抑制剂对肿瘤细胞增殖抑制效果的评价方法及敏感性的判断方法

摘要

一种受体酪氨酸激酶抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果的评价方法，包括：制备步骤，从肿瘤细胞分离由细胞质制备含受体酪氨酸激酶的试样；处理步骤，用抑制剂对试样进行处理；接触步骤，让经处理的试样中的受体酪氨酸激酶同受体酪氨酸激酶基质接触，利用受体酪氨酸激酶活性使所述基质磷酸化；检测步骤，检测磷酸化的基质；测定步骤，根据检测结果测定处理过的试样中的受体酪氨酸激酶活性值；评价步骤，根据活性值评价抑制剂对所述肿瘤细胞的增殖抑制效果。本发明还公开了一种判断肿瘤细胞对受体酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的方法和一种抑制肿瘤细胞受体酪氨酸激酶活性的化合物的筛查方法。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种根据受体酪氨酸激酶的活性评价受体酪氨酸激酶抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果的方法。本发明还涉及一种根据受体酪氨酸激酶的活性判断肿瘤细胞对受体酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的方法。本发明还涉及一种根据受体酪氨酸激酶的活性筛查化合物的方法。

背景技术：

存在于细胞膜上的跨膜型酪氨酸激酶(以后称受体酪氨酸激酶)在细胞增殖、细胞存活、细胞分化和血管生成等方面发挥着重要作用。比如，已知受体酪氨酸激酶有许多关系到细胞癌变的物质，其表达量异常和酶活性异常会引起细胞的癌变。具体地说，有胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor；IGFR)在肿瘤细胞过剩表达的报告。已知人表皮生长因子受体(human epithelial growth factor receptor；HER)中，HER1主要在肺癌活性升高，HER2主要在乳癌活性升高。

以癌症等与受体酪氨酸激酶相关的疾病的研究和治疗为目的，对抑制受体酪氨酸激酶活性的抑制剂的研发正在进行。比如，N Osherov等文献(N Osherov et.al.，Selective inhibition of the epidermal growth factor andHER2/neu receptors by tyrphostins，Journal of Biological Chemistry，May1993，Vol.268，p11134-11142)正在讨论受体酪氨酸激酶抑制剂(tyrphostin)对HER1和HER2的阻断作用。

N Osherov等文献记述的确认抑制作用的第一个方法是检测HER1或HER2自我磷酸化的方法。具体而言，溶解细胞，离心处理，提取膜提取物。将此膜提取物和EGF预培养，然后将膜提取物和含[³²P]-ATP和抑制剂的反应混合液混合。将所得混合液用来SDS-PAGE电泳，分离蛋白质，然后通过放射自显影术检测由于自我磷酸化而摄取了³²P的HER1或HER2的显影带。    

N Osherov等文献中，还记述了不同于第一方法的第二方法，即磷酸化基质(Poly-Gu4-Tyr1)检测方法。根据这一方法，细胞先溶解，离心处理，取上清。此上清和EGF预培养后，上清中的HER1或HER2用抗HER1胞外域单克隆抗体结合的朊A琼脂糖凝胶球进行免疫沉降。免疫沉降所得沉淀物与含[³²P]-ATP、抑制剂和作为基质的Poly-Gu4-Tyr1的反应混合液混合、培养。培养后，去沉淀物，取上清。此上清液中含被³²P磷酸化的Poly-Gu4-Tyr1。将上清涂敷于Whatman 3MM纸带，测定其放射能来检测被³²P磷酸化的Poly-Gu4-Tyr1。

N Osherov等文献中，用此种方法分别确认了对HER1的抑制作用和对HER2的抑制作用。

在讨论在癌症治疗中有效的抑制剂时，抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果和肿瘤细胞对抑制剂的敏感性是非常有用的信息。

然而，在调查抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果和肿瘤细胞对抑制剂的敏感性时，仅凭N Osherov等文献介绍的分别确认对各个受体酪氨酸激酶的抑制作用是不够的。因为患者的肿瘤细胞细胞膜中存在多种受体酪氨酸激酶。而且受体酪氨酸激酶中有因形成异型二聚体而激活的物质。加之，抑制剂不一定只对一种受体酪氨酸激酶起作用。因此，人们期望开发一种新的技术能够根据抑制剂对肿瘤细胞的各种受体激酶的影响，调查抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果和肿瘤细胞对抑制剂的敏感性。

发明内容：

本发明提供一种受体酪氨酸激酶抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果的评价方法，包括：

制备步骤，从肿瘤细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样；

处理步骤，用所述抑制剂对所述试样进行处理；

接触步骤，让经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶同至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，利用经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性使所述基质磷酸化；

检测步骤，检测所述磷酸化的基质；

测定步骤，根据所述检测结果测定所述处理过的试样中的受体酪氨酸激酶活性值；

评价步骤，根据所述活性值评价所述抑制剂对所述肿瘤细胞的增殖抑制效果。

其中所述评价步骤是将所述活性值与阈值进行比较，当活性值低于阈值时，评价为所述抑制剂对所述肿瘤细胞的增殖抑制效果高。

所述方法还包括：

分取步骤，分取所述制备步骤中制备的试样中的一部分；

第二接触步骤，让所述分取的试样中受体酪氨酸激酶与至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，通过所述分取试样中的受体酪氨酸激酶对所述基质磷酸化；

第二检测步骤，检出所述第二接触步骤中磷酸化的基质；

第二测定步骤，根据所述第二检测步骤的检出结果，测定所述分取试样中受体酪氨酸激酶的活性值；

其中，所述评价步骤根据从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值，评价所述增殖抑制效果。

其中所述评价步骤计算从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值的差，比较算出的差和阈值，当差大于阈值时，判断所述抑制剂对所述肿瘤细胞的增殖抑制效果高。

其中所述评价步骤计算从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值之比，比较算出的比和阈值，当比小于阈值时，判断所述抑制剂对所述肿瘤细胞的增殖抑制效果高。

其中所述制备步骤在缓冲液中破碎所述肿瘤细胞，将破碎的肿瘤细胞与含表面活性剂的溶液混合，取所得混合物的上清，以此制备含受体酪氨酸激酶的试样。所述表面活性剂是非离子表面活性剂。

所述受体酪氨酸激酶包含胰岛素样生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、人上皮生长因子受体或血管内皮生长因子受体。

所述基质为对特定受体酪氨酸激酶特异性高的几种基质组合在一起的基质组合或对受体酪氨酸激酶种类特异性很低的基质。所述低特异性的基质包含由含谷氨酸残基及酪氨酸残基的氨基酸序列构成的肽。

所述抑制剂通过结合到受体酪氨酸激酶的ATP结合位点来抑制受体酪氨酸激酶的活性。

本发明还提供一种判断肿瘤细胞对受体酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的方法，包括：

制备步骤，从肿瘤细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样；

处理步骤，用所述抑制剂对该试样进行处理；

接触步骤，让经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶同至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，利用经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性使所述基质磷酸化；

检出步骤，检出所述磷酸化的基质；

测定步骤，根据所述检出结果测定所述处理过的试样中的受体酪氨酸激酶活性值；

判断步骤，根据该活性值判断所述肿瘤细胞对所述抑制剂的敏感性。

其中所述判断步骤对所述活性值和阈值进行比较，若活性值低于阈值，则判断所述肿瘤细胞对所述抑制剂敏感。

所述方法还包括：

分取步骤，分取所述制备步骤中制备的试样中的一部分；

第二接触步骤，让所述分取的试样中的受体酪氨酸激酶与至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，通过所述分取试样中的受体酪氨酸激酶对所述基质磷酸化；

第二检测步骤，检出所述第二接触步骤中磷酸化的基质；

第二测定步骤，根据所述第二检测步骤的检出结果，测定所述分取试样中受体酪氨酸激酶的活性值；

其中，所述判断步骤根据从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值，判断所述敏感性。

其中所述判断步骤计算从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值的差，比较算出的差和阈值，当差大于阈值时，判断所述肿瘤细胞对所述抑制剂敏感。

所述判断步骤计算从所述分取试样获得的活性值和从经所述抑制剂处理的试样中获得的活性值之比，比较算出的比和阈值，当比小于阈值时，判断所述肿瘤细胞对所述抑制剂敏感。

所述制备步骤在缓冲液中破碎所述肿瘤细胞，将破碎的肿瘤细胞与含表面活性剂的溶液混合，取所得混合物的上清，以此制备含受体酪氨酸激酶的试样。

所述基质为对特定受体酪氨酸激酶特异性高的几种基质组合在一起的基质组合或对受体酪氨酸激酶种类特异性很低的基质。

本发明同时还提供一种抑制肿瘤细胞受体酪氨酸激酶活性的化合物的筛查方法，包括：

制备步骤，从肿瘤细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样；

处理步骤，用化合物对该试样进行处理；

接触步骤，让经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶同至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，利用经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性使所述基质磷酸化；

检出步骤，检出所述磷酸化的基质；

测定步骤，根据所述检出结果测定所述处理过的试样中的受体酪氨酸激酶活性值；

筛查步骤，根据该活性值，筛查抑制存在于肿瘤细胞细胞膜的受体酪氨酸激酶活性的化合物。

本发明提供的一种筛查抑制肿瘤细胞增殖的化合物的方法，包括：

制备步骤，从肿瘤细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样；

处理步骤，用化合物对该试样进行处理；

接触步骤，让经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶同至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，利用经所述处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性使所述基质磷酸化；

检出步骤，检出所述磷酸化的基质；

测定步骤，根据所述检出结果测定所述处理过的试样中的受体酪氨酸激酶活性值；

筛查步骤，根据该活性值，筛查抑制肿瘤细胞增殖的化合物。

附图说明：

图1为本实施方式制作的GST-poly(Glu、Tyr)基质被受体酪氨酸激酶磷酸化的检出结果。

图2为显示本实施方式使用的各种抑制剂结构式的附图。

图3为显示实施例1的结果的附图。

图4为显示比较例1的结果的附图。

图5为显示实施例2的结果的附图。

图6为显示实施例3的结果的附图。

图7为显示比较例2的结果的附图。

具体实施方式：

根据本实施方式的方法，先从细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样。细胞的细胞膜中含有各种受体酪氨酸激酶，因此，从细胞分离细胞质所得试样中，含有来源于细胞膜的受体酪氨酸激酶群。再用抑制受体酪氨酸激酶活性的抑制剂处理制备的试样。然后，让经过处理的试样中的受体酪氨酸激酶与至少二种受体酪氨酸激酶相应的基质接触，这样可以利用经过处理的试样中的受体酪氨酸激酶的活性使基质磷酸化。检出磷酸化基质，根据检出结果测定经过处理的试样中的受体酪氨酸激酶的活性值。如此获得的活性值反映了抑制剂对存在于细胞中的各种受体酪氨酸激酶的影响，并与抑制剂对细胞增殖的抑制效果有相关性。因此，当以肿瘤细胞为细胞用上述方法测定活性值时，根据所得活性值可以评价抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果。当以肿瘤细胞为细胞用上述方法测定活性值时，根据所得活性值可以判断肿瘤细胞对抑制剂的敏感性。如此取得的抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果的评价结果和肿瘤细胞对抑制剂的敏感性的判断结果在研究能有效治疗癌症的受体酪氨酸激酶抑制剂上将成为非常有用的信息。

对受体酪氨酸激酶没有特别限定，只要是存在于细胞膜的酪氨酸激酶即可。具体而言，比如可以是：胰岛素受体(insulin receptor；IR)、胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor；IGFR)、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor；PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor；FGFR)、人表皮生长因子受体(human epithelial growth factor receptor；HER)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor；VEGFR)等生长因子受体。另外，HER家族包括HER1、HER2、HER3和HER4。

受体酪氨酸激酶从细胞的细胞膜回收。细胞既可以是从生物体采集的包含在生物试样中的细胞，也可以是将采自生物体的细胞株化形成的培养细胞。具体而言，可以使用肿瘤细胞为细胞。肿瘤细胞既可以是从患者身体采集的生物标本中所含的肿瘤细胞，也可以是将采自患者身体的肿瘤细胞株化形成的培养细胞。

回收受体酪氨酸激酶的方法无特别限定，只要是从细胞分离细胞质来制备含受体酪氨酸激酶的试样的方法即可。比如，可以用以下方法回收受体酪氨酸激酶。先在适当的缓冲液(以后称均质化试剂)中破碎细胞的细胞膜。所得溶液用离心分离法分出上清和沉淀物，去上清。此上清中含有来源于细胞质的蛋白质等。沉淀物中含有固定有各种受体酪氨酸激酶的细胞膜碎片。此沉淀物与含有表面活性剂的溶液(以后称增溶剂)混合，所得混合液离心分离，得上清和沉淀物。上清含有被表面活性剂胶束化的、含各种受体酪氨酸激酶的细胞膜。沉淀物中含有不可溶的蛋白质和DNA等。以此上清为含受体酪氨酸激酶试样。在如此制备的试样中，各种受体酪氨酸激酶贯穿于碎片状的细胞膜中，该细胞膜在此状态下被表面活性剂胶束化。

众所周知，受体酪氨酸激酶会因配体结合而形成同型二聚体或异型二聚体。上述方法制备的试样在保持可形成同型二聚体或异型二聚体程度的立体结构的状态下含有受体酪氨酸激酶。因此，使用上述方法制备的试样，可以更正确地评价抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断肿瘤细胞对抑制剂的敏感性。

均质化试剂用于防止破碎细胞时受体酪氨酸激酶变性。均质化试剂的pH值范围只要在不使受体酪氨酸激酶变性或失活、能在稳定的状态下回收即可，无特别限定。作为这种pH值以4.0～9.0为宜，4.5～8.5更好，最好是5.0～8.0。均质化试剂最好含缓冲剂。作为缓冲剂比如有磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、MOPS(3-N-吗啉)丙基磺酸)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、三(羟甲基)甲基甘氨酸等。增溶剂最好也含上述缓冲剂，pH值与均质化试剂同。

另外，均质化试剂和/或增溶剂也可添加蛋白酶抑制剂、脱磷酸酶抑制剂和防止SH基氧化的试剂(以后称SH基稳定剂)等。

作为破碎细胞膜的方法只要能使细胞膜粉碎即可，无特别限定。如用反应杯反复吸吐、涡动搅拌器搅拌、捣碎机打碎、杵钵加压和超声波处理机打碎等。

增溶剂中所含表面活性剂可用于溶解(胶束化)碎细胞膜。但是，最好使用不使细胞膜所含受体酪氨酸激酶分解或变性的表面活性剂。带电的表面活性剂有可能与受体酪氨酸激酶结合，改变立体结构。因此，表面活性剂最好使用实际上不与受体酪氨酸激酶结合的非离子表面活性剂。作为这种非离子表面活性剂可用其基本结构有十二烷基醚、十六烷基醚、十八烷基醚、p-t-辛基二苯醚等活性剂。具体而言，有乙基苯基聚乙二醇P-40(NP-40、壳牌国际石油有限公司注册商标)、曲拉通X(Triton-X，联合碳化化学品及塑料有限公司注册商标)、吐温型乳化剂(ICI美国分公司注册商标)、Brij(ICI美国分公司注册商标)和Emulgen(花王注册商标)等。作为增溶剂中的表面活性剂浓度，以0.05～5％为宜，0.1～3％更好，最好是0.1～1％。

蛋白酶抑制剂可用来防止受体酪氨酸激酶被细胞中所含蛋白酶分解。作为蛋白酶抑制剂比如有：EDTA和EGTA等金属蛋白酶抑制剂、PMSF、胰朊酶抑制剂和胰凝乳朊酶等丝氨酸蛋白酶抑制剂、碘代乙酰胺和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制剂等等。这些蛋白酶抑制剂可单独使用，也可混合使用。也可使用诸如蛋白酶抑制剂混合剂(希格玛公司)这种预先将几种蛋白酶抑制剂混合好的市场销售产品。

脱磷酸酶抑制剂可用来防止受体酪氨酸激酶的酶活性被细胞中所含脱磷酸酶降低。作为脱磷酸酶抑制剂如有正矾酸钠(Na₃VO₄)、氟化钠(NaF)、冈田酸(Okadaic acid，OA)等。脱磷酸酶抑制剂可单独使用，也可几种混合使用。

SH基稳定剂可用于防止受体酪氨酸激酶失活。酶中所含SH基氧化后容易形成更稳定的二硫化物。二硫化物的形成使酶的结构发生变化，会造成酶失活。SH基的氧化可以用含有SH基的试剂来预防。作为SH基稳定剂比如有：二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、辅酶A和二氢硫辛酸等。例如，当SH基稳定剂为DTT时，均质化试剂和/或增溶剂中的SH基稳定剂浓度以0.05～2mM为宜，0.07～1.7mM更好，最好为0.1～1.5mM。例如，当SH基稳定剂为2-巯基乙醇时，均质化试剂和/或增溶剂中的SH基稳定剂浓度以0.1～15mM为宜，0.3～13mM更好，最好为0.5～12mM。

在本实施方式中，从细胞中分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样，再用抑制剂处理制备的试样。

作为抑制剂无特别限定，只要能抑制受体酪氨酸激酶活性即可。作为受体酪氨酸激酶抑制剂有与受体酪氨酸激酶的ATP位点结合的抑制剂、与受体酪氨酸激酶基质位点结合的抑制剂、与受体酪氨酸激酶胞外区(比如配体结合位点)结合的抑制剂等。作为与受体酪氨酸激酶ATP位点结合的抑制剂(以后称ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂)，如有：易瑞沙(阿斯利康公司)、格列卫(GLIVEC，NOVARTIS公司)、特罗凯(tarceva，OSI公司)、PD153035(Calbiochem公司)、AG1478(Caibiochem公司)、4557W(EGFR/ErbB-2抑制剂)(Calbiochem公司)、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)等。作为与受体酪氨酸激酶基质位点结合的抑制剂有tyrphostin(Calbiochem公司)等。作为与受体酪氨酸激酶胞外区结合的抑制剂有赫赛汀(Genentech公司)、Cetuximab(英克隆(ImClone)公司)、pertuzumab(Genentech公司)等。

关于用抑制剂对试样进行处理没有特别限定，只要能够让上述抑制剂与试样中的受体酪氨酸激酶接触即可。作为这种处理方法比如可以将抑制剂溶解到缓冲液等适当的溶液中，将该溶液与试样混合。

本实施方式对经抑制剂处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性进行测定。

测定受体酪氨酸激酶活性的方法是利用至少二种受体酪氨酸激酶基质。具体而言，让试样中的受体酪氨酸激酶与至少二种受体酪氨酸激酶基质接触，通过接触，利用经处理的试样中的受体酪氨酸激酶活性对基质磷酸化。然后检出磷酸化的基质，根据所得检出结果即可测定活性。最好将抑制剂处理过的试样与至少二种受体酪氨酸激酶基质和磷酸基供体混合在一起接触，检出被受体酪氨酸激酶活性磷酸化的基质。受体酪氨酸激酶因自我磷酸化而被激活，因自我磷酸化而激活的受体酪氨酸激酶再对基质磷酸化。然而，即使自我磷酸化也未必对基质磷酸化。因此，检出基质的磷酸化才能更准确地测定活性值。

作为至少二种受体酪氨酸激酶基质，可以将几种对特定受体酪氨酸激酶有很高特异性的基质组合起来使用。作为对特定受体酪氨酸激酶有很高特异性的基质比如可以使用：对HER1有高特异性的基质Grb2、髓鞘碱性蛋白(MBP)、组朊H2B(HH2B)、磷脂酶C-γ等。象GST-EGFR基质(Stratagene公司)这种市场出售的基质也可以作为对HER1有高特异性的基质使用。GST-EGFR基质是GST和被HER1的酶活性磷酸化的人造基质的融合蛋白质。在测定中将这种基质组合使用可以测定试样中由各种受体酪氨酸激酶组成的受体酪氨酸激酶活性。

作为至少二种受体酪氨酸激酶基质，可以使用对受体酪氨酸激酶种类特异性很低的基质。作为这种基质比如有众所周知的人为使其对受体酪氨酸激酶种类特异性降低的合成肽。如在Norio Sasaki等文献(Norio Sasaki et al，1985，The Journal of Biological Chemistry，Vol.260，No.17，9793～9804)、Sergei Braun等文献(Sergei Braun et al，1984，The Journal of Biological Chemistry，Vol.259，No.4，2051～2054)以及M.Abdel-Ghany等文献(M.Abdel-Ghany et al，1990，Proceeding of The NationalAcademy of Science，Vol.87，7061～7065)等都列举了合成肽作为受体酪氨酸激酶的基质使用的例子。这些文献公开的合成肽由含谷氨酸(以后简称为Glu)和酪氨酸残基(以后简称为Tyr)的氨基酸序列组成，Tyr是由二种以上酪氨酸激酶磷酸化的人造的合成肽。上述氨基酸序列具体而言可举出以下序列。

由四个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称氨基酸序列a)；

由一个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称氨基酸序列b)；

由六个Glu、一个Tyr和三个氨基丙酸残基(以后略称为Ala)组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称氨基酸序列c)；

由一个Glu、一个Tyr和一个Ala组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称氨基酸序列d)；

由二个Glu、一个Tyr、六个Ala和五个赖氨酸残基(以后略称为Lys)组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称氨基酸序列e)。

在Hunter文献(Tony Hunter，1982，The Journal of Biological Chemistry，Vol.257，No.9，4843～4848)中有酸性氨基酸残基对酪氨酸激酶磷酸化Tyr很重要的报告。因此，含有大量酸性氨基酸残基Glu的氨基酸序列a和氨基酸序列c特别理想。在测定中使用这种氨基酸序列构成的基质可以测定由试样中所含各种受体酪氨酸激酶构成的受体酪氨酸激酶活性值。

另外，要想更准确地评价抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果、判断肿瘤细胞对抑制剂的敏感性，最好测定由尽可能多种类的受体酪氨酸激酶构成的受体酪氨酸激酶活性值。因此，最好使用上述对受体酪氨酸激酶种类特异性低的基质。

在受体酪氨酸激酶催化的酶活性中，磷酸基供体的磷酸基是被自我磷酸化激活的受体酪氨酸激酶的酶活性带入基质的。作为磷酸供体如有：腺苷三磷酸(ATP)、ATP-γS、32P标记的核苷酸(γ-〔32P〕-ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷单磷酸(AMP)等。

基质最好有亲和标记。可以用有亲和标记和可与亲和标记结合的结合物的固相(以后称固相)回收基质。具体而言，回收有亲和标记的基质与固相结合的复合物，分离回收的复合物上的亲和标记和有固相的结合物之间的结合，最终回收基质。

亲和标记只要是能够与结合物结合、不妨碍基质与受体酪氨酸激酶的结合和基质的磷酸化即可，无特别限定，比如可用多肽、半抗原等。具体而言，作为亲和标记可以使用谷胱苷肽转移酶(以下称GST)、组氨酸、麦芽糖结合蛋白质、FLAG肽(希格玛公司)、Myc标记、HA标记、Strep标记(IBA股份有限公司)、生物素、抗生朊和链亲和素等。

作为有亲和标记的基质比如可以使用基质和亲和标记的融合蛋白质。作为融合蛋白质既可以使用亲和标记和基质的结合物，也可以将含有表达基质和亲和标记的融合蛋白质的重组基因的载体导入宿主细胞，使用宿主细胞产生的融合蛋白质。

对于结合物没有特别限定，只要能与亲和标记结合并可再分离即可，如有：谷胱甘肽、镍、直链淀粉、FLAG抗体(希格玛公司)、Myc抗体、红血球凝聚素(HA)抗体、Strep-Tactin(IBA GmbH公司)等。

固相只要是能与结合物结合的载体即可，无特别限定。作为固相的材质，如有多糖类、塑料、玻璃等。固相的形状如微球、凝胶等。作为固相的具体举例，如有琼脂糖凝胶球、琼脂糖球、磁性微球、玻璃微球、硅凝胶等。也可将上述微球和凝胶填充到柱中使用。

作为亲和标记与固相的组合，举例如下：

当选择GST为亲和标记时，固相可以用谷胱苷肽琼脂糖凝胶球(以下称谷胱苷肽球)。此时，让被受体酪氨酸激酶的酶活性磷酸化的GST-基质与谷胱苷肽凝胶球结合，回收与GST-基质结合的谷胱苷肽凝胶球，在回收的谷胱苷肽凝胶球中添加还原型谷胱苷肽，则得以分离GST与谷胱苷肽凝胶球的结合。以此得以回收磷酸化的GST-基质。

回收磷酸化的GST-基质时，可预先让GST-基质与谷胱苷肽凝胶球结合，再用于酶反应，也可在酶反应后再让GST-基质与谷胱苷肽凝胶球结合。

如果选择组氨酸作为亲和标记，则固相可以用镍琼脂糖球。组氨酸与镍的结合比如可以用Glycine-HCl等酸和咪唑分离。

若选麦芽糖结合蛋白质作为亲和标记，则固相可以用直链淀粉磁球。麦芽糖结合蛋白质与直链淀粉的结合可以添加游离的直链淀粉来分离。

如果选FLAG肽作为亲和标记，则固相可以用希格玛公司的FLAG亲和凝胶。FLAG肽与FLAG亲和凝胶的结合比如可以用Glycine-HCl等酸和3×FLAG肽(希格玛公司)来分离。

如果选Myc标记作为亲和标记，则固相可以用结合了Myc抗体的琼脂糖球，如果选择HA标记，则可以用结合了HA抗体的琼脂糖球。Myc标记和Myc抗体的结合、HA标记和HA抗体的结合比如都可以通过添加酸和碱使蛋白质变性来使之分离。此时，最好选择可以将变性的蛋白质还原的酸或碱，具体而言，如酸可用盐酸等，碱可用苛性钠等。

如果选择Strep标记作为亲和标记，则固相可以用IBA GmbH公司的Strep-Tactin固相凝胶层析柱。Strep标记和Strep-Tactin的结合比如可以用与链亲和素可逆性反应的脱硫生物素来分离。

在让试样中的受体酪氨酸激酶与基质发生酶反应后，回收基质前可用加热处理、冷却处理或EDTA等停止酶反应。在基质回收步骤中，酶反应会一直进行下去，这有可能造成各个试样的测定结果参差不齐。在回收基质前停止酶反应，可以避免出现这种情况。

为了检出磷酸化基质，要使用标记物。作为标记物如有荧光物质、酶、放射性同位素等，但不限于此。作为荧光物质如有荧光素、香豆素、曙红、菲绕啉、芘、若丹明等。作为酶如有碱性磷酸酶、过氧化物酶等。作为放射性同位素如有32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S等。

要检出磷酸化基质，需要让标记物结合到磷酸化基质。比如通过使用有标记物且可与磷酸化基质特异性结合的抗体就可以让标记物结合到磷酸化基质。

或者通过使用可与磷酸化基质特异性结合的抗体(以后称磷酸化基质识别抗体)和可与磷酸化基质识别抗体结合且有标记物的抗体(以后将可与磷酸化基质识别抗体结合的抗体称为二次抗体)，让标记物与磷酸化基质结合。此时，通过磷酸化基质识别抗体和二次抗体，可以实际上让标记物结合到磷酸化基质。

或者通过使用磷酸化基质识别抗体、有生物素的二次抗体和有标记物的抗生朊也可以让标记物与磷酸化基质结合。此时，通过磷酸化基质识别抗体、二次抗体、生物素和抗生朊，可以使标记物实际上与磷酸化基质结合。抗体有抗生朊、生物素有标记物也可。

或者也可使用含有生物素的磷酸化基质识别抗体和有标记物的抗生朊。也可用有抗生朊的磷酸化基质识别抗体和有标记物的生物素。

通过检测标记物就可检出磷酸化基质，以此最终测定受体酪氨酸激酶活性。

上述磷酸化基质识别抗体和二次抗体可以使用让抗原接触动物促进免疫、提炼该动物血液获得的抗体、重组基因获得的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体等。也可以将这些抗体中至少二种混合使用。此处所谓抗体也包括抗体的碎片及其诱导体。作为抗体的具体举例如：Fab碎片、F(ab’)碎片、F(ab)2碎片、sFv碎片等(Blazar et al.，1997，Journal of Immunology，159：5821-5833和Bird et al.，1988，Science，242：423-426)。抗体的类型可以使用IgG、IgM等，但不限于此。

检出磷酸化基质的方法可根据标记物种类适当选择。当标记是荧光物时，可选择免疫印迹法检测基质的磷酸化。用转印膜分离磷酸基质，加磷酸基质识别抗体使其与磷酸化基质结合，再加有荧光物的二次抗体与磷酸化基质识别抗体结合，检出磷酸化基质的荧光即可。当用上述亲和标记事先分离了磷酸化基质时，也可用Slot印迹法取代免疫印迹法检测基质的磷酸化。作为标记物，也可用酶取代荧光物。如果使用酶，则加基质，使有二次抗体的酶变色，检出该变色即可。

将含磷酸化基质的溶液装入试管，加入有荧光物的磷酸化基质识别抗体与磷酸化基质结合，测定荧光强度，以此也可检出基质的磷酸化。

如果标记物是酶，则可以用酶联免疫吸附实验(以后称ELISA法)检测基质的磷酸化。ELISA法包括直接吸附法和夹心法。

直接吸附法是将磷酸基质吸附于固相载体的表面，加含酶的磷酸化基质识别抗体，与磷酸化基质结合。然后，加入基质，让含有磷酸化基质识别抗体的酶变色，检测该变色即可。

夹心法是让磷酸化基质识别抗体结合到固相(以后称固相抗体)，加入磷酸化基质，与固相抗体结合。再加入含有酶的磷酸化基质识别抗体(以后称标记抗体)，与磷酸化基质结合。加基质让含有标记抗体的酶变色，检测该变色即可。

比如当酶为碱性磷酸酶时，可以四唑硝基蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)混合液为基质催化反应，使其变色。如果酶是过氧化物酶(PO)，则可以盐酸联苯胺(DAB)为基质反应，使其变色。

运用夹心法时，固相抗体和标记抗体最好结合到磷酸化基质的不同位点。即，最好磷酸化基质有多个抗体结合位点，或者所用二种抗体识别磷酸化基质的不同抗原决定基。

如果标记物为放射性同位素，则可以用放射免疫分析法(以后称RIA)检测基质的磷酸化。具体而言，可以将有放射性同位素的磷酸化基质识别抗体结合到磷酸化基质，用闪烁计数器等测定放射线，检测基质的磷酸化。

如上所述，本实施方式的方法是测定试样中由各种受体酪氨酸激酶组成的受体酪氨酸激酶活性。而且，所得活性值反映抑制剂对存在于细胞中的各种受体酪氨酸激酶的影响，且与抑制剂对细胞的增殖抑制效果有相关性。因此，用上述方法以肿瘤细胞为细胞测定活性值，根据所得活性值可以评价抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果。用上述方法以肿瘤细胞为细胞测定活性值，根据所得活性值可以判断肿瘤细胞对抑制剂的敏感性。

抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果可以根据用上述方法测得的经抑制剂处理的试样中受体酪氨酸激酶的活性值加以评价。具体而言，通过比较所得活性值和所设阈值，可以评价增殖抑制效果。比如，如果所得活性值小于阈值，则可评价增殖抑制效果高。若所得活性值大于阈值，则可评价增殖抑制效果低。

也可以测定经抑制剂处理的试样中所含受体酪氨酸激酶的第一活性和未经抑制剂处理的试样中所含受体酪氨酸激酶的第二活性，根据所得第一活性和第二活性评价增殖抑制效果。具体而言，比较第一活性值和第二活性值，当确认第一活性值有意义低时，可以评价增殖抑制效果高。当没有确认第一活性值有意义低时，则评价增殖抑制效果低即可。第一活性值的有意义低比如可以通过计算第一活性值和第二活性值的差或比，将所得差或比与所设阈值进行比较加以确认。比如当第一活性值和第二活性值的差大于阈值时，则视为可确认第一活性值有意义低下，从而评价增殖抑制效果高。若差小于阈值，则视为没有确认第一活性值有意义低下，从而评价增殖抑制效果低。如果第一活性值和第二活性值的比小于阈值，则视为可确认第一活性值有意义低下，从而评价增殖抑制效果高。若比大于阈值，则视为没有确认第一活性值有意义低下，从而评价增殖抑制效果低。

同样，肿瘤细胞对抑制剂的敏感性也可以根据上述方法测得的经抑制剂处理的试样中所含受体酪氨酸激酶的活性值来判断。具体而言，通过比较所得活性值和所设阈值即可评价敏感性。比如，如果所得活性值小于阈值，即可判断肿瘤细胞对抑制剂敏感。若所得活性值大于阈值，即可判断肿瘤细胞对抑制剂不敏感。

也可以测定经抑制剂处理的试样中所含受体酪氨酸激酶的第一活性值和未经抑制剂处理的试样中所含受体酪氨酸激酶的第二活性值，根据所得第一活性和第二活性判断敏感性。具体而言，如比较第一活性值和第二活性值，如果确认第一活性值有意义低下，则判断肿瘤细胞对抑制剂敏感。若未确认第一活性值有意义低下，则判断肿瘤细胞对抑制剂不敏感。第一活性值的有意义低下比如可以通过计算第一活性值和第二活性值的差或比，将所得差或比与所设阈值进行比较加以确认。比如当第一活性值和第二活性值的差大于阈值时，则视为已确认第一活性值有意义低下，从而判断肿瘤细胞对抑制剂敏感。若差小于阈值，则视为没有确认第一活性值有意义低下，从而判断肿瘤细胞对抑制剂不敏感。如果第一活性值和第二活性值之比小于阈值，则视为确认第一活性值有意义低下，即可判断肿瘤细胞对抑制剂敏感。若比大于阈值，则视为没有确认第一活性值有意义低下，即可判断肿瘤细胞对抑制剂不敏感。

用上述方法获得的活性值反映了抑制剂对存在于细胞的各种受体酪氨酸激酶的影响，与抑制剂对细胞增殖的抑制效果有相关性。因此，从另一角度看，用本实施方式的方法可以筛查抑制肿瘤细胞受体酪氨酸激酶活性的化合物。具体而言，  先从肿瘤细胞分离细胞质，制备含受体酪氨酸激酶的试样。所得试样用候补化合物处理。通过让处理过的试样中的受体酪氨酸激酶与至少应对二种受体酪氨酸激酶的基质接触，利用处理过的试样中的受体酪氨酸激酶的活性对基质进行磷酸化。检测磷酸化基质，根据检出结果测定经处理的试样中的受体酪氨酸激酶的活性。根据所得活性值，可以筛查抑制存在于肿瘤细胞细胞膜的受体酪氨酸激酶活性的化合物。根据与上述筛查方法同样取得的活性值可以筛查抑制细胞增殖的化合物。如上所述，已知受体酪氨酸激酶表达量异常和酶活性异常会引起细胞癌变，且易瑞沙等受体酪氨酸激酶抑制剂已经作为抗癌药加以利用。因此，上述筛查方法在抗癌药的研制中可以用于寻找有望作为抗癌药的化合物。

可以将用于上述测定的试剂类作成试剂盒。该试剂盒具有：对应于受体酪氨酸激酶的基质、含被受体酪氨酸激酶活性导入基质的磷酸基的磷酸基供体及可与导入磷酸基的基质结合并发出可检信号的标记物。上述成份既可放在同一容器中，也可以将至少一种成份装入另一个容器。最好将基质和含有磷酸基供体的试剂放入第一容器，将含有标记物的试剂放在第二容器中。当标记物由可与基质结合的一次抗体和可与一次抗体结合、含有标记物的二次抗体组成时，这些一次抗体和二次抗体最好分别放置于不同容器。如果在测定中用抑制剂处理试样，也可在上述试剂中添加处理试样的抑制剂。还可让上述试剂含有调整pH的缓冲液。缓冲液可以使用前述溶液。试剂盒也可具备均质化试剂和/或增溶剂。

下面就本发明的方法用实施例更具体地加以说明。本发明不限于这些实施例。

以下实施例使用了对受体酪氨酸激酶种类特异性很低的基质。首先说明基质的制作方法。

1.酪氨酸激酶的基质的制作

将由四个谷氨酸残基和一个酪氨酸残基构成的序列重复5次而形成的氨基酸序列(序列号1)构成的肽(以后称Poly(Glu、Tyr)肽)和GST融合，制作融合蛋白质。用制作的融合蛋白质作为可被受体酪氨酸激酶磷酸化的基质。以后称此融合蛋白质为GST-Poly(Glu、Tyr)基质。

GST-Poly(Glu、Tyr)基质用以下方法制作。用对Poly(Glu、Tyr)肽氨基酸序列(序列号1)编码的DNA(序列号2)、以此DNA的碱基序列为基础设计的上游引物(序列号3)和下游引物(序列号4)及KODplusDNApolymerase(东洋纺株式会社)进行PCR。将PCR所得扩增产物(以后称Poly(Glu，Tyr)DNA)和作为GST融合蛋白质表达用质粒载体的pGEX-4T-3(通用电气医疗生物科学株式会社)用限制酶(BamH1和EcoR1)处理。将Poly(Glu，Tyr)DNA导入pGEX-4T-3，制得重组质粒。将此重组质粒转换为大肠菌JM109。在液体培养基(LB培养基)中培养所得大肠菌至培养液吸光度(600nm)达0.6。在培养的大肠菌中添加1mM IPTG(培养液中的浓度)培养4小时，诱导表达。对大肠菌进行溶菌处理后，用谷胱甘肽琼脂糖4B(通用电气医疗生物科学株式会社)回收GST-Poly(Glu、Tyr)基质。将此GST-Poly(Glu、Tyr)基质的氨基酸序列标为序列号5。

接下来，确认制作的GST-Poly(Glu、Tyr)基质被各种受体酪氨酸激酶磷酸化。

2.GST-Poly(Glu、Tyr)基质的磷酸化检测

用市场销售的受体酪氨酸激酶的胞内区(intracellular domain(ICD))对GST-Poly(Glu、Tyr)基质进行磷酸化处理。用免疫印迹法检出磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质。受体酪氨酸激酶由胞外区、跨膜区和胞内区(ICD)三部分组成，胞内区有显示酪氨酸激酶活性的位点。

(反应试样的制备)

将50μl缓冲液1(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl₂、1％NP40、1mM DTT、0.2％蛋白酶抑制剂(以后称PI)、10％甘油、200μM Na₃VO₄和50mM NaF)和市面上销售的受体酪氨酸激酶ICD 0.5pmol混合，以所得混合液为反应用试样用于以下酶反应。在此，作为ICD使用：血小板衍化生长因子-β受体激酶(以后称PDGFR-β激酶)、血管内皮细胞生长因子受体1激酶(以后称VEGFR1激酶)、血管内皮细胞生长因子受体2激酶(以后称VEGFR2激酶)、表皮生长因子受体1激酶(以后称HER1激酶)、表皮生长因子受体2激酶(以后称HER2激酶)、表皮生长因子受体4激酶(以后称HER4激酶)、胰岛素样生长因子1受体激酶(以后称IGF1R激酶)(全部为Cell Signaling Technology(CST)公司产品)。以缓冲液1和PDGFR-β的混合液为反应用试样i。以缓冲液1和VEGFR1的混合液为反应用试样ii。以缓冲液1和VEGFR2的混合液为反应用试样iii。以缓冲液1和HER1的混合液为反应用试样iv。以缓冲液1和HER2的混合液为反应用试样v。以缓冲液1和HER3的混合液为反应用试样vi。以缓冲液1和IGF1R的混合液为反应用试样vii。

(酶反应)

将25μl反应用试样i和25μl含有GST-Poly(Glu、Tyr)基质的基质溶液1(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na₃VO₄、50mM NaF、40μM ATP和5μg GST-Poly(Glu、Tyr)基质)混合，25℃培养60分钟。在该反应液中加入25μl SDS试样缓冲液pH6.8(含200mM Tris、40％甘油、8％SDS和10％2-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟，停止酶反应。如此制备的溶液称为SDS用试样i(+)。同样从反应用试样ii～vii制备SDS用试样ii(+)～vii(+)。

将25μl反应用试样i和25μl不含ATP的基质溶液2(含20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl₂、1mM DTT、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na₃VO₄、50mM NaF和5μg GST-Poly(Glu、Tyr)基质)混合，25℃培养60分钟。在该反应液中加入25μl上述SDS试样缓冲液，100℃煮沸5分钟，停止酶反应。如此制备的溶液称为SDS用试样i(-)。同样从反应用试样ii～vii制备SDS用试样ii(-)～vii(-)。基质溶液2除不含ATP这一点外，其余与基质溶液1成份相同。SDS用试样i(-)～vii(-)作为SDS用试样i(+)～vii(+)的阴性对照试样使用。

(磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质的检测)

将各SDS用试样注入聚丙烯酰胺凝胶(PAG Mini「第一」4/20(13W)(第一化学药品株式会社))的各个样品槽后，用电泳槽(盒式电泳槽「第一」DPE-1020(微型双相)(第一化学药品株式会社))以25mA电泳70分钟。用小型转印槽(Bio-rad伯乐公司)加100V电压1小时，将电泳分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-FL 0.45μm孔径(Millipore密理博公司))上。将此PVDF膜在4％封闭液(大日本住友制药株式会社)中封闭60分钟。再将封闭的PVDF膜在2ml一抗溶液(含0.4％封闭液和0.5μg/ml抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体4G10(upstate公司))中振荡60分钟后，用TBS-T(含25mM Tris、150mM NaCl和0.1％Tween-20)清洗三遍。再在2ml二抗溶液(含0.4％封闭液和2.7μg/ml抗鼠免疫球蛋白·兔多克隆抗体FITC标记(DAKO公司))中振荡PVDF膜60分钟，用TBS-T清洗三遍。干燥此PVDF膜，用图像分析系统(Pharos FX system(Bio-rad伯乐公司))分析，检测荧光。如此，通过免疫印迹法检测含在SDS用试样i(+)～vii(+)和SDS用试样i(-)～vii(-)中的磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质。

图1为显示免疫印迹结果的荧光照片。图中的i表示以PDGFR-β为酪氨酸激酶时的结果，ii、iii、iv、v、vi、vii分别表示各以VEGFR1、VEGFR2、HER1、HER2、HER4、IGF1R为酪氨酸激酶时的结果。在i～vii的各照片中，-为从使用不含ATP的基质溶液2制备的SDS用试样获得的结果。+为从使用含ATP的基质溶液1制备的SDS用试样获得的结果。P-ICD表示自我磷酸化的酪氨酸激酶出现的位置，P-GST-Poly(Glu、Tyr)表示磷酸化P-GST-Poly(Glu、Tyr)基质出现的位置。

在图1的所有图形(i～vii)中，磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质出现的位置上可见单一条带。由此可知，上述1制作的GST-Poly(Glu、Tyr)基质被多种酪氨酸激酶磷酸化。

图1的ii、iii、iv、vi和vii的-中，磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质出现的位置上未见带状图形。可以认为这是因为在酶反应中反应液不含ATP，GST-Poly(Glu、Tyr)基质没有被磷酸化。另一方面，图1的i和v的-中，磷酸化GST-Poly(Glu、Tyr)基质出现的位置上可见非常淡的带状。可以认为这是因为检测使用的抗体非特异结合、或在测定中使用的产品中混有微量ATP。

实例1

ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂的影响

在本例中，从培养细胞制备含受体酪氨酸激酶的反应用试样。制备的反应用试样用ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂处理。再用GST-Poly(Glu、Tyr)基质测定处理后的反应用试样中所含受体酪氨酸激酶的活性。根据所得活性值探讨抑制剂对培养细胞的酪氨酸激酶活性的抑制效果。

(反应用试样)

反应用试样由五种培养细胞(MDA-MB453、MDA-MB468、SKBr3、Hela和HT29)制备。具体来说是将培养细胞和1ml细胞处理液(含20mM HEPES pH7.4、0.2％PI、10％甘油、200μM Na₃VO₄和50mM NaF)混合，用捣杵加压破坏所得混合液的细胞膜，制备细胞溶液。离心分离所得细胞溶液，弃上清，回收沉淀物。混合回收的沉淀物和细胞膜增溶剂(含20mM HEPES pH7.4、1％NP40、0.2％PI、10％甘油、200μM Na₃VO₄和50mM NaF)。用捣杵加压取得混合液中的细胞膜，溶解该细胞膜后，离心分离，回收上清。以此上清为反应用试样。MDA-MB453是来自乳癌的培养细胞，以由此细胞制备的反应用试样为反应用试样MB453。MDA-MB468是来自乳癌的培养细胞，以由此细胞制备的反应用试样为反应用试样MB468。SKBr3是来自乳癌的培养细胞，以由此细胞制备的反应用试样为反应用试样SKBr3。Hela是来自宫颈癌的培养细胞，以由此细胞制备的反应用试样为反应用试样Hela。HT29是来自大肠癌的培养细胞，以由此细胞制备的反应用试样为反应用试样HT29。

(GST-Poly(Glu、Tyr)基质结合到ELISA板)

作为ELISA试验用板使用的是谷胱甘肽层析板(Reacti-Bind Clear Glutathione Coated Plates，8-well Strip(PIERCE公司))。首先用TBS-T(含25mM Tris、150mM NaCl和0.05％Tween-20)清洗层析板的各孔三遍。再将50μl上述1中制备的含GST-Poly(Glu、Tyr)基质的基质溶液1(5μg/ml含GST-Poly(Glu、Tyr)基质的TBS)注入各孔，边轻摇，边在25℃培养1小时。培养后各孔用TBS-T清洗二遍，再用20mM HEPES pH7.4(含0.05％Tween20)清洗一遍。如此使GST-Poly(Glu、Tyr)基质结合到ELISA板的样孔表面。用此ELISA板进行以下酶反应。

(用ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂处理)

本例使用了PD153035(Calbiochem公司)、AG1478(Calbiochem公司)、4557W(EGFR/ErbB-2抑制剂)(Calbiochem公司)、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)五种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂。PD153035是HER1和HER2的抑制剂。AG1478是HER1和HER2的抑制剂。4557W是HER1和HER2的抑制剂。PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III是PDGFR的抑制剂。VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III是VEGFR的抑制剂。各抑制剂的结构式如图2所示。

先将25μl反应用试样MB453分别注入6个试管中，其中第一个管添加25μl含400μM PD153035的处理液(20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl₂、2mM DTT、1％NP40、10％甘油、200μM Na₃VO₄、50mM NaF、400μM ATP)。第二个管添加25μl含400μM AG1478的处理液。第三个管添加25μl含400μM 4557W的处理液。第四个管添加25μl含400μM PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液。第五个管添加25μl含400μM VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液。第六个管添加25μl不含抑制剂的处理液。以如此获得的溶液为反应液。同样，用反应用试样MB468、反应用试样SKBr3、反应用试样Hela和反应用试样HT29配制反应液。并且，为了抑制受体酪氨酸激酶的酶活性，此作业在4℃以下的条件下进行。

(酶反应及磷酸化基质的检测)

将各反应液50μl注入ELISA板的各样孔，25℃培养约30分钟。培养后在各样孔中添加100μl反应停止液(含1mM EDTA的TBS-T)，再用TBS-T清洗三遍。然后用300μl StartingBlock T20(TBS)封闭液(BlockingBuffer)(PIERCE公司)清洗各样孔。用StartingBlock T20(TBS)封闭液将HRP标记的一抗(p-Tyr(PY20)，sc-508 HRP(SANTA Cruz生物技术公司))稀释1000倍，以配制一抗溶液。将配制的一抗溶液100μl注入洗净后的各样孔，25℃边轻摇边培养1小时30分钟。培养后，用TBS-T清洗五遍。清洗后在各样孔注入150μlTMB溶液(用于ELISA的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)液体基质系统(希格玛公司))，在室温遮光条件下在5～30分钟期间适当显色，用VersaMax酶标仪(美国分子仪器(Molecular Device)公司)测定吸光度(650nm)。

(结果)

根据测定结果绘制图3的雷达图。图3包含使用反应试样MB453时的雷达图、使用反应试样MB468时的雷达图、使用反应用试样SKBr3时的雷达图、使用反应用试样Hela时的雷达图和使用反应用试样HT29时的雷达图。这些雷达图显示出以未用抑制剂处理反应用试样时的测定值为100、用抑制剂处理反应用试样所得测定值的比率。在雷达图中，1为用PD153035处理反应用试样的情况，2为用AG1478处理反应用试样的情况，3为用4557W处理反应用试样的情况，4为用PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样的情况，5为用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样的情况。

从图3可以确认，五种抑制剂对来自各培养细胞细胞膜的受体酪氨酸激酶群活性的抑制效果。比如，在MDA-MB468中，受体酪氨酸激酶群活性受到PD153035、AG1478和4557W的抑制。在Hela中，则所有抑制剂都没有对受体酪氨酸激酶群产生抑制作用。SKBr3、MDA-MB453和HT29其受体酪氨酸激酶群活性受到4557W的抑制。

在图3中，五种抑制剂对受体酪氨酸激酶群活性的抑制效果在MB453、SKBr3和HT29显示类似特征，而MB468和Hela分别显示其他特征。

受体酪氨酸激酶在细胞增殖中发挥着重要作用，这是众所周知的。所以才预想抑制剂在细胞增殖中也会产生影响。在下面的比较例1中确认了抑制剂对细胞增殖的影响。

比较例1

ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂对细胞增殖的影响

对于实施例1中使用的五种培养细胞(MDA-MB453、MDA-MB468、SKBr3、Hela和HT29)，用周知的方法确认实施例1中使用的五种抑制剂对细胞增殖的影响。

(用抑制剂处理并培养细胞)

向培养板(96孔白色平底TC表面的聚苯乙烯培养板，康宁(CORNING)公司)各样孔中播撒平均每孔1000个细胞，37℃培养24小时。培养后在各孔添加抑制剂，再37℃培养3天。细胞使用实施例1使用的5种培养细胞(MDA-MB453、MDA-MB468、SKBr3、Hela和HT29)。抑制剂使用实施例1使用的5种抑制剂(PD153035、AG1478、4557W、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III)。各抑制剂浓度见表1。表1所谓最终浓度指抑制剂加入样孔与细胞混合时的浓度。

表1

    抑制剂  最终浓度(M)PD153035    1×10^-6AG1478    1×10^-64557W    1×10^-5PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-6VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-5

(细胞增殖的测定)

测定细胞增殖使用CellTiter-Glo萤光细胞活性检测系统(普洛麦格公司)。这是一种能定量来自培养基中具有代谢活性的细胞的ATP、测定生存细胞的试剂盒。首先，按照试剂盒所附配方制备测定用试剂。每一个样孔添加100μl测定用试剂，用搅拌器搅拌培养板2分钟，搅拌后，板静置10分钟，用GENios系列酶标仪(帝肯(TECAN)公司)测定荧光。荧光与来自培养基中具有代谢活性的细胞的ATP量成正比发荧光，因此，测定荧光就可以测定培养基中的生存细胞。

(结果)

根据测定结果，绘制图4所示雷达图。图4包含使用MDA-MB453时的雷达图、使用MDA-MB468时的雷达图、使用SKBr3时的雷达图、使用Hela时的雷达图和使用HT29时的雷达图。这些雷达图显示出在设未用抑制剂处理细胞时的测定值为100％时用抑制剂处理细胞所得测定值的比率。在雷达图中，1为用PD153035处理细胞的情况，2为用AG1478处理细胞的情况，3为用4557W处理细胞的情况，4为用PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理细胞的情况，5为用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理细胞的情况。

从图4可以确认五种抑制剂对各培养细胞增殖的抑制效果。比如，在MDA-MB468中，增殖受到PD153035、AG1478和4557W的抑制。在Hela中，则所有抑制剂都没有对增殖产生抑制作用。SKBr3、MDA-MB453和HT29其增殖受到4557W的抑制。

比较实施例1所得结果(图3)与比较例1所得结果(图4)可以知道，抑制剂对受体酪氨酸激酶群活性的抑制效果与抑制剂对细胞增殖的抑制效果有很高的相关性。由此得知，可以根据受体酪氨酸激酶群的活性值评价抑制剂对细胞增殖的抑制效果。

用比较例1的方法，要确认细胞增殖的抑制效果，必须用抑制剂处理细胞后再培养细胞。但是，细胞培养不仅步骤烦琐，还费时。而且实际上对从患者身上采集的细胞进行细胞培养很不容易。因此，在评价抑制剂对细胞增殖的抑制效果时，无需进行细胞培养的本实施方式的方法非常实用。

与图3同样，在图4中，五种抑制剂对细胞增殖的抑制效果在反应试样MB453、反应试样SKBr3和反应试样HT29显示类似特征，而反应试样MB468和反应试样Hela分别显示不同特征。

受体酪氨酸激酶将ATP摄入胞内区的ATP结合位点，使ATP的磷酸基移动到基质。ATP结合位点的结构因受体酪氨酸激酶的种类而各异，人们利用这一特征开发出各种ATP竞争性受体酪氨酸激酶抑制剂。实施例1中使用的ATP竞争性受体酪氨酸激酶抑制剂如图2所示，具有一般基本骨架和与之不同结构的支链结构。而且，实施例1根据支链结构的这种不同，得以确认抑制效果不同。这说明根据经抑制剂处理的受体酪氨酸激酶群的活性值，可以预测具有什么样支链结构的抑制剂对存在于细胞细胞膜中的受体酪氨酸激酶群显示抑制效果，从而对抑制剂进行筛查。由此可知，根据经化合物处理的受体酪氨酸激酶群的活性值，可以预测具有什么样结构的化合物对存在于细胞细胞膜中的受体酪氨酸激酶群显示抑制效果，从而筛查化合物。从实施例1和比较例1的结果可以看出，根据经抑制剂处理的受体酪氨酸激酶群的活性值，可以预测具有什么样支链结构的抑制剂对细胞增殖显示抑制效果，从而对抑制剂进行筛查。由此可以看出，根据经化合物处理的受体酪氨酸激酶群的活性值，可以预测具有什么样结构的化合物对细胞增殖显示抑制效果，从而筛查化合物。

比较例2

ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂对生物体内肿瘤细胞增殖的影响

确认实施例1使用的抑制剂(AG1478和4557W)对老鼠体内肿瘤细胞增殖的影响。

(老鼠体内肿瘤形成)

在培养液(含10％FBS(海克隆(Hyclone)公司)的DMEM-F12(希格玛公司))中培养实施例1中使用的MDA-MB468，使之在225cm²试剂瓶(Flask)中达到60％融合度。将所得培养细胞在100μl DMEM-F12中悬浮到约1×10⁷个，制备MDA-MB468细胞液。

在10周岁母鼠(BALB/c nu/nu)的脂肪垫(fat pad)内注射100μl MDA-MB468细胞液。确认14天后在鼠体内肿瘤变大。如此在3只鼠体内形成肿瘤。

(用抑制剂处理)

注射MDA-MB468细胞液14天后，给发生肿瘤的老鼠注射抑制剂溶液。具体而言，将实施例1使用的AG1478溶解到100μl二甲基亚砜(DMSO、希格玛公司)，配制抑制剂溶液1。向老鼠注射抑制剂溶液1，抑制剂剂量达到30mg/kg/天，连续注射7天。

将实施例1使用的4557W溶解到DMSO，配制抑制剂溶液2。与上述抑制剂溶液1同样方法向其他老鼠注射抑制剂溶液2。

为了作比较，与上述抑制剂溶液1同样方法向其他老鼠注射DMSO。

(测定肿瘤大小)

以第一次给老鼠注射抑制剂溶液的日子为注射后第一天，并在注射后第一天、第三天、第五天和第八天分别测定老鼠体内肿瘤的体积。肿瘤的体积测定肿瘤的长径和短径，假设肿瘤形状为椭圆，根据其长径和短径计算体积。

对于注射DMSO的老鼠也用上述同样方法测定肿瘤的体积。

(结果)

测定结果见图5。图5以注射后第一天的体积为1，显示第三天、第五天和第八天的体积变化。

从图5可以确认抑制剂对老鼠体内肿瘤细胞增殖的抑制效果。如比较注射DMSO的老鼠肿瘤的体积变化和注射抑制剂老鼠肿瘤的体积变化，可以确认AG1478和4557W对肿瘤细胞增殖有抑制效果。比较例2结果与实施例1的结果一致。也就是说，在实施例1中确认了对MDA-MB468的受体酪氨酸激酶群活性的抑制效果的AG1478和4557W，其对老鼠体内肿瘤细胞增殖的抑制效果在比较例2中也得到确认。由此可知，从受体酪氨酸激酶群的活性值可以评价抑制剂对生物体内肿瘤细胞增殖的抑制效果。

实施例2

二种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂组合使用的影响

本例将二种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂组合起来，对实施例1使用的反应用试样MB468进行处理。用GST-Poly(Glu、Tyr)基质测定处理过的反应用试样MB468中所含受体酪氨酸激酶群的活性值。根据所得活性值，探讨二种抑制剂组合对培养细胞的酪氨酸激酶活性的抑制效果。

(反应用试样)

使用实施例1制备的反应用试样MB468.

(ELISA板)

使用实施例1制作的ELISA用层析板进行以下酶反应.

(ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂进行处理)

本例使用实施例1使用的ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂中的AG1478、4557W、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III四种抑制剂。组合二种抑制剂时，分别将AG1478和4557W、4557W和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III、4557W和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III组合使用。

先将25μl反应用试样MB468分别注入8个试管中，其中第一个管添加25μl含400μM AG1478的处理液(20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl₂、2mM DTT、1％NP40、10％甘油、200μM Na₃VO₄、50mM NaF、400μMATP)，第二个管添加25μl含400μM 4557W的处理液，第三个管添加25μl含400μM PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液，第四个管添加25μl含400μM VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液，第五个管添加25μl含400μM AG1478和400μM 4557W的处理液，第六个管添加25μl含400μM 4557W和400μM PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液，第七个管添加25μl含400μM 4557W和400μM VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III的处理液，第八个管添加25μl不含抑制剂的处理液。以如此获得的溶液为反应液。为了抑制受体酪氨酸激酶的酶活性，此作业在4℃以下的条件下进行。

(酶反应和检测磷酸化基质)

与实施例1同样用ELISA法对各反应液测定基质的磷酸化。

(结果)

测定结果如图6所示。图6显示出当以未用抑制剂处理反应用试样MB468时的测定值为100％时用抑制剂处理反应用试样MB468所得测定值的比率。图中，2为用AG1478处理反应用试样MB468的情况，3为用4557W处理反应用试样MB468的情况，4为用PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样MB468的情况，5为用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样MB468的情况，2+3为用AG1478和4557W组合处理反应用试样MB468的情况，3+4为用4557W和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III组合处理反应用试样MB468的情况，3+5为用4557W和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III组合处理反应用试样MB468的情况。

从图6可以确认，抑制剂组合使用比单独使用，显出更高的受体酪氨酸激酶群的活性抑制效果。单独使用显示出最高的活性抑制效果的是4557W。将其他抑制剂与4557W组合使用，比4557W单独使用显示出更高的活性抑制效果。特别是PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III单独使用几乎不显示受体酪氨酸激酶群的活性抑制效果。然而和4557W组合使用，则显示出很高的活性抑制效果。

在细胞增殖的抑制效果上，预计也得出同样的结论。因此，在下面的比较例3中确认了抑制剂对细胞增殖的抑制作用。

比较例3

二种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂组合使用对细胞增殖的影响

对于培养细胞MDA-MB468，用周知的方法确认实施例2中使用的各种抑制剂对细胞增殖的影响。

(用抑制剂处理并培养细胞)

与比较例1同样，在培养板各样孔中添加抑制剂对MDA-MB468进行处理后培养。抑制剂使用实施例2使用的ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂中的四种(AG1478、4557W、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III)。各抑制剂浓度见表1。表1所谓最终浓度指抑制剂加入样孔与细胞混合时的浓度。二种抑制剂组合使用时，分别采用以下组合：AG1478和4557W、4557W和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III、4557W和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III。各抑制剂的浓度见表2。表2中所谓最终浓度指抑制剂添加到样孔与MDA-MB468混合时的浓度。

表2

抑制剂   最终浓度(M)AG1478    1×10^-64557W    1×10^-5PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-6VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-5AG14784557W    1×10^-6    1×10^-54557WPDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-5    1×10^-64557WVEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III    1×10^-5    1×10^-5

(细胞增殖的测定)

与比较例1同样测定细胞增殖。

(结果)

测定结果如图7所示。图7显示出当以未用抑制剂处理反应用试样MDA-MB468时的测定值为100％时用抑制剂处理反应用试样MDA-MB468所得测定值的比率。图中，2为用AG1478处理反应用试样MDA-MB468的情况，3为用4557W处理反应用试样MDA-MB468的情况，4为用PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样MDA-MB468的情况，5为用VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III处理反应用试样MDA-MB468的情况，2+3为用AG1478和4557W组合处理反应用试样MDA-MB468的情况，3+4为用4557W和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III组合处理反应用试样MDA-MB468的情况，3+5为用4557W和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III组合处理反应用试样MDA-MB468的情况。

通过比较实施例2所得结果(图6)和比较例3所得结果(图7)即可得知，在将二种抑制剂组合使用时，抑制剂对受体酪氨酸激酶活性的抑制效果和抑制剂对细胞增殖的抑制效果也具有很高的相关性。由此可知，根据受体酪氨酸激酶的活性值可以评价数个抑制剂组合使用对细胞的增殖抑制效果。

正如从实施例2和比较例3的结果中也可看出的一样，从抑制剂单独使用时的抑制效果预想几种抑制剂组合使用时的抑制剂的相乘效果是非常困难的。因此，在探讨几种抑制剂组合使用时，必须实际确认抑制效果。如比较例3所示，要确认细胞的增殖抑制效果，多数情况下需要在用几种抑制剂处理细胞后，进行细胞培养。但是，细胞培养既工序烦琐，又花费时间。而且，实际上用从患者身上采集细胞进行细胞培养是很不容易的。因此，在探讨几种抑制剂组合时，不需要培养操作的本实施方式的方法非常有用。

                                       序列表

<110>希森美康

<120>抑制剂对肿瘤细胞增殖抑制效果的评价方法及敏感性的判断方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>多肽poly(Glu，Tyr)氨基酸序列

<400>1

Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu

1               5                   10                  15

Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr

            20                  25

<210>2

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>基于多肽poly(Glu，Tyr)氨基酸序列的设计的DNA

<400>2

gaggaggagg agtacgaaga agaagaatat gaagaagaag aatatgaaga agaagaatat    60

gaggaggaag agtac                                                     75

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>基于多肽poly(Glu，Tyr)核苷酸序列设计的DNA

<400>3

ccggggatcc gaggaggagg agtac                                          25

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>基于多肽poly(Glu，Tyr)核苷酸序列设计的DNA

<400>4

cccggggaat tcgtactctt cttcctc                                        27

<210>5

<211>263

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>GST-poly(Glu，Tyr)融合蛋白氨基酸序列

<400>5

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

            20                  25                  30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

        35                  40                  45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

    50                  55                  60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65                  70                  75                  80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

                85                  90                  95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

            100                 105                 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

        115                 120                 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

    130                 135                 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

                165                 170                 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

            180                 185                 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

    210                 215                 220

Gly Ser Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Phe Pro Gly Arg

                245                 250                 255

Leu Glu Arg Pro His Arg Asp

            260