装好后再组装另一侧。

2)灌胶前封底：用1％琼脂(可用1×TBE配制，也可用自来水配制)封底。即溶解煮 沸凉至50~60℃后，倾斜电泳槽、并沿玻璃板下端灌进封底槽中，至其高度的一半左右即 可。待完全凝固后便可准备灌制聚丙烯酰胺凝胶。

3)制胶(两块)：用30％Acr/Bis配制8％的非变性胶，具体配制方法见表6、表7。

表6：30％ Acr/Bis贮存液(29：1)配方

表7：8％Acr凝胶溶液(用于非变性胶)的配制

(10％APS：称取1g的过硫酸胺，溶解于10ml超纯水即可，贮存于4℃；TEMED： 四甲基二乙胺，常温储存。)

4)上样：在电泳槽的两极添加同一批次的1×TBE电泳缓冲液(参表8)，然后拔出 梳子；用注射器清理加样孔，然后用微量进样器上样，每孔加入4~5μl样品即可。在凝 胶边上至少留出1—2个加样孔加入DNA Marker(将试剂公司提供的Marker稀释20倍后 加入5μl即可)。上样操作应尽可能地迅速。

表8：5×TBE电源缓冲液配制方法

5)电泳：稳压电泳(100V~150V)。溴酚蓝指示条带泳动至距离底边约1厘米时， 即可终止电泳。

6)银染：取下电泳槽两侧的架子将凝胶玻璃板从电泳槽上取下，然后将塑料封底槽 卸下；将凝胶玻璃板水平放置(有凹口玻璃板的一侧向上)，用有韧性的塑料薄片小心地 翘起凹口玻璃板，用刀片切去底边地琼脂封底胶；而后将具毛边的玻璃板翻转(使有聚丙 烯酰胺凝胶的一侧向下)置于盛有适量超纯水的塑料盘中，小心地晃动玻璃板使聚丙烯酰 胺凝胶与玻璃板分离；用超纯水略漂后，将水倒掉开始染色。向塑料盘中加入适量0.1％ AgNO3染色液(将1g AgNO3溶解于1L超纯水中，棕色瓶存放)使其没过胶体，在水平 脱色摇床上缓慢摇动染色5min(染色液可反复使用，但需要适当地延长染色时间)。

7)显色：银染后，再用超纯水小心而迅速漂洗聚丙烯酰胺凝胶。然后加入适量显色 液(将150g NaOH和1.9g十水合硼酸钠溶解于10L纯水中。用前添加适量甲醛(每 200ml加入37％的甲醛1ml))，缓慢摇动直至核酸条带显现，倒掉显色液加入自来水稍 加漂洗以终止显色。

8)拍照：将显色后的聚丙烯酰胺凝胶小心的转移到X光软片观察灯箱的白板上(注 意排出聚丙烯酰胺凝胶与白板之间的气泡)，然后打开背景荧光灯进行拍照。

结果判定：

根据14对引物扩增的电泳结果，比较分析特定样品中是否含有与正对照申W22一致 的指纹，如是则为申W22或其后代；反之，不是申W22或其后代。再结合申W22的配合亲 本申W13和W48的指纹图谱，可鉴别杂交种品种名称。阳性种子粒数或阳性单株数除以分 析总粒或株数，可计算群体纯度。

沪玉糯2号和沪玉糯3号阳性样品检测图谱，见附图15。图中显示，SW22-1扩增的 主辅两带在后代共显性；SW22-2在申W22中扩增的主辅两带在后代显性；SW22-3在申W22 中扩增的两主带在后代显性；SW22-4扩增的主带在后代共显性；SW22-5扩增的主辅带在 后代共显性；SW22-6扩增的主辅三带在后代显性；SW22-7扩增的主辅带在后代共显性； SW22-8扩增的主辅带在后代共显性；SW22-9扩增的主带在后代共显性；SW22-10在申W22 中扩增的主带在后代显性；SW22-11在申W22中扩增的辅带在后代显性；SW22-12在申W22 中扩增的6组合带型在后代显性；SW22-13在申W22中扩增的5组合带型在后代显性； SW22-14在申W22中扩增的7组合带型在后代显性。使用SW22-2、SW22-10、SW22-11、 SW22-14即可鉴定出沪玉糯2号和沪玉糯3号阳性样品。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>糯玉米自交系申W22特异分子标记及在其后代品种鉴定中的应用

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