Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用

摘要

本发明涉及基因芯片，公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用，该基因芯片的载体表面点阵固定有与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针和mtDNA 11719G＞A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针。本发明的基因芯片具有省时、费用低廉和操作简便等优点，仅需1次PCR扩增和1次杂交反应，即可特异性检测临床样本中32种与Leber氏遗传性视神经病变相关的突变位点。适用于Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及基因芯片，具体涉及与Leber氏遗传性视神经病变相关的检测基因芯片及其制备与应用。

背景技术

Leber氏遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种最常见的遗传性视神经萎缩疾病，以两侧急性或亚急性中央视力丧失为特征，主要累及青少年男性。1871年，Theodor Leber首次报道了一个LHON家系，并详尽描述了LHON的临床特征。随后一段时期内，人们认为LHON的遗传学模式与X染色体相关联(X-linked)，直到1972年Erickson提议LHON的遗传方式更倾向于母系遗传，他认为可能存在某个潜在的线粒体DNA(mtDNA)突变与LHON相关。1988年，Wallace及其同事首次报道LHON与MTND4基因11778G>A突变相关，至今已有30多种mtDNA点突变被报道与LHON相关，它们广泛地分布在世界各地不同种族和人群中。从MITOMAP数据库(http://www.mitomap.org)可以检索到与LHON相关的基因突变位点，其中90％以上的LHON患者与三大原发性mtDNA突变(11778G>A，3460G>A及14484T>C)有关，一些罕见的mtDNA突变也能引发LHON，如14459G>A，10663T>C，14568C>T，14482T>A/G，14495A>G，4171C>A，3733G>A等。虽然LHON的发病机制至今没有被完全阐明，毋庸置疑，原发性突变是LHON的发病基础。但仅存在原发性突变还不足以致病，如携带11778G>A，3460G>A或14484T>C的部分家系成员可不表现出任何临床症状，其他遗传学因素(如继发性mtDNA突变、核调节基因)和环境因素亦可能在LHON的病理生理学进程中发挥关键作用。此外，携带相同原发性突变位点的不同家系可表现出不同的外显率、发病年龄、严重程度以及视力丧失过程。因而，有必要对原发性突变以外的致病因素(如罕见突变和继发性突变)进行筛查，以进一步阐明mtDNA突变与LHON的关系，为诊断和治疗提供指导。

基因诊断技术的出现，改变了过去临床上仅依靠典型家族史和临床特征为判断依据，提高了对散发LHON病的确诊率。至今LHON病仍无十分有效的疗法，婚前遗传咨询和分子遗传学检测是预防和降低本病发生率的有效措施。已经建立了不少mtDNA突变检测方法，如限制性酶切片段长度多态性(Restriction fragment length poly morphism，RFLP)、单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism，SSCP)、等位基因特异性寡核苷酸斑点印记(Allele-specific oligonucleotide dot blot)、温度梯度电泳(Temperaturegradi ent gel electrophoresis，TGGE)、瞬时温度梯度电泳(Temporal temperaturegradient gel electrophoresis，TTGE)、变性梯度凝胶电泳(Denaturant gradient gelelectrophoresis，DGGE)和变性高效液相色谱(Denaturing high performance liquidchromatography，DHPLC)等，但在实际运用中这些技术仍存在一定的局限性，如RFLP花费高、工作量大，且有些重要突变位点因不在所用限制性内切核酸酶的识别范围而不能被检测到，其他方法相对于RFLP要复杂，更主要的是，这些方法大多一次只能针对一个或几个突变位点进行检测，检测结果常需DNA测序验证。全长mtDNA测序技术是目前LHON病最可靠的基因诊断方法，但该方法工作量大、费用昂贵，难以在常规临床诊断实验室普及运用。

目前，与本发明相关的中国发明专利共有三个，发明名称分别是：Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒(申请号：96116296.1)，Leber’s遗传性视神经病病人的线粒体DNA突变定量检测方法(申请号：200410027623.4)和Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法(申请号：200510006097.8)。这些专利都只针对LHON三种原发性突变(11778G>A，3460G>A及14484T>C)中的部分或全部进行检测，而不针对罕见突变或继发性突变进行检测，在运用上仍有一定的局限性。

基因芯片是近年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一体的高新技术，利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊序列的生物样品有序地固化在玻璃片和硅片等基质表面，并利用微量反应体积，一次杂交就可以对许多基因表达水平、突变和多态性进行特异、快速、精确检测，已经在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。由于基因芯片具有这些独特的优点使其在线粒体基因检测方面得到一定的运用，如利用表达谱微阵列对线粒体基因的表达状况进行检测，来探讨线粒体病的发病机制，或利用寡核苷酸微阵列上的引物延伸反应或直接核酸杂交检测线粒体单核苷酸多肽性(SNP)等。

由于与LHON相关的mtDNA突变位点数量较多，常规基因诊断方法已经难以满足要求，因而，研发一种新型基因芯片，用于对LHON相关mtDNA突变位点的集成检测，无疑具有潜在的社会效益和临床价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制作方法。

本发明的另一个目的在于提供一种上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的使用方法。

本发明的构思如下：

建立一种检测Leber氏遗传性视神经病变相关32个突变位点的基因芯片。该基因芯片包括检测系统和监控系统。检测系统根据MITOMAP数据库(http://www.mitomap.org)报道的32个与Leber氏遗传性视神经病变相关的线粒体DNA(mtDNA)突变位点，设计相应的位点特异性寡核苷酸探针，利用氨基与醛基的共价结合将寡核苷酸探针固定在芯片表面，探针与荧光标记的样本PCR扩增产物杂交，根据杂交信号可判断有无突变发生及突变类型。监测系统与检测系统位于同一阵列，包括阳性对照、阴性对照和平行对照，阳性对照为检测系统各探针的等量混合物，阴性探针为点样液，平行对照为东亚人常见的mtDNA 11719G>A单核苷酸多态性位点探针，可以根据监控系统来判断杂交的质量。

具体来说，根据修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)和MITOMAP数据库(http://www.mitomap.org)报道的32种与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA点突变(分别为：T3394C、G3460A、G3635A、G3733A、A4136G、T4160C、C4171A、T4216C、A4435G、C4640A、A4917G、G5244A、G7444A、G9738T、G9804A、T10663C、G11696A、G11778A、G13708A、G13730A、G14459A、C14484A、A14495G、T14498C、A14495G、T14498C、C14568T、A14596T、A14693G、G15257A、G15812A、A15951G)和东亚人常见的mtDNA11719G>A多态性位点，共设计了33对探针(其中32对探针针对32个Leber氏遗传性视神经病变相关突变位点，1对探针针对11719G>A多态性位点)和11对PCR引物。11对引物分成三组在同一热循环下进行多重PCR扩增，能特异地扩增出包含上述32个Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点和11719G>A多态性位点的目的DNA片段。在一张芯片上固定上述33对探针，只用一次PCR和一次杂交反应，就可以在6—8小时及时准确地确认被检者是否存在上述突变位点，从而为治疗和遗传学咨询提供确凿证据，并可以进一步阐明这些突变位点在中国人群中的分布及其对病因、发病机理、临床治疗及预后的影响。

本发明一方面公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片，在基因芯片载体表面点阵固定有与Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针和mtDNA11719G>A单核苷酸多态性位点的特异性寡核苷酸探针。

上述特异性寡核苷酸探针的设计原则为：根据MITOMAP数据库报道的32种LHON相关mtDNA突变位点和11719G>A多态性位点，参考修正版剑桥mtDNA参考序列(revisedCambridge Reference Sequence，rCRS)，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5)℃，使探针长度位于14-20bp，使每对探针所检测的基因位点位于探针序列中部或中部附近，使探针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5’端至中部区域之间以保障杂交效率。特异性寡核苷酸探针可特异性识别Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点和11719G>A多态性位点。

上述特异性寡核苷酸探针选自序列为SEQ ID NO.1～65的寡核苷酸探针中的一个或多个。

较佳的，基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO.1～65的寡核苷酸探针，该芯片可用于特异检测LHON相关的mtDNA突变和11719G>A多态性位点。

优选的，上述寡核苷酸探针的5’端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合，探针5’端加上一段15聚的Poly T，以减少杂交时的空间位阻。

上述基因芯片还可固定有阴性对照及阳性对照。阴性对照为点样液，阳性对照为所选的各寡核苷酸探针的等量混合液。

上述基因芯片载体可以为载玻片，优选醛基修饰的载玻片。

本发明第二方面，公开了上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的制备方法，包括下列步骤：

将选自序列为SEQ ID NO.1～65的寡核苷酸探针5’端加上一段15聚的Poly T，并对5’端进行氨基修饰，用去离子水将各探针分别稀释，并分别与点样液等体积混合，获得终浓度为12.5～50uM的寡核苷酸探针溶液，采用常规的方法将寡核苷酸探针溶液与阴性对照和阳性对照一起点阵于载玻片表面并固定。

上述点样液的作用在于优化芯片制作的质量，可选用各种市售或自行配置的点样液。

本发明的第三方面，公开了上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的使用方法，包括下列步骤：

1)收集患者外周血，抽取样本DNA；

2)样本DNA的PCR扩增和标记：以样本DNA为模板，选择合适引物PCR扩增并标记待测的突变相关序列；

3)采用前述基因芯片于样本PCR产物变性后进行杂交检测：将样本PCR扩增产物等体积混合后，与适量体积杂交液混合(如将样本PCR扩增产物与杂交液以1：2～1：1的体积比混合)，将与杂交液混匀后的PCR产物变性，取适量体积滴在芯片的点阵区进行杂交，杂交后用洗液洗涤，再检测标记信号的强度。通过检测标记信号的强度比对，可判断是否发生相应突变。

上述杂交液为常规用于核酸杂交反应的杂交液，可选用各种市售或自行配置的杂交液。

上述杂交液溶解后的PCR扩增产物变性可采用常规的变性方法，如95℃变性。

洗液用于将未完全匹配的PCR扩增产物从芯片上除去，可选用本领域常规的用于核酸杂交的洗液。

较佳的，上述步骤3中，杂交温度为35-40℃；杂交时间为30-60分钟。

洗液洗涤时，先用一次洗液洗5-15分钟，再用二次洗液洗5-15分钟。优选的，一次洗液为2xSSC+0.1w％SDS(以洗液总重量为基础计)；二次洗液为0.2xSSC+0.1w％SDS；一次洗脱条件为30℃洗涤10分钟；二次洗脱条件为30℃洗涤5分钟。

改进的，上述步骤2中的引物选自序列为SEQ ID NO.66～87的核苷酸序列。每对正反引物中，至少有一个被标记，标记可采用常规的标记，如荧光标记等，本发明实施例中使用了Cy5荧光分子标记，并使用激光共聚集扫描仪扫描荧光信号强度。

更佳的，上述步骤2中的PCR扩增为多重PCR扩增：将序列为ID NO.66～71、ID NO.72～79、ID NO.80～87的核苷酸序列分别作为三组多重PCR的引物，在同一热循环下以样本DNA为模板进行PCR扩增。

本发明的第四方面，公开了上述检测Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片在制备Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试剂盒中的应用。

本发明第五方面，公开了一种Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的检测试剂盒，包括上述基因芯片，及Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物。

较佳的，上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物为选自序列为SEQ ID NO.66～87的核苷酸序列中的一个或多个。

优选的，上述Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点的PCR扩增引物为SEQ IDNO.66～87的核苷酸序列。各引物可分别独立包装。

试剂盒中还可包括其他在试剂盒使用过程中需用到的常规试剂，如杂交液、核酸杂交洗液等。较佳的，上述洗液包括一次洗液和二次洗液，其中一次洗液为2xSSC+0.1w％SDS；二次洗液为0.2xSSC+0.1w％xSDS。

本发明的基因芯片可用于检测Leber氏遗传性视神经病变相关的mtDNA突变位点，可一次同时检测32种mtDNA突变位点。优选方案仅需1次PCR扩增和1次杂交反应，即可特异性检测临床样本中32种与Leber氏遗传性视神经病变相关的突变位点。本发明的基因芯片具有省时、费用低廉和操作简便等优点，从样本制备到PCR扩增，得到检测结果，可在6—8小时内完成，大大缩短了对患者的诊断时间，可以对临床上疑似Leber氏遗传性视神经病变患者的mtDNA进行初步筛查，以确定有无已知突变体，从而为疾病的治疗或遗传学咨询提供一定的线索，具有较好的临床推广价值。本发明的基因芯片还具有很高的灵敏度和特异性，与传统分子生物学方法相比，检测时间大大缩短，达到LHON临床诊断与鉴别诊断的目的。

附图说明

图1 芯片点样布阵图，P为阳性对照，成份为SEQ ID NO.1～65探针的等量混合物，N为阴性对照，成份为点样液。

图2 P1-11778G>A均质性突变体芯片检测与DNA测序结果

图3 P2-11778G>A异质性突变体芯片检测与DNA测序结果

图4 P3-3460G>A和3394T>C均质性突变体芯片检测与DNA测序结果

图5 P4-14484T>C均质性突变体芯片检测与DNA测序结果

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1  探针设计和芯片的制备

(1)芯片上探针的设计：

根据MITOMAP数据库报道的32种LHON相关mtDNA突变位点和11719G>A多态性位点，参考修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)，设计并筛选获得33对寡核苷酸探针，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5)℃，使探针长度位于14-20bp，使每对探针所检测的基因位点位于探针序列中部或中部附近，使探针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5’端至中部区域之间以保障杂交效率。探针的5’端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合；不同探针的综合参数(探针长度、GC％及Tm值)尽量接近，为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在33对探针的寡核苷酸5’端加上一段15聚的Poly T(连接臂)。阳性对照探针选取各个探针的等量混合物，阴性对照探针选取点样液。检测系统和平行对照的33对探针如表1所列：

表1 检测系统和平行对照氨基修饰探针

(2)芯片的制备：

点样液：为Micro-Spotting Solution(2×)，购自TeleChem Internation公司，室温保存。

探针由Takara公司负责合成，用去离子水将探针稀释，并与点样液等体积混合，使探针终浓度为12.5uM，通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，检测系统和平行对照的每个探针平行点3个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48-72小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存，即制成了检测Leber氏遗传性视神经病变32种相关突变的基因芯片，芯片点样布阵图见图1。

实施例2 样本的突变检测

(1)样本的制备、标记和处理：

用Qiagen公司DNA抽提试剂盒提取Leber氏遗传性视神经病变患者或疑似患者样本DNA，备用。

样本的PCR扩增和标记处理：在同一热循环下，通过三组多重PCR(将序列为ID NO.66～71、ID NO.72～79、ID NO.80～87的核苷酸序列分别作为三组多重PCR的引物)来扩增11条靶基因，这11条靶基因涵盖与Leber氏遗传性视神经病变相关的32个mtDNA突变位点和11719G>A多态性位点。在25ul PCR反应体系中(扩增体系包括2.5ul 10*PCR buffer，各200uM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.5mM MgCl₂，1.5U DNA TagE(Takara)，和介于0.05-0.5uM之间不等的引物，每个反应中加入100ng样本DNA，通过以下热循环过程制备11条荧光标记的样本DNA目的片段：首先在94℃变性5min，以94℃，35s，61℃，55s，72℃，90s循环35次，最后在72℃延伸10min。上述PCR引物由Takara公司合成，其中，每对正向引物和反向引物中至少有一条引物的5’端加cy5荧光分子标记，引物序列如表2所列。

表2 PCR引物

注：F表示正向引物，R表示反向引物。

从三组多重PCR扩增产物中分别取10μl，与30ul杂交液混匀，作为芯片杂交用靶基因。

(2)杂交反应和信号检测

取实施例2步骤(1)的芯片杂交用靶基因15ul，95℃变性10min，迅速冰浴3-5min，取10ul变性后的芯片杂交靶基因滴于实施例1制备的检测Leber氏遗传性视神经病变32种相关突变的基因芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于37℃湿盒中杂交45min，然后30℃于洗液1(2×SSC，0.1％SDS)中荡洗10min，再于洗液2(0.2×SSC，0.1％SDS)中荡洗5min，氮气吹干。用激光共聚集扫描仪(GenePi x 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描前述洗脱并干燥后的杂交芯片，扫描强度设为700(最大为920)；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。配合其配套软件分析，最终获得芯片检测结果。以诊断比值(野生型探针信号强度平均值与相应位点突变型探针信号强度平均值的比值)作为分析突变是否存在的标准，如果诊断比值在3以上为野生型，在0.3以下为均质性突变，介于0.3和3之间为异质性突变。(比值衡量标准参考Du W，Marsac C，Kruschina M，Ortigao F，Florentz C.Functionalized self-assembled monolayer on gold fordetection of human mitochondrial tRNA gene mutations.Anal Biochem，2003，322(1)：14-25获得)

用实施例1制备的检测Leber氏遗传性视神经病变32种相关突变的基因芯片分别对20例健康对照和12例Leber氏遗传性视神经病变患者按上述方法进行检测：各健康对照均未检测到32种相关突变；12例患者中8例检测到11778G>A均质性突变，1例检测到11778G>A异质性突变，1例同时检测到3460G>A和3394T>C均质性突变，1例检测到14484T>C均质性突变；所有健康对照和患者均检测到11719G>A单核苷酸多态性。芯片检测结果与DNA测序结果完全吻合。

4例含不同突变体患者样本芯片扫描图示例和相应突变位点DNA测序结果如图2-5所示，对应位点的芯片诊断比值如表3所列：

表3 突变诊断比值

w/m指野生型探针荧光信号强度平均值与相应位点突变。

实施例3 试剂盒的组装

按实施例1制备基因芯片，将实施例2记载的SEQ ID NO.66～87的PCR引物分装，与制得的基因芯片、杂交液、核酸杂交洗液组配后包装制得试剂盒。

序列表

<110>安徽医科大学中国科学院上海微系统与信息技术研究所

<120>Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用

<130>PCNWX081297

<160>87

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>探针

<400>1

<210>2

<211>19

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<223>探针

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<210>3

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<223>探针

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<210>4

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