抑制HIV－1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合用的聚酰胺－胺型树状化合物

摘要

本发明提供了一类聚酰胺－胺型树状化合物，从第一代到第五代是作为抑制HIV－1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合的抑制剂。所述的检测tat和各种药物与TAR结合能力的方法，在于建立在QCM传感器和仿Langmuir等温式的计算方法上。本发明优点：本发明采用分子生物学的方法研究HIV发展过程中关键环节－复制反式激活蛋白和反式激活反应区域的相互作用，通过实验证明，本发明所采用的各种抑制剂与TAR RNA的表面结合常数都比TAR RNA和Tat表面结合常数要大，即与Tat相比其亲和性强。该化合物有效而又价廉，在生物体内的毒副作用很小，从而揭示了本化合物有可能成为一类十分有前途的艾滋病药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种作为抑制HIV-1反式激活蛋白(简称HIV-1 Tat)与反式激活应答序列RNA(简称TAR RNA)结合用的聚酰胺-胺型树状化合物(PAMAM Dendrimers)。

背景技术

艾滋病或获得性免疫缺陷综合症(Acquired ImmunodeficiencySyndrome，简称AIDS)是1981年在美国首先发现的一种病毒性传染疾病，其病原是一种能对人免疫系统产生破坏力的逆转录病毒，1983年命名为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，简称HIV)。HIV感染人体后，病毒特异性地侵犯并损耗T淋巴细胞造成肌体细胞免疫损伤，临床初始表现为无症状病毒携带状态，继之发展为持续性全身淋巴结肿大综合症，最后并发各种严重机会性感染和恶性肿瘤，成为艾滋病，因无特效治疗，病死率极高，已成为人类健康的大敌。至今遍布全球五大洲报告的艾滋病(AIDS)病例数已超过二百万，HIV感染者近五千万，而艾滋病全球死亡人数累计达2200万。在我国，HIV感染人数已超过60万，且仍然呈上升趋势。艾滋病已成为全球关注的公共卫生和社会热点问题。

HIV属于慢病毒属(Lentivirus)逆转录病毒科，可分为HIV-1和HIV-2两种类型，其中HIV-1是引起全球艾滋病流行的主要病因，因此，目前关于HIV的防治研究主要是针对HIV-1进行的。

虽然目前已经有大量的药物用于艾滋病的治疗，但是仍然没有十分有效的药物，而且价格高昂，研制和寻找新的药物是十分迫切的。

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的复制受反式激活蛋白(trans-activating protein，Tat)调节，Tat蛋白可以在转录起始及延伸水平时反式激活HIV-1LTR的表达，使病毒mRNA水平升高上百倍。Tat蛋白的作用是通过与HIV-1病毒mRNA 5’端的一段叫做反式激活反应区域(trans-activation-responsive region，TAR)的特异性结合来实现的。Tat蛋白是由86个氨基酸残基组成的小型蛋白，有两个主要功能区：富半胱氨酸区和基本区，基本区是Tat与TAR的特异识别区(图1)。TAR RNA可以形成茎环结构(图2)，其中由三个核苷酸形成的凸出部位是与Tat蛋白亲和性和特异性结合的部位，环形区是活体转录时所需要的，但不是Tat的结合区。

HIV-1Tat和TAR RNA的配合物对病毒复制起重要作用，因此抑制其相互作用成为设计和开发抗艾滋病新药的一个重要靶点。由于爱滋病是由TARRNA病毒引起的，因此那些与TAR RNA有特异性结合的化合物将是有效的抑制剂。而且这种抑制剂应当是对人体无毒和易于被吸收的。

发明内容

本发明的目的是提供一种作为抑制HIV-1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合用的聚酰胺-胺型树状化合物。该化合物有效而又价廉，在生物体内的毒副作用很小。

为达到上述目的本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种抑制HIV-1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合用的抑制剂，所述的抑制剂为聚酰胺-胺型树状化合物。

本文采用分子生物学的方法，研究HIV发展过程中的关键环节--复制受反式激活蛋白(Tat蛋白)和反式激活反应区域(transactivation-responsive region，TAR)的相互作用的加强和受阻，从而找出有效而又价廉的艾滋病药物。

树形大分子(Dendrimers)是最近几年出现的一类高度枝化、单分散性的大分子新型有机化合物，可以由小分子通过支化基元逐步重复反应而制备[Donald A et al.Dendritic Macromolecules：Synthesis of StarburstDendrimer.Macromolecules，1986，vol 19，No.9]。对多种多样的聚酰胺-胺型树状化合物(PAMAM Dendrimer)(三代到七代)进行生物学评价[Roberts J.C.，Bhalgat M.K.，Zera R.T.，J.Biomed.Mater.Res.，1996，30：53]表明，除了最高代以外，树状化合物在生物体内的毒副作用很小，容易合成和购买。从他具有许多胺基和十分稳定的特点来看，这将是一种十分有前途的药物。

一种抑制HIV-1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合的抑制剂为第一代到第五代聚酰胺-胺型树状化合物。避免上述Roberts J.C.论文中提到第七代的可能有的毒性，在研究中未采用第六代和第七代的产品，。所述的聚酰胺-胺型树状化合物为市售产品，它的构造如图3所示。

研究蛋白质与核酸相互作用的常用方法很多，本研究中使用石英晶体微天平(QCM)。这种方法将测定物TAR RNA固定在QCM的镀金面上，无需标记待测物，而且感量为纳克，灵敏度极高。带有TAR RNA的QCM可原位灵敏地检测HIV Tat或其他待测物的重量，从而检测出TAR RNA与HIV Tat蛋白的识别过程中微量的质量变化。[林琳，江龙.DNA分子识别及传感技术.化学通报，No.5，261-267(2001).]其详细测定方法如下：(见图4)

所述的抑制剂和RNA结合的检测方法，它包括：采用QCM传感器，在QCM传感器上放置RNA作为识别物，将本抑制剂及Tat分别同RNA识别物作用，根据加入不同物质所引起的重量变化，可定性地判断相互作用的强弱。

另一种检测抑制剂和RNA结合的方法是：采用QCM传感器，在QCM传感器上放置RNA作为识别物，将本抑制剂及Tat分别同RNA识别物作用，根据被测物吸附量的增加与被测物浓度之间的关系作图，将数据以仿Langmuir等温式的计算方法进行计算，定量地算出识别物与被测物的表面结合常数。

本发明利用生物素(biotin)与亲和素(avidin)结合速度快、结合稳定性高的特点，使测定物TAR RNA固定在QCM上。具体做法是：先将avidin或neutravidin(neutravidin是不含糖苷的亲和素，其活性与avidin-^z，与biotin的解离常数K_D＝10^-15M)固定在QCM镀金表面上，然后将带有biotin的TAR RNA固定到含有avidin的QCM镀金表面上，再利用Tat(或聚酰胺-胺型树状化合物)与TAR RNA的亲和性将Tat(或聚酰胺-胺型树状化合物)固定到吸附有TAR RNA的QCM镀金表面。图4中，

|镀金表面        HIV Tat  ●生物素

■PAMAM DendrimerTAR RNA 不含糖苷素亲和素

根据TAR RNA吸附Tat或其他待测物过程中重量的变化，可以计算出TAR与Tat或TAR与聚酰胺-胺型树状化合物相互作用强度的表面结合常数。具体计算方法是：

因为Tat或聚酰胺-胺型树状化合物与TAR间的作用为特异性作用，所以Tat或聚酰胺-胺型树状化合物在高浓度时可达到一个TAR作用的最大饱和结合量。因此，Tat-TAR与聚酰胺-胺型树状化合物-TAR的结合常数可根据类似Langmuir吸附等温线方程算出，即：

$>>\Gamma >=>>\Gamma >\infty >\frac{}{}>->->->>(>1>)>>>s>$

Γ是Tat或聚酰胺-胺型树状化合物与TAR结合的物质的量(mol)，Γ_∞是Tat或聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的最大结合量，K_D是Tat-TAR或聚酰胺-胺型树状化合物的解离常数，C是溶液中Tat或聚酰胺-胺型树状化合物的浓度。

将1/Γ与1/C作图，则斜率为K_D/Γ_∞，截矩为1/Γ_∞，从而可计算出结合常数。[H.Zhao，J.R.Li，L.Jiang，Inhibiton of HIV-1 TAR RNA-Tatpeptide complexation using poly(acrylic acid).Biochem.Biophys.Res.Communi.，Vol320/1pp 95-99(2004).]

附图说明

图1：HIV-1 Tat肽的初级结构.

图2：HIV-1 TAR RNA的二级结构.

图3a、图3b、图3c、图3d、图3e分别表示从第一代到第五代的聚酰胺-胺型树状化合物的结构图.

图4：分子识别过程示意图.

图5：各种被吸附物加入后QCM镀金晶片的质量变化图.

A曲线：在QCM镀金晶片上各种物质的吸附次序：1.不含糖苷亲和素，2.生物素-TAR，3.第三代PAMAM dendrimers，4.Tat。

B曲线：在QCM镀金晶片上各种物质的吸附次序：5.不含糖苷亲和素，6.生物素-TAR，7.Tat，8.第三代PAMAMdendrimers.

图6A：QCM的质量改变量与Tat浓度的关系图.

图6B：QCM的质量改变量与第三代含聚酰胺-胺型树状化合物浓度的关系图.

具体实施方式

实施例一：

Tat(Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg)购自上海生工生物工程有限公司，TAR RNA(biotin-5’-GCCAGAUCUGAGCCUGGGAGUCUCUGGC-3’)购自大连宝生物公司。聚酰胺-胺型树状化合物购自Aldrich公司。

先将QCM镀金晶片在1mg mL^-1不含糖苷亲和素(neutravidin)溶液中浸泡30分钟，以得到neutravidin修饰的QCM镀金晶片。依次用缓冲溶液和二次蒸馏水冲洗，测量频率。接着将neutravidin修饰的QCM镀金晶片在1.0×10^-6M biotin-TAR RNA溶液中浸泡60分钟，以得到biotin-TAR RNA修饰的QCM镀金晶片。洗净后，测量频率。再在第三代含胺树枝状聚合物(浓度为3.0×10^-7mol/L)或Tat溶液(浓度为1.3×10^-4mol/L)中浸泡60分钟，再洗净后测量频率。然后将吸附有第三代聚酰胺-胺型树状化合物或Tat的镀金晶片浸入Tat或聚酰胺-胺型树状化合物溶液中浸泡60分钟，再洗净后测量频率。实验结果如图5所示。

图5中，横坐标为时间(分)，纵坐标为质量变化值(ng)。

A曲线：在QCM镀金晶片上各种物质的吸附次序：1.不含糖苷亲和素2.biotin-TAR，3.PAMAM dendrimers，4.Tat。

B曲线：在QCM镀金晶片上各种物质的吸附次序：5.不含糖苷亲和素，6.biotin-TAR，7.Tat，8.PAMAM dendrimers.

图5A曲线表明将吸附有TAR-第三代聚酰胺-胺型树状化合物配合物的QCM镀金晶片浸入Tat溶液后，没有明显的质量改变，说明第三代聚酰胺-胺型树状化合物可抑制Tat与TAR RNA的结合，这可能是由于第三代聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的相互作用改变了TAR的构型。但将吸附有TAR-Tat配合物的QCM金片浸入第三代聚酰胺-胺型树状化合物溶液后，可观察到明显的质量改变(图5B曲线)，这可能是由于形成了TAR-Tat-第三代聚酰胺-胺型树状化合物三元配合物。

图6A曲线表明吸附到含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的Tat的质量随其浓度的增加而增加，当其浓度达到3.4×10^-4mol/L时，Tat在含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的吸附趋近饱和，即达到与TAR RNA的最大结合比。图6B曲线表明吸附到含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的第三代聚酰胺-胺型树状化合物的质量随其浓度的增加而增加，当其浓度达到1.0×10^-5mol/L时，第三代聚酰胺-胺型树状化合物在含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的吸附趋近饱和，即达到与TAR RNA的最大结合比。另外，目前一种常用的药物新霉素在1.0×10^-4mol/L时才能与TAR趋近于饱和吸附。[N.Tassew，M.Thompson.Biophys.chem.Vol 106 241-252(2003)]

将1/Γ与1/C作图，其斜率为K_D/Γ_∞，截矩为1/Γ_∞。计算结果表明，Tat-TAR的表面结合常数(K_D^-1)为1.1×10⁵M^-1，与文献[N.Tassew，M.Thompson，Biophys.Chem.，Vol 106 241-252(2003)]报道的结合常数值基本一致。而TAR-第三代聚酰胺-胺型树状化合物的表面结合常数(K_D^-1)为1.8×10⁷(mol/L)^-1，是前者表面结合常数的100倍，说明第三代聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的亲和性强于Tat。而且第三代聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的结合常数要比目前使用的一种药物新霉素和TAR的结合常数要大1000倍。

实施例二：

实验方法和原料同实施例一，所不同处在于所用的聚酰胺-胺型树状化合物为第一代，其结构如图3中第一代化合物。

吸附到含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的第一代聚酰胺-胺型树状化合物的质量随其浓度的增加而增加，当其浓度达到1.0×10^-4mol/L时，第一代聚酰胺-胺型树状化合物在含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的吸附趋近饱和，即达到与TAR RNA的最大结合比。

而TAR-第一代聚酰胺-胺型树状化合物的表面结合常数(K_D^-1)为1.8×10⁵M^-1，说明第一代聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的亲和性与Tat的相当。但它与TAR的结合常数要比目前使用的一种药物新霉素和TAR的结合常数要强。

实施例三：

实验方法和原料同实施例一，所不同处在于所用的聚酰胺-胺型树状化合物为第五代，其结构如图6中的第五代

实验表明吸附到含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的第五代聚酰胺-胺型树状化合物的质量随其溶液浓度的增加而增加，当其浓度达到1.0×10^-5mol/L时，第五代聚酰胺-胺型树状化合物在含TAR RNA的QCM镀金晶片表面的吸附趋近饱和，即达到与TAR RNA的最大结合比。

将1/Γ与1/C作图，其斜率为K_D/Γ_∞，截矩为1/Γ_∞。计算结果表明TAR-第五代聚酰胺-胺型树状化合物的表面结合常数(K_D^-1)为1.8×10⁸(mol/L)^-1，是比TAR-Tat表面结合常数大约1000倍，说明第五代聚酰胺-胺型树状化合物与TAR的亲和性强于Tat和其他聚酰胺-胺型树状化合物。

本发明优点：本发明采用分子生物学的方法研究HIV发展过程中关键环节—复制反式激活蛋白和反式激活反应区域的相互作用，通过实验证明，本发明所采用的各种抑制剂与TAR RNA的表面结合常数都比Tat和TAR RNA的表面结合常数要大，即与Tat相比其亲和性强，该类化合物有效而又价廉，在生物体内的毒副作用很小，从而揭示了本化合物有可能成为一类十分有前途的艾滋病药物。

                            序列表

<110>中国科学院化学研究所

<120>抑制HIV-1反式激活蛋白与反式激活应答序列RNA结合用的聚酰胺-胺型树状化合物

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>29

<212>RNA

<213>人工合成

<400>1

gccagaucug agccugggag cucucuggc                                              29

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5                   10