联合免疫基因疗法和化学疗法用于治疗癌症和过度增生性疾病

摘要

用于治疗哺乳动物癌症或过度增生性疾病的药物组合物，其包含核酸、基因递送聚合物和至少一种附加的化学治疗药，以及使用该药物组合物用于通过肿瘤内、腹膜内或全身注射治疗哺乳动物癌症或过度增生性疾病的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及用于治疗哺乳动物癌症或过度增生性疾病的包含核酸、基 因递送聚合物和至少一种附加的化学治疗药的药物组合物。本发明还涉及 治疗哺乳动物癌症或过度增生性疾病的方法，其包括通过肿瘤内、腹膜内 或全身注射将癌细胞或任何其它的过度增生性细胞与所述组合物接触。

发明背景

癌症是世界多个地方最常见的死亡原因并且每年全球诊断出超过二百 五十万个癌症病例。我们对癌症分子生物学理解的最新进展表明癌症是因 受累的细胞异常增殖所致的遗传性疾病。癌症治疗家目前专注于这样的治 疗策略，其涉及允许外源递送的基因在肿瘤环境中表达的携带遗传信息的 大分子，而非治疗性蛋白质本身。据信基因疗法以多种对于常规方法而言 不可能的方式为癌症患者提供治疗益处。常规的小分子药物通常通过与细 胞靶标非特异性地相互作用发挥功能，产生不想要的副作用并且不治疗疾 病的根本原因。过去数年已引进的蛋白质药物具有其固有局限性，原因在 于它们迅速降解和需要常常导致不想要的副作用的高剂量。基因疗法在单 次注射后使用身体自身的细胞装置以在特定组织和细胞内产生持续治疗性 水平的蛋白质，因此提供了患者愿意配合的安全和有效的治疗方法。

常用的癌症基因疗法策略包括通过1)局部注射、2)局部-区域注射或3) 全身注射实现的免疫疗法、细胞消除(cell ablation)和抗血管生成。癌症 免疫疗法是通过刺激抗癌细胞的免疫系统而对抗癌症的有效方法。免疫细 胞因子通过使免疫细胞激活、成熟和分化在宿主免疫反应发展中发挥重要 作用。已经针对人的多种癌症和癌症的动物模型测试了数种细胞因子。见 Hum Gene Ther.，1998，第9卷，2223；Gene Ther.1999，第6卷，833；Cancer Gene Ther.2000，第7卷，1156；J.Control Rel.2003，第87卷，177；和Cancer Res.，2002，第62卷，4023。白细胞介素12(IL-12)是在人癌症治疗中显示巨 大前景的免疫刺激性细胞因子。见The Oncologist，1996，第1卷，88。IL-12 是由两条共价连接的链p35和p40组成的70kD异二聚体。IL-12的生物 学效应包括通过静息和激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞以及天然杀伤 (NK)细胞诱导IFN-γ的产生。IL-12还增强激活的T细胞和NK细胞的 增殖、增加NK细胞/淋巴因子激活的杀伤细胞的裂解活性并促进特异性细 胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。

在动物模型中，已经证实重组IL-12诱导明显的T细胞介导性抗肿瘤 效应，引起已建立的肿瘤退化，随后是全身性免疫记忆。见The Oncologist， 1996，第1卷，88。然而，重组IL-12的全身施用已经在数个实验性试验和 初步人类试验中引起剂量限制性毒性。见Lab Invest.，1994，第71卷，862； Science，1995，第270卷，908；J.Interferon Cytokine Res.，1995，第14卷，335。 在最近的人临床试验中也观察到伴随腹膜内施用重组IL-12的剂量限制性 毒性。Clin.Cancer Res.，2002，第8卷，3686。可在肿瘤位置局部提供治疗 水平IL-12的基因递送方法可以具有产生抗癌反应而不引起全身毒性的优 点。

病毒性和非病毒性基因递送系统均已经在癌症动物模型中用于IL-12 基因递送。病毒性方法因对毒性担心具有严重的实用局限性，对毒性的担 心主要因为增加的癌症发生率和宿主系统对病毒抗原的强烈免疫反应。因 非病毒性基因递送系统具有较弱的毒性，故对其开发存在巨大兴趣。已经 证实使用非病毒性基因递送系统聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用于递送IL-12以 治疗肾癌(Renca)和结肠细胞癌(CT26)。见Gene Ther.，1999，第6卷，833。 当肿瘤经受该基因治疗时，肿瘤表现出IL-12蛋白质疗法的全部特征，例 如增加的NK细胞、CD4和CD8 T细胞浸润、伴随增加主要组织相容性复 合体(MHC)I类分子的表达。IL-12基因递送可良好地得到耐受并且对同时 携带Renca和CT26肿瘤的动物高度有效。排斥肿瘤的小鼠同样从随后的 攻击中受到保护，这提示存在长效的全身免疫。官能化的且毒性更低的水 溶性脂质聚合物(WSLP)已经测试用于递送IL-12基因至CT26结肠癌肿 瘤。见Mahato等，Mol.Ther.，2001，第4卷，130。IL-12质粒(pIL-12)治疗 以及WSLP(pIL-12/WSLP)治疗比裸DNA产生更高水平的肿瘤内基因表 达。

此外，细胞因子IL-12产生的次级效应，即IFN-γ和氧化氮(NO)水平 在WSLP治疗的肿瘤中与裸DNA相比较高。单次注射pIL-12/WSLP复合 体对肿瘤生长和动物存活产生次优效应，而重复递送产生更好的功效，这 表明该系统递送不充分。J.Control Release 2003，第87卷，177。类似地， 肿瘤内注射在另一种聚合物载体PAGA中的IL-12质粒仅产生CT26肿瘤 的部分抑制。见Gene Ther.，2002，第9卷，1075。这些结果确定需要更有效 的递送系统。尽管在早期的临床前试验中它们的效力不足，聚合物基因载 体出色的分子灵活性允许用于开发复杂修饰和新官能化迫切需要的更有效 的基因递送系统。

已经广泛认识到采用单一治疗策略对抗癌症通常因该疾病的多因素性 质而无效。组合多于一种药物以使抗癌反应最大化目前逐渐得到广泛应用。 见Gene Ther.，2000，第11卷，1852。已经证实IL-12基因疗法和IFN-α基 因疗法间存在协同关系。以这两种基因共治疗Renca肿瘤引起100％肿瘤 排斥，其比通过单独用IL-12(58％)或IFN-α(25％)的治疗取得的肿瘤排斥 反应更高。类似地，用联合基因疗法治疗CT26肿瘤显示50％的排斥率， 其分别比从IL-12和IFN-α单独治疗中取得的17％和0％排斥率高。通过 联合疗法治疗的肿瘤当与经单独的基因疗法处理的肿瘤相比显示对肿瘤增 加的NK细胞和CD8 T细胞浸润。将甲基鸟苷-DNA-甲基转移酶(MGMT) 基因转移至干细胞，同时进行化学疗法，保护了正常细胞免受化学疗法作 用并减少化学疗法的全身毒性。Nature Reviews Cancer 2004，第4卷，296。

此外，联合基因疗法增加肿瘤中抗原呈递细胞(APC)上的CD40分 子数至高于以单独治疗所取得的水平。APC上CD40增加的上调与抗原呈 递更高的活化状态相关。见Nature，1998，第393卷，480；Nature，1998，第393 卷，474和Nature，1998，第393卷，478。类似的增加在mRNA水平上对趋 化因子IP-10和TCA-3观察到。联合基因疗法因此协同性地增强抗肿瘤免 疫并且发现该效应在肿瘤再攻击研究中是长效的。类似的联合基因疗法研 究已经由其它小组报道。见Laryngoscope 2001，第111卷，815。建立的肿 瘤分别以pIFN-α/PVP、pIL-2/脂类或pIL-12/PVP单独处理或其组合处理。 与其它两种疗法相比，pIFN-α/PVP组合在与单独治疗相比时显著地提高 抗肿瘤效应。在另一项使用相同肿瘤模型的研究中，已经证实用 pIL-12/PVP和pIL-2/脂类的联合治疗与单独治疗相比产生显著更高的抗 肿瘤效应。见Arch.Otolaryngol Head Neck Surg，2001，第127卷，1319。

在另一项研究中，肿瘤内注射线型聚氮丙啶(PEI)与抗癌基因和促生长 素抑制素受体亚型2(sst2)的聚复合体(polyplexes)产生对胰肿瘤的生长和转 移至肺的显著抑制。Curr Opin Biotechnol，2002，第13卷，128。肿瘤中PEI 介导性递送sst2引起凋亡增加以及活化胱天蛋白酶-3和聚(ADP-核糖)途 径。持续递送DNA/PEI的聚复合体至实体瘤产生比大丸剂递送所实现的 更高表达。Gene Ther.，1999，第10卷，1659。树状聚合物(dendrimers)通过 Fas-L和HSV-I胸苷激酶的肿瘤内基因转移分别用于抑制胰癌和肝细胞 癌。见Gene Ther.，2003，第10卷，434和Gene Ther.，2000，第7卷，53。

使用细胞毒药物和细胞因子的化学-免疫疗法提供用于改善肿瘤性疾 病治疗的新方法。已经在鼠L1210白血病模型中研究了IL-12蛋白质与环 磷酰胺、紫杉醇、顺铂或阿霉素组合的治疗功效。见Int.J.Cancer，1998，第 77卷，720。单独以IL-12或上述化学治疗剂之一治疗L1210白血病产生中 度抗白血病效果。IL-12与环磷酰胺或紫杉醇的组合与单独给予这些药物 相比不引起抗白血病效果增加。然而。IL-12与阿霉素的组合增加抗白血 病效果，与此同时IL-12与顺铂的组合具有中度的增强效果。

然而在鼠黑素瘤MmB16模型中，IL-12+紫杉醇的组合比单独治疗 更有效。Cancer Lett，1999，第147卷，67。也已经检验了与亚德里亚霉素、 环磷酰胺或5-FU组合的IL-12蛋白质在MB-49膀胱癌和B16黑素瘤中的 抗肿瘤功效。见，Clin.Cancer Res.，1997，第3卷，1661。与化学疗法组合， IL-12施用增加抗肿瘤活性，而不引起额外的毒性。在通过IL-12或环磷酰 胺难以治疗的小鼠肉瘤MCA207中，重组IL-12与环磷酰胺的组合比单独 治疗产生更好的抗肿瘤反应。J.Immunol，1998，第160卷，1369。在小鼠 乳腺瘤中，包含静脉内紫杉醇化学疗法和肿瘤内IL-12基因疗法 (IL-12/WSLP)的联合疗法比单独治疗更有效。见Molecular Therapy，2004， 第9卷，829。联合疗法的益处取决于紫杉醇的递送载体。当紫杉醇制剂在 聚合物制剂中时，观察到紫杉醇和IL-12基因疗法间的协同性相互作用。 作为比较，与一种广泛用于癌症治疗的紫杉醇制剂-Cremophor EL(Taxol^)的组合没有协同性，这表明观察到的益处是制剂特异性的。

为从涉及基因疗法的联合方法中实现想要的结果，重要的是选择适宜 的基因递送系统。在前述的组合实验中所用的基因递送系统(Molecular Therapy，2004，第9卷，829)是水溶性脂质聚合物PEI-胆固醇(WSLP)。在本 发明中，我们描述结构上区别于WSLP的一类新聚合物载体(PEG-PEI-胆 固醇)，因为它含有设计旨在改善基因递送系统的药物代谢动力学、安全性 和功效的亲水聚合物和与膜相互作用的配体(例如，胆固醇)，以单独或 与化学治疗剂组合促进抗癌基因的转染活性的多种几何构型排布。肿瘤组 织中与WSLP相比的PPC的转染活性优势在图1和图2中显示。

临床上已经检验了两种化学治疗剂的组合或者化学治疗剂与细胞因子 的组合。虽然这些组合已经产生更明显的肿瘤退化，但是长期存活的益处 微不足道并且细胞毒性已经成为问题。这归咎于伴随化学疗法和重组蛋白 疗法的固有全身毒性。必须设计新的和更有效的联合方法以改善未来的癌 症治疗。在本发明中，我们描述了用于治疗癌症的新的联合方法，包括以 聚合物载体递送的基于核酸的治疗法和至少一种化学治疗剂。

发明简述

本发明提供用于癌症治疗的包含核酸、基因递送聚合物和至少一种药 剂的药物组合物。此外，本发明还提供用于通过体内(in vivo)施用包含 核酸、基因递送聚合物和至少一种药剂的药物组合物，抑制哺乳动物中肿 瘤细胞生长和转移的方法。

核酸是选自质粒DNA、siRNA、有义RNA、反义RNA和核酶中的一 员。质粒DNA是含有如此DNA序列的基因表达系统，该DNA序列编码 选自白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细 胞介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬 细胞刺激因子、抗血管生成剂、肿瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、iNOS、 p53、p16、TNF-α、Fas-配体、突变的癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细 菌抗原的抗癌或抗增殖蛋白。质粒DNA还可以编码shRNA分子，所述 shRNA分子设计为旨在抑制参与肿瘤细胞或其它过度增生性细胞生长或 维持的蛋白质。质粒DNA可以同时编码治疗性蛋白质和一种或多种 shRNA。此外，所述组合物的核酸还可以是质粒DNA与包括有义RNA、 反义RNA或核酶的合成RNA的混合物。

基因递送聚合物是阳离子型聚合物或非缩合型聚合物。阳离子型聚合 物选自聚赖氨酸、聚氮丙啶、聚氮丙啶(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖丙 啶、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺和亚精胺。适用于本 发明的阳离子型基因递送聚合物的一个实例是包含PEI主链、脂类和亲水 聚合物间隔区的PEI衍生物，其中脂类直接地结合至聚氮丙啶主链或共价 地结合至聚乙二醇间隔区，该间隔区随后通过可生物相容的键结合至PEI。 本发明的阳离子型基因递送聚合物还可以包含靶向部分，包括抗体或抗体 片段、细胞受体、生长因子受体、细胞因子受体、叶酸、转铁蛋白、表皮 生长因子(EGF)、胰岛素、脱唾液酸血清类黏蛋白、甘露糖-6-磷酸(单核细 胞)、甘露糖(巨噬细胞、某些B细胞)、Lewis^x和唾液酰Lewis^x(内皮细胞)、 N-乙酰基乳糖胺(T细胞)、半乳糖(结肠癌细胞)和凝血调节蛋白(小鼠肺内 皮细胞)、融合剂如多粘菌素B和血凝素HA2、抗溶酶体剂、核定位信号 (NLS)如T-抗原等。另一种基因递送聚合物是非缩合型聚合物，选自聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)以及PLGA和PEG 的三单元共聚物。基因递送聚合物还可以是非缩合型聚合物。此类非缩合 型聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚谷氨酸、明胶、 聚磷酸酯、丝-弹性蛋白样水凝胶、琼脂糖水凝胶、脂微管、聚(丙交酯共 乙交酯)以及聚乙二醇连接的聚(丙交酯共乙交酯)。

在前述组合物的一个实施方案中，药剂是选自紫杉烷类、铂、阿霉素、 环磷酰胺、托泊替康、卡莫司汀(BCNU)或其组合的化学治疗药。尤其优选 紫杉醇、卡铂、托泊替康、吉西他滨和其任意组合。

在前述组合物的另一个实施方案中，药剂是选自CD20抗体、 HER2/neu抗体、抗VEGF抗体、表皮生长因子受体抗体和其放射性同位 素缀合物的抗癌抗体。

本发明还提供用于通过肿瘤内、腹膜内、气管内、颅内或全身施用包 含核酸、核酸递送聚合物和至少一种附加的化学治疗药的药物组合物治疗 哺乳动物癌症的方法。哺乳动物癌症选自卵巢、乳腺、脑、头和颈、肝、 肺、前列腺、肾、结肠、胰、甲状腺、膀胱、腹腔、胸腔和皮肤的原发性 或转移性肿瘤。核酸和基因递送聚合物在药剂施用之前或之后通过肿瘤内、 腹膜内、气管内或口服或全身施用加以施用。例如，在某些情况下，优选 在药剂(例如，化学疗法)之前施用核酸(例如，pIL-12 DNA/聚合物)，因为 这将有效地增强瘤对药剂的敏感性并促进抗癌反应。在另一情况下，优选 在基因递送(例如，pIL-12/PPC)之前给予药剂(例如，化学疗法)以允许药剂 引起肿瘤破坏以及释放待由治疗性基因(例如，pIL-12/聚合物)稍后利用的 肿瘤抗原，用于激发针对目的癌的高度特异且强烈的治疗反应。

以所述药物组合物(核酸加上基因递送聚合物和一种或多种化学治疗 剂)治疗肿瘤导致肿瘤缩小和寿命延长。根据本发明方法的基因疗法(核酸 和基因递送聚合物)与化学疗法(化学治疗剂)的联合产生相加效果和/或协 同效果。将本发明方法的功效定义为，但不限于肿瘤大小的缩减或肿瘤密 度的减少、淋巴细胞计数的增加或中性细胞计数的增加或存活的改善或以 上全部。此外，根据本发明方法的基因疗法(核酸和基因递送聚合物)与化 学疗法(化学治疗剂)的联合降低化学治疗剂毒性并逆转肿瘤对化学疗法的 抗性。毒性在本文中定义为对临床观察到的治疗相关的任意不利效果，包 括但不限于异常血液学或血清化学或器官毒性。此外，根据本发明方法的 基因疗法(核酸和基因递送聚合物)与次优剂量的化学疗法(化学治疗剂)的 组合增强抗癌效果至如此水平，其等于或高于以优化剂量的化学治疗剂所 取得的水平，但具有更少毒性。

在所述的联合疗法中，核酸是选自质粒DNA、siRNA、有义RNA、 反义RNA和核酶中的一员。核酸可以是含有如此DNA序列的基于质粒的 基因表达系统，该DNA序列编码选自白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细 胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素 -γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、抗血管生成剂、肿瘤抑制 基因、胸苷激酶、eNOS、iNOS、p53、p16、TNF-α、Fas-配体、突变的 癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原的抗癌蛋白质或抗增殖蛋白质。 质粒DNA还可以编码shRNA分子，所述shRNA分子设计为旨在抑制参 与肿瘤细胞或其它过度增生性细胞生长或维持的蛋白质。质粒DNA可以 同时编码治疗性蛋白质和一种或多种shRNA。此外，所述组合物的核酸还 可以是质粒DNA与合成RNA的混合物。基因递送聚合物是阳离子型聚合 物或非缩合型聚合物。阳离子型聚合物选自聚赖氨酸、聚氮丙啶、聚氮丙 啶(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖丙啶、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基 -b-环糊精、精胺和亚精胺。适用于本发明的阳离子型基因递送聚合物的一 个实例是包含聚氮丙啶(PEI)主链、脂类和聚乙二醇间隔区的聚氮丙啶衍生 物，其中脂类直接地结合至聚氮丙啶主链或共价地结合至聚乙二醇间隔区， 该间隔区随后通过可生物相容的键结合至PEI。本发明的阳离子型基因递 送聚合物还可以包含靶向部分，包括抗体或抗体片段、细胞受体、生长因 子受体、细胞因子受体、叶酸、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、 脱唾液酸血清类黏蛋白、甘露糖-6-磷酸(单核细胞)、甘露糖(巨噬细胞、某 些B细胞)、Lewis^x和唾液酰Lewis^x(内皮细胞)、N-乙酰基乳糖胺(T细胞)、 半乳糖(结肠癌细胞)和凝血调节蛋白(小鼠肺内皮细胞)、融合剂如多粘菌素 B和血凝素HA2、抗溶酶体剂、核定位信号(NLS)如T-抗原等。基因递送 聚合物是非缩合型聚合物，其选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯 共乙交酯)(PLGA)以及PLGA和PEG的三单元共聚物。化学治疗药是选 自紫杉烷类、铂、阿霉素、环磷酰胺、托泊替康、卡莫司汀(BCNU)或其组 合的成员。尤其优选紫杉醇、卡铂、托泊替康、吉西他滨和其任意组合。

在前述方法的另一个实施方案中，药剂是选自CD20抗体、HER2/neu 抗体、抗VEGF抗体、表皮生长因子受体抗体和其放射性同位素缀合物的 抗癌抗体。

本发明还提供通过肿瘤内、腹膜内、气管内、颅内或全身施用包含基 于质粒的基因表达系统和基因递送聚合物的药物组合物用于治疗哺乳动物 癌症或过度增生性疾病的方法，其中所述药物组合物不含化学治疗药。哺 乳动物癌症选自卵巢、乳腺、脑、头和颈、肝、肺、前列腺、肾、结肠、 胰、甲状腺、膀胱、腹腔、胸腔和皮肤的原发性或转移性肿瘤。核酸是基 于质粒的含有如此DNA序列的基因表达系统，该DNA序列编码选自白细 胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、 干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因 子、抗血管生成剂、肿瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、iNOS、p53、p16、 TNF-α、Fas-配体、突变的癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原的抗 癌或抗增殖蛋白。质粒DNA还可以编码shRNA分子，所述shRNA分子 设计为旨在抑制参与肿瘤细胞或其它过度增生性细胞生长或维持的蛋白 质。质粒DNA可以同时编码治疗性蛋白质和一种或多种shRNA。此外， 所述组合物的核酸还可以是质粒DNA与合成RNA的混合物。

所述组合物的基因递送聚合物是阳离子型聚合物或非缩合型聚合物。 阳离子型聚合物选自聚氮丙啶、聚氮丙啶(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖 丙啶、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺和亚精胺。适用于 本发明的阳离子型基因递送聚合物的一个实例是包含聚氮丙啶(PEI)主链、 脂类和聚乙二醇间隔区的聚氮丙啶衍生物，其中脂类直接地结合至聚氮丙 啶主链或共价地结合至聚乙二醇间隔区，该间隔区随后通过生物可容纳的 键结合至PEI。本发明的阳离子型基因递送聚合物还可以包含靶向部分， 包括抗体或抗体片段、细胞受体、生长因子受体、细胞因子受体、叶酸、 转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、脱唾液酸血清类黏蛋白、甘露 糖-6-磷酸(单核细胞)、甘露糖(巨噬细胞、某些B细胞)、Lewis^x和唾液酰 Lewis^x(内皮细胞)、N-乙酰基乳糖胺(T细胞)、半乳糖(结肠癌细胞)和凝血 调节蛋白(小鼠肺内皮细胞)、融合剂如多粘菌素B和血凝素HA2、抗溶酶 体剂、核定位信号(NLS)如T-抗原等。另一种基因递送聚合物是非缩合型 聚合物，选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)以 及PLGA和PEG的三单元共聚物。以所述药物组合物(核酸加上基因递送 聚合物以及一种或多种化学治疗剂)治疗肿瘤导致肿瘤缩减和寿命延长。

附图简述

图1显示基因递送聚合物PEG-PEI-胆固醇(PPC)和水溶性脂质聚合物 PEI-Chol(WSLP)之间在基因转移功效上的差异。将受试聚合物与萤光素 酶质粒复合并肿瘤内施用至4T1乳腺肿瘤。此后24小时在肿瘤组织内定 量萤光素酶表达。

图2显示增加PEG-PEI-Chol中的PEG∶PEI比率对基因通过肿瘤内施 用质粒/PPC复合体转移至4T1实体瘤的功效的影响。将以不同PEG∶PEI 比率合成的PPC聚合物与萤光素酶质粒复合并肿瘤内施用至4T1乳腺肿 瘤。24小时后在肿瘤组织内定量萤光素酶表达。

图3显示IL-12基因通过肿瘤内施用(A)pmIL-12/PPC复合体转移至乳 腺实体瘤和通过腹膜内注射(B)pmIL-12/PPC复合体转移至腹膜弥散性卵 巢肿瘤(ID8肿瘤)。将PPC与小鼠IL-12基因表达质粒(pmIL-12)复合 并肿瘤内施用至4T1乳腺肿瘤以及腹膜内施用至携带ID8腹膜肿瘤的小 鼠。IL-12水平24小时后在4T1肿瘤内以及在1、2、3和7日后在携带ID8 肿瘤的动物的腹水内定量。

图4显示腹膜内施用pmIL-12/PPC后IFN-γ产生的时间过程。PPC 与小鼠IL-12基因表达质粒(pmIL-12)复合并腹膜内施用至携带ID8腹膜肿 瘤的小鼠。IFN-γ水平在1、2、3和7日后在腹水内定量。

图5显示通过腹膜内施用pmIL-12/PPC复合体对腹膜弥散性卵巢肿瘤 的剂量依赖性抑制。以多种DNA剂量制备的pmIL-12/PPC复合体腹膜内 施用至携带腹膜弥散性ID8肿瘤的小鼠。对动物定期称重以评估治疗对肿 瘤载量的影响，并记录存活数据。

图6显示通过腹膜内施用pmIL-12/PPC复合体的携带腹膜弥散性卵巢 肿瘤的小鼠的存活改善。

图7显示通过腹膜内施用pmIL-12/PPC复合体的携带腹膜弥散性结肠 直肠肿瘤的小鼠的存活改善。pmIL-12/PPC复合体腹膜内施用至携带肿瘤 的小鼠。监测试验动物和对照动物的存活。

图8显示通过腹膜内施用pmIL-12/PPC复合体的携带GL-261神经胶 质瘤的小鼠的存活改善。pmIL-12/PPC复合体在肿瘤植入时施用至颅腔。 监测试验动物和对照动物的存活。

图9显示通过肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体对皮下鳞状细胞癌的抑 制。pmIL-12/PPC复合体在肿瘤植入后6-7日肿瘤内施用至皮下SCCVII 肿瘤并且治疗每周重复一次持续4周。为评估治疗功效，定期测量肿瘤大 小。

图10显示通过包含腹膜内pmIL-12/PPC和静脉内紫杉醇的联合疗法 对腹膜弥散性卵巢肿瘤的抑制。pmIL-12/PPC复合体在植入肿瘤细胞21 日后通过腹膜内注射施用。7日后重复pmIL-12/PPC治疗。紫杉醇在首次 基因注射前一日静脉内施用仅一次。监测试验动物和对照动物的存活。

图11显示通过包含腹膜内pmIL-12/PPC和吉西他滨化学疗法的联合 疗法对腹膜弥散性ID8卵巢肿瘤的抑制。携带肿瘤的小鼠在肿瘤植入14 日后以腹膜内吉西他滨治疗并且治疗每周重复一次共4次治疗。首次 pmIL-12/PPC治疗在肿瘤植入17日后通过腹膜内注射给予并每周重复一 次共4次治疗。监测试验动物和对照动物的存活。

图12显示包含腹膜内pmIL-12/PPC和卡铂/紫杉醇化学疗法的联合疗 法对腹膜弥散性卵巢肿瘤的抑制。化学疗法治疗在肿瘤植入15日后开始， 卡铂每周给予一次持续4周并且紫杉酚每隔一周给予一次共2次治疗。首 次pmIL-12/PPC治疗在肿瘤植入18日后通过腹膜内注射给予并且每周重 复一次共4次治疗。监测试验动物和对照动物的存活。

图13显示通过肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体和环磷酰胺化学疗法 对SCCVII肿瘤的抑制。pmIL-12/PPC复合体在肿瘤植入6-7日后肿瘤内 施用至皮下SCCVII肿瘤并且每周重复一次共4周。环磷酰胺在基因注射 前一日静脉内施用并且在14日后重复。为评估治疗功效，定期测量肿瘤大 小。

图14显示通过肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体和BCNU化学疗法对 GL261神经胶质瘤的抑制。pmIL-12/PPC复合体在肿瘤植入时施用至颅 腔。BCNU作为Gliadel糯米纸囊剂(wafer)在肿瘤植入5日后施用。监 测试验动物和对照动物的存活。

图15显示IL-12/PPC基因疗法添加至低剂量卡铂/紫杉醇化学疗法没 有增加毒性。作为比较，用高剂量卡铂/紫杉醇化学疗法的治疗引起30％比 例的治疗相关性死亡。化学疗法治疗在肿瘤植入15日后开始，卡铂每周给 予一次持续4周并且紫杉酚每隔一周给予一次共2次治疗。首次 pmIL-12/PPC治疗在肿瘤植入18日后通过腹膜内注射给予并且每周重复 一次共4次治疗。整个治疗循环重复三次。监测试验动物和对照动物的存 活。

发明详述

在公开和描述本组合物及用于递送生物活性剂的方法之前，应当理解 本发明不限于本文中公开的具体设置、方法步骤和材料。还应当理解本文 中采用的术语仅用于描述具体实施方案的目的并且不意图是限制性的，因 此本发明的范围仅受附带的权利要求书及其等效物限制。

必须指出如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个”和 “该”包括复数称谓，除非上下文清楚地说明。因此，对含有“一个二硫键” 的聚合物的称谓包括对两个或多个如此二硫键的称谓，对“一个配体”的称 谓包括对一个或多个如此配体的称谓以及对一种药物的称谓包括对两种或 多种如此药物的称谓。

在描述本发明并要求本发明的权利时，将使用与以下描述的定义相一 致的如下术语。

“转染”应当意指核酸从对细胞为外在的环境转运至内部的细胞环境， 尤其指细胞浆和/或细胞核。不受任何具体理论束缚，应当理解可以将核酸 包封于一种或多种阳离子型聚合物/核酸复合体中或黏附至此复合体或由 其携带后递送至细胞。特定的转染实例为将核酸递送至细胞核。核酸包括 DNA和RNA以及其合成性同类物。此类核酸包括错义、反义、无义以及 产生蛋白质的核苷酸，控制蛋白质、肽和核酸产生的开启和关闭和调节速 率的核苷酸。尤其，它们可以是，但不限于基因组DNA、eDNA、mRNA、 tRNA、rRNA、杂交序列或合成性或半合成性序列，并且其为天然来源的 或人工来源的。此外，核酸可以在大小上变化，范围从寡核苷酸至染色体。 这些核酸可以是人的、动物的、植物的、细菌的、病毒的或合成性来源。 它们可以由本领域技术人员所知的任何技术获得。

如本文中所用，术语“药剂”或“药物”或任何其它类似术语意指适用于 通过本领域先前已知方法和/或本发明中所教授方法施用的任何化学的或 生物的物质或化合物，其引起所需要的生物学的或药物学的效果，该效果 可以包括但不限于(1)具有对生物的预防性效果并防止不想要的生物学效 果如阻止感染，(2)缓解由疾病引起的病症，例如缓解因疾病所致的疼痛或 炎症，和/或(3)或者缓解、减少或完全消除来自生物中的疾病。效果可以是 局部的，如提供局部麻醉效果，或它可以是全身性的。

本发明本身不涉及新药物或新类型的生物活性剂。相反，本发明涉及 可生物相容的阳离子型共聚物组合物以及使用如此组合物用于递送基因或 其它生物活性剂的方法，其中所述的其它生物活性剂在目前技术领域存在 或可能稍后确立作为活性剂并且适用于通过本发明递送。此类物质包括广 泛类型的通常递送至身体的化合物。通常，这包括但不限于：核酸，如DNA、 RNA和寡核苷酸；抗感染药如抗生素和抗病毒药；镇痛药和镇痛药组合； 食欲抑制药；驱蠕虫药；抗关节炎药；平喘药；抗惊厥药；抗抑郁药；抗 糖尿病药；止泻药；抗组胺药；抗炎药；抗偏头痛制剂；止恶心药；抗肿 瘤药；抗震颤麻痹药；止瘁药；抗精神药；退热药；解痉药；抗胆碱能药； 拟交感神经药；黄嘌呤衍生物；心血管制剂包括钾通道、钙通道阻滞剂、β- 阻滞剂、α-阻滞剂和抗心律失常药；抗高血压药；利尿药和抗利尿药；血 管舒张药包括全身神经、心神经、周围神经和脑神经、中枢神经系统的兴 奋剂、血管抑制药；咳嗽和感冒制剂，包括减充血药；激素，如雌二醇和 其它固醇类，包括皮质类固醇；催眠药；免疫抑制药；肌肉松弛药；副交 感神经阻滞药；精神兴奋剂；镇静药和安定药。通过本发明的方法，可以 递送例如处于离子化的、非离子化的、游离碱、酸加成盐等所有形式的药 物，同样可以递送高分子量或低分子量药物。对于待递送生物活性剂的属 或种类的唯一限制是可以迅速通过常规实验确定的官能度的限制。

如本文中所用，术语“可生物相容的”或“生物降解”定义为将物质通 过溶解化水解或通过生物形成的存在物(entities)转化为复杂性较低的中间 产物或终产物，其中存在物可以是生物的酶或其它产物。

如本文中所用，“有效量”意指核酸或生物活性剂的量，其足以提供所 需的局部或全身效果和并以任何医学治疗的合理风险/损益比实施。

如本文中所用“肽”意指任何长度的肽并且包括蛋白质。术语“多肽”和 “寡肽”用于本文中而无任何具体大小限制的意思，除非说明具体的大小。 可以利用的代表性肽选自催产素、血管升压素、肾上腺皮质激素、表皮生 长因子、促乳素、促黄体素释放素或黄体生成素释放激素、生长激素、生 长激素释放因子、胰岛素、促生长素抑制素、胰高血糖素、干扰素、胃泌 素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素(urogastroine)、肠促胰液素、 降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌 素、黏菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽及合成的类似物、修饰物和其药学活 性片段、单克隆抗体和可溶性疫苗。对可以利用的肽或蛋白质药物的唯一 限制是官能度的限制。

如本文中所用，糖的“衍生物”例如包括糖的酸形式，例如糖醛酸，糖 的胺，例如半乳糖胺；糖的磷酸酯，例如甘露糖-6-磷酸等。

如本文中所用，“施用”和类似术语意指递送组合物至正在接受治疗的 个体以致该组合物能够在全身循环，其中组合物结合至靶细胞并通过内吞 作用摄入。因此组合物优选地全身施用至个体，一般通过皮下、肌内、经 皮、静脉内或腹膜内途径。用于此用途的注射剂可以制备为常规形式，作 为液体溶液或混悬液，或为这样的固体形式，其适用于在注射前制备为液 体中的溶液或混悬液，或制备为乳剂。可用于施用的合适赋形剂包括例如 水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等；以及根据需要，少量辅料如湿润剂或 乳化剂、缓冲剂等。

如本文中所用，“功效”和类似术语意指肿瘤的消失或肿瘤大小的缩减 或肿瘤密度的降低或淋巴细胞计数的增加或嗜中性细胞计数的增加或存活 改善或以上全部。

如本文中所用，“毒性”定义为临床观察到的任意的治疗相关的不利效 果，包括但不限于异常的血液学或血清化学结果或器官毒性。

新的癌症治疗策略集中在允许经外源递送的基因在肿瘤环境中表达的 携带遗传信息的递送性大分子，而不是治疗性蛋白质本身。与病毒性递送 系统相比，认为利用非病毒性基因递送系统的方法更安全，但是现存聚合 物系统的实际应用因为效率低并不令人满意。最近公开了一项策略，从而 通过胆固醇的共价结合形成水溶性脂质聚合物(WSLP)增强低分子量PEI 的基因转染效率。见Mol Ther.，2001，4，130。用WSLP明显比通过未修饰 的PEI更好地转移IL-12基因至实体瘤，并且引起更显著的肿瘤抑制。

本发明提供新的聚合物系统PEG-PEI-胆固醇(PPC)，其与WSLP (PEI-胆固醇)不同在于它含有PEG部分并且在肿瘤中产生显著较高的转染 效率(图1)。设计添加PEG旨在增强生物环境中核酸/聚合物复合体的稳定 性以克服现有技术(WSLP)的缺陷。此外，添加PEG链允许配体掺入至PPC 链以改善递送的组织选择性。例如在现有技术(WSLP)中直接连接于PEI 主链的胆固醇部分可以从PEI主链进一步延伸以产生更灵活的几何形状用 于细胞受体相互作用。控制每单位PEI主链的PEG分子数目对于实现转 染活性的最佳强化重要。如图2中所示，肿瘤基因转移的幅度取决于不同 PPC成分、PEG、PEI和胆固醇之间的比率。组合物的优选范围是在固定 的胆固醇含量时PEG∶PEI摩尔比率2-4。PEI和胆固醇间的最佳比率是 1∶0.5至1∶1。以治疗性基因检验PPC促进基因转移至肿瘤的能力。含有小 鼠IL-12基因的表达质粒(pmIL-12)与PPC以11∶1氮(N)对磷酸(P)比率(N∶P 比率)复合并且肿瘤内施用至具有4T1实体瘤的小鼠或腹膜内施用至具有 腹膜弥散性卵巢肿瘤的小鼠。

在两种肿瘤模型中，IL-12基因转移表现为IL-12水平的增加(图3)。 在携带腹膜肿瘤的小鼠中，治疗后IL-12水平在24小时内升高并且在7日 内降低至基线。IL-12作用的动力学与IL-12作用的下游媒介IFN-γ的升高 密切相关(图4)。IFN-γ水平的升高如所预期略微延迟并且在7日后仍然高 于基线。这些数据表明包含IL-12表达质粒和PPC的组合物能够在不同肿 瘤类型中并通过不同施用途径表明IL-12基因转移。通过pmIL-12/PPC介 导的IL-12基因转移具有治疗显著性，因为它引起肿瘤生长的显著抑制。

在具有腹膜弥散性卵巢肿瘤的小鼠内，腹膜内施用DNA剂量为10-250 μg的pmIL-12/PPC复合体(N∶P比率11∶1)以剂量依赖性方式显著地减少肿 瘤载量(图5)并改善存活(图6)。还在结肠直肠癌中观察到 pmIL-12/PPC(N∶P比率11∶1)的治疗效果。与未治疗的动物相比，在具有 腹膜弥散性结肠直肠癌的小鼠中腹膜内施用25μg的pmIL-12/PPC复合体 显著地延长其存活(图7)。通过pmIL-12/PPC的IL-12基因转移的抗癌功 效还在肿瘤内施用后的实体瘤内观察到。图8显示肿瘤内注射 pmIL-12/PPC对GL261脑肿瘤生长的影响。通过局部递送pIL-12/PPC复 合体(N∶P比率11∶1)对小鼠GL261神经胶质瘤颅内植入物的治疗显著地增 强存活。在具有皮下植入的头和颈鳞状细胞癌的小鼠内，每周一次持续四 周肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体产生显著的肿瘤生长速率抑制(图9)。 还在卵巢肿瘤和乳腺肿瘤内观察到pmIL-12/PPC复合体的抗癌效果。

本发明的组合物(核酸和基因递送聚合物)当体内施用时未产生不利的 副作用。例如，没有与腹膜内或皮下施用pmIL-12/PPC相关的化合物相关 的死亡或临床中毒迹象。pmIL-12/PPC在每只动物10μg、50μg和250μg 剂量上在雄性和雌性小鼠中得到良好耐受。IP和SC剂量组内动物的组织 病理学检查表明没有因pmIL-12/PPC所致的全身毒性证据，轻微炎症在位 于或接近于注射部分的器官中明显，但是在一个月恢复时间期间消退。这 些结果证实当通过不同施用模式给予时，用于癌症治疗的核酸/聚合物组合 物有效地对抗类型广泛的癌症，并且体内重复递送不引起严重毒性。

已经广泛认识到抗癌症的单独治疗策略通常因该疾病的多因素性质无 效。人们正日益认识到联合多于一种药物以使抗癌反应最大化的益处。尽 管临床前数据令人鼓舞，然而迄今已检验的化学-化学组合或化学-细胞因 子组合的临床成功因化学治疗药和重组细胞因子蛋白质的固有毒性仍不令 人满意。这证明需要更安全的化学-免疫疗法方法以克服蛋白质毒性并改善 功效。在本发明中，我们联合化学治疗剂与局部施用至肿瘤部位的抗癌基 因的基因递送以改善治疗安全性和功效。安全和有效的抗癌基因局部递送 与标准化学治疗剂的联合将增强抗癌反应和患者存活，不引起毒性。该联 合疗法将减少化学疗法剂量并且增加肿瘤对化学疗法的敏感性。在本发明 中，已经证实包含与阳离子型基因递送聚合物复合的抗癌基因和至少一种 附加的化学治疗药的药物组合物比单独施用基因疗法或化学疗法更有效。 此外当通过不同的施用途径给予时，联合疗法有效地对抗类型广泛的癌症， 并且不对个体治疗引起毒性。

联合疗法的抗癌反应针对植入腹膜腔的卵巢肿瘤展示。静脉内施用紫 杉醇(Taxol^)(8mg/Kg)或腹膜内施用pmIL-12质粒(25-100μg)/PPC复合 体(N∶P比率11∶1)在携带肿瘤的小鼠中引起肿瘤的减少和改善的存活。 pmIL-12/PPC治疗比紫杉醇治疗更有效。联合IL-12基因和紫杉醇疗法产 生比单独治疗更大的治疗反应(图10)。当IL-12基因疗法与另一种化学治 疗剂吉西他滨(Gemzar^)联合时，观察到联合疗法在卵巢癌上的类似效果 (图11)。当与pmIL-12/PPC治疗同时使用时，吉西他滨的抗癌活性显著增 强。研究了IL-12基因疗法与两种化学治疗剂的混合物的联合。如图12中 所示，当与单独的IL-12疗法或单独的化学疗法比较时，IL-12基因疗法与 卡铂(Paraplatin^)/紫杉醇混合物联合引起增强的存活。IL-12基因疗法加 至次优剂量的卡铂/紫杉醇增强了类似于用高化学疗法剂量实现的治疗功 效(图12)，不引发毒性。

在实体瘤内也观察到通过联合疗法对抗癌反应的改善。例如在头和颈 的皮下鳞状细胞癌中，静脉内施用化学治疗剂环磷酰胺(150mg/kg)显著地 减少肿瘤生长，但是未完全抑制肿瘤生长(图13)。肿瘤内仅注射 pmIL-12/PPC引起约30％的肿瘤生长抑制。相对于单独治疗，环磷酰胺加 pmIL-12/PPC的联合疗法引起肿瘤生长的完全抑制。完全排斥率从用环磷 酰胺的仅10％明显地增加至用环磷酰胺加pmIL-12/PPC复合体的55％。 在GL261脑肿瘤中单次肿瘤内注射次优剂量(1.5μg)的pmIL-12/PPC复 合体未显著地增强动物的存活率。然而，该次优剂量的pmIL-12/PPC与化 学治疗剂BCNU(Gliadel^wafer)的联合在存活率上产生显著增强(图14)。

采用高剂量化学疗法的癌症治疗伴随严重的毒性。为检验IL-12/PPC 加至低剂量化学疗法是否引起治疗相关性毒性，携带腹膜弥散性卵巢肿瘤 的小鼠以IL-12/PPC和低剂量化学疗法的三个治疗循环处理并监测毒性征 兆。直接比较以三个循环高剂量化学疗法治疗处理的动物。如图15中所示， 高剂量化学疗法组的50％因治疗相关性毒性死亡(即在达到40克之前)， 而IL-12/PPC+低剂量化学疗法组没有一只动物死于治疗毒性。这些结果 表明用于癌症的常规化学疗法(高剂量)的毒性可以通过降低化学疗法剂量 并加入更安全和有效的IL-12基因疗法而显著减少。

这些数据显示了包含IL-12质粒和新型基因递送聚合物的组合物的抗 癌功效及该组合物用单种化学治疗剂或化学治疗剂混合物的加强。联合方 法提供这样的方法，通过该方法增强次优剂量的化学疗法方案的功效，而 不增加毒性。

如下实施例将使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。应当 理解，尽管结合本发明优选的具体实施方案，本发明已经得到描述，然而 随后的实施方案意在说明而非限制本发明的范围。本发明的其它方面对于 与本发明有关的本领域技术人员将显而易见。

实施例1

通过局部施用pIL-12/PPC复合体将IL-12基因转移至腹膜弥散性肿瘤 或皮下肿瘤

检测了局部递送pIL-12/PPC复合体以在携带皮下肿瘤和腹膜弥散性 肿瘤的小鼠中产生IL-12水平的能力。对于皮下肿瘤研究，雌性BALB/c 小鼠(7周龄，14-18克)在左腹侧和右腹侧分别以1×10⁶个4T1细胞作皮下 (sc)注射。肿瘤达到约60mm³的肿瘤大小后，以含有6μgDNA的 pmIL-12/PPC复合体注射它们。小鼠在24小时后处死并收获它们的肿瘤 用于通过ELISA分析mIL12。注射后24小时肿瘤中的mIL-12水平示于 图3A。

对于腹膜肿瘤研究，雌性C57/BL6小鼠以500μl体积内的5×10⁶个ID8 细胞作腹膜内(ip)注射。当肿瘤负荷(小鼠重量)达到约20克(注射细胞 后～21日)时，治疗开始。小鼠于500μl体积内的11∶1氮(N)对磷酸(P)比 率(N∶P比率)的单剂量pmIL-12/PPC作腹膜内注射。腹水在小鼠经 pmIL-12/PPC治疗后的1、2、3和7日从携带肿瘤的动物中取出。mIL-12 和IFN-γ的水平通过ELISA测定并对总腹水进行归一化。结果表明在腹水 中观察到显著水平的mIL-12，治疗后1日达峰值水平，治疗后7日水平下 跌至接近基线(图3B)。类似地观察到IFN-γ的水平升高，但峰值水平相对 于IL-12水平在时间上推迟(3天峰值)并且在治疗后至7日下跌但仍显 著地高于基线水平(图4)。

实施例2

通过腹膜内施用pIL-12/PPC复合体治疗腹膜弥散性卵巢肿瘤

小鼠以500μl体积内的5×10⁶个ID8细胞作腹膜内注射。当肿瘤负荷 (小鼠重量)达到约20克(注射细胞后～21日)时，治疗开始。小鼠于500μl 体积内的以11∶1 N∶P比率与PPC复合的10-250μg的pIL-12作腹膜内注 射，每周一次持续三周。小鼠在研究期间定期称重。重量增加明显因提供 间接评估疾病进展和肿瘤负荷的腹水聚集引起。pmIL-12/PPC治疗引起肿 瘤负荷的剂量依赖性抑制(图5)以及动物存活延长(图6)。

实施例3

通过腹膜内施用pIL-12/PPC复合体治疗腹膜弥散性结肠直肠肿瘤

小鼠以500μl体积内的0.1×10⁶个CT26细胞作腹膜内注射。治疗在肿 瘤植入1日后开始。小鼠于500μl体积内的以11∶1 N∶P比率与PPC复合的 50μg pmIL-12或与LPPC6复合的25μg pIL-12作腹膜内注射，每周一次 持续五周。LPPC6是一分子mPEG和6分子胆固醇分别与之结合的15KD 线型聚氮丙啶。如图7中所示，在这种高度侵入性肿瘤模型中pmIL-12/PPC 和pmIL-12/LPPC6治疗在存活上产生超过未治疗对照的显著改善。

实施例4

通过肿瘤内施用pIL-12/PPC复合体治疗脑癌

局部递送pmIL-12/PPC复合体的效果在小鼠神经胶质瘤模型中检验。 肿瘤通过颅内注射1×10⁵个GL261神经胶质瘤细胞植入小鼠大脑皮层， 同时共注射pmIL-12/PPC复合体。监视动物的任何神经毒性征兆并根据需 要进行尸检，以证实死亡原因是颅内肿瘤。存活使用Kaplan-Meier存活分 析作图。以质粒剂量范围2.5-30μg单次颅内注射施用的pmIL-12/PPC复 合体受到良好耐受，因为未观察到明显的不利效果。以质粒剂量15μg单次 注射的pmIL-12/PPC复合体在动物存活方面产生显著增强(图8)。

实施例5

通过肿瘤内施用pIL-12/PPC复合体治疗头颈癌

检验局部施用pIL-12/PPC复合体对皮下植入的鳞状细胞(SCCVII)癌 生长的影响。将100μl中的4×10⁵个鳞状癌细胞在雌性CH3小鼠(6-9周龄， 17-22克)的右侧腹部皮下植入。mIL-12质粒与PPC以11∶1 N∶P比率复合 并在肿瘤植入后约11日开始以50μl注射体积内的25μgDNA剂量局部施 用至肿瘤，每周一次持续4周。使用治疗组的12小鼠并使用卡尺量具每周 两次监测肿瘤生长。如图9中所示，肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体产生 部分的但显著的肿瘤生长抑制。

实施例6

pIL-12/PPC加紫杉醇联合疗法用于治疗腹膜弥散性卵巢肿瘤

腹膜内IL-12基因疗法与紫杉醇化学疗法联合以增强对小鼠中弥散性 卵巢肿瘤的治疗反应。小鼠以500μl体积内的5×10⁶个ID8细胞作腹膜内 注射。当肿瘤负荷(小鼠重量)达到约20克(注射细胞后～21日)时，治 疗开始。小鼠于500μl体积内的以11∶1 N∶P比率与PPC复合的25μg pmIL-12作腹膜内注射。基因疗法在七日后重复，形成每个研究总共两次 注射(第1日、第8日)。紫杉醇(Taxol^)以8mg/kg剂量在注射体积250μl 中通过静脉内注射施用仅一次(第0日)。对于联合疗法，基因疗法和化学 疗法治疗均如上所述给予。动物定期称重以评估基因疗法对肿瘤负荷的影 响。仅腹膜内注射pmIL-12/PPC复合体导致腹膜肿瘤负荷的显著减少。 pmIL-12/PPC复合体对肿瘤负荷的抑制略高于紫杉醇对肿瘤负荷的抑制。 IL-12基因疗法加至紫杉醇导致紫杉醇对肿瘤负荷作用和存活的改善(图 10)。

实施例7

pIL-12/PPC加吉西他滨的联合疗法用于治疗腹膜弥散性卵巢癌

评估了IL-12基因疗法与吉西他滨(Gemzar^)联合的功效。吉西他滨 属于一组通用的称作抗代谢剂的化学疗法药物。吉西他滨用于治疗胰癌、 乳腺癌(与紫杉醇一起)和肺癌(与顺铂一起)，并且目前正在临床评估抗卵巢 癌的用途。对于本项研究，小鼠(C57BL/6)以500μl体积内的2.5×10⁶个ID8 细胞作腹膜内注射以诱导弥散性肿瘤形成。在肿瘤植入14日后，吉西他滨 以250μl体积内的150mg/kg剂量腹膜内施用。治疗每周重复，总共四次 治疗。从肿瘤植入17日后开始，所选择的小鼠组于500μl体积内的以11∶1 N∶P比率与PPC复合的25μg IL-12质粒作腹膜内注射。质粒施用每周重复， 总共四次治疗。与两种单一疗法的任一疗法相比，IL-12基因疗法与吉西 他滨化学疗法的联合疗法显著地改善生存(图11)。

实施例8

pIL-12/PPC加卡铂/紫杉醇联合疗法用于治疗腹膜弥散性卵巢癌

用于卵巢癌的一线化学疗法一直是铂剂(卡铂、顺铂)和紫杉醇。因此， 我们有兴趣评估与卡铂/紫杉醇化学疗法方案联合的IL-12基因疗法的用 途。小鼠(C57BL/6)以500μl体积内的2.5×10⁶个ID8细胞作腹膜内注射。 化学疗法治疗在肿瘤植入15日后开始。卡铂(Paraplatin^)施用是250μl中 的40mg/kg(高剂量)或以250μl中的15mg/kg(低剂量)腹膜内施用并且紫 杉醇(Taxol^)以250μl中的8mg/kg(高剂量)给予或以250μl中的3 mg/kg(低剂量)腹膜内给予。卡铂每周给予一次共4次治疗，并紫杉醇每2 周给予1次共2次治疗。当相同日给予卡铂和紫杉醇时，首先施用紫杉醇 并且此后2小时施用卡铂。从肿瘤植入18日后开始，所选组中的小鼠于 500μl体积内的以11∶1 N∶P比率与PPC复合的25μg IL-12质粒作腹膜内治 疗。质粒施用每周重复共四次治疗。在治疗方案结束后，监测动物的存活。 结果显示IL-12基因疗法和低剂量卡铂/紫杉醇化学疗法均产生类似的存活 结果(图12)。相反，当低剂量化学疗法与IL-12基因疗法联合时，功效提 高到与高剂量化学疗法治疗方案几乎相同的水平。能够使用与低剂量化学 疗法联合的IL-12基因疗法以在维持治疗功效同时使用较低的化学疗法剂 量使毒性最小化，这是有利的。这将有效地允许患者在化学疗法治疗方案 上维持延伸的时间段，为更明显加强的治疗反应提供机会。

实施例9

pIL-12/PPC加环磷酰胺联合疗法用于治疗头和颈癌

联合肿瘤内IL-12基因疗法与环磷酰胺(Cytoxan)化学疗法以在头和 颈癌内增强治疗反应。100μl中的4×10⁵个鳞状癌细胞(SCCVII)在雌性 CH3小鼠(6-9周龄，17-22克)右腹侧皮下植入。在环磷酰胺治疗前五日(肿 瘤植入后约11日)，将mIL-12质粒以11∶1 N∶P比率与PPC复合并以50μl 注射体积中的25μg DNA剂量局部施用至肿瘤，每周1次，持续四周。环 磷酰胺疗法以125μl注射体积中的200mg/kg剂量单独地或与pIL-12基因 疗法联合作静脉内施用。环磷酰胺疗法14日后重复，形成每项研究总共2 次注射。对于联合疗法，基因疗法和化学疗法治疗均如上所述给予。使用 治疗组的12只小鼠并使用卡尺量具每周两次监测肿瘤生长。如图13中所 示，单独地肿瘤内施用pmIL-12/PPC复合体或静脉内注射环磷酰胺仅产生 部分的肿瘤生长抑制，而它们的联合则产生完全抑制。与单独用化学疗法 治疗的动物对照(10％)，存在用联合疗法治疗的以更高百分比完全排斥肿 瘤的动物(55％)。

实施例10

通过肿瘤内pIL-12/PPC和BCNU联合疗法治疗脑癌

局部递送单独的或与BCNU(Gliadel^)联合的pmIL-12/PPC复合体的 效果在小鼠神经胶质瘤模型中检验。Gliadel^糯米纸囊剂是亚硝基脲家族 的化学治疗剂卡莫司汀或BCNU的聚合物制剂。通过颅内注射1×10⁵个 GL261神经胶质瘤细胞将肿瘤植入小鼠大脑皮层，同时共注射 pmIL-12/PPC复合体。在肿瘤植入5日后，含有10％BCNU的Gliadel 在顶骨内板下植入。监视动物的任何神经毒性征兆并根据需要进行尸检， 以证实死亡原因是颅内肿瘤。存活使用Kaplan-Meier存活分析作图。单次 颅内注射质粒剂量范围为2.5-30μg的pmIL-12/PPC复合体受到良好耐 受，因为未观察到明显的不利效果。单次注射1.5μg质粒剂量的 pmIL-12/PPC复合体未增强存活率。然而，该次优剂量pmIL-12/PPC与 BCNU的联合显著地增强存活(图14)。源于联合疗法的存活增强在此模型 中高于历史上单独以BCNU所达到的存活增强(数据未显示)。

实施例11

比较IL-12/PPC加低剂量卡铂/紫杉醇联合疗法与高剂量卡铂/紫杉醇 联合疗法的毒性

本申请人先前已经证实IL-12/PPC与低剂量卡铂(15mg/kg)和紫杉醇 (3mg/kg)疗法的联合产生类似于高剂量卡铂(40mg/kg)和紫杉醇(8mg/kg) 化学疗法的抗癌功效(实施例8，图12)。在本实施例中，检验IL-12/PPC 加低剂量联合化学疗法的毒性是否比高剂量化学疗法低。与先前实施例中 所用的仅一次治疗循环相比，以三次治疗循环将IL-12/PPC+低剂量化学疗 法或高剂量化学疗法施与携带腹膜弥散性卵巢肿瘤的小鼠。将如此的动物 死亡视为治疗相关的死亡，其为在达到40克体重界限(因疾病进展处死动 物的标准)前出现的动物死亡并且在尸体剖检中未显现明显肿瘤负荷。小 鼠(C57BL/6)以500μl体积内的2.5×10⁶个ID8细胞作腹膜内注射。化学疗 法治疗在肿瘤植入15日后开始。卡铂(Paraplatin^)施用是在250μl中的 40mg/kg(高剂量)或在250μl中的15mg/kg(低剂量)并且紫杉醇(Taxol^)施 用是在250μl中的8mg/kg(高剂量)或以250μl中的3mg/kg(低剂量)作腹膜 内施用。卡铂每周给予一次共4次治疗，并且紫杉醇每2周给予1次共2 次治疗。在治疗日，首先施用紫杉醇并且此后2小时施用卡铂。从肿瘤植 入18日后开始，所选组中的小鼠于500μl体积内以11∶1 N∶P比率与PPC 复合的100μg IL-12质粒作腹膜内治疗。质粒施用每周重复共四次治疗。 整个治疗循环重复三次(共12周)，并且监测动物的存活。如图15中所 示，与IL-12/PPC+低剂量化学疗法组中、单纯的低剂量化学疗法组或 IL-12/PPC治疗组中的0％治疗相关性死亡相比，高剂量化学疗法组的30％ 死于治疗相关性毒性(即在达到40克前)。这些结果表明与高剂量化学疗法 方案比较，IL-12/PPC与低剂量化学疗法的联合产生相对较少的治疗相关 性死亡，但产生相似的抗癌功效(图12)。

应当理解以上所述实施方案仅说明本发明的应用原理。可以衍生众多 的修改和替代性实施方案而不脱离本发明的精神和范围并且随后的权利要 求书意图覆盖此类修改和调整。因此，尽管本发明已经在附图中得到展示 并结合目前认为是最实用和优选的本发明实施方案如上得以具体而详细地 描述，对于本领域一般技术人员而言显而易见可以进行众多修改而不脱离 本发明地原理和概念。