进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌、含有该利斯特氏菌的疫苗及其用途

摘要

本发明提供了进入非吞噬细胞被减毒的利斯特氏菌属和包括给予含有该减毒利斯特氏菌组合物诱导免疫应答的多种方法。其中一些减毒利斯特氏菌是在编码侵染素如内化素B的基因中至少含有一个突变的突变利斯特氏菌。一些减毒的利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散被进一步减毒。本发明还提供了在本发明的方法中有用的药物组合物和疫苗，另外还提供了制造和改进疫苗的方法。

说明书

相关申请

本申请要求享有下述申请的优先权：美国临时申请No.60/446,051，提交日期2003年2月6日、美国临时申请No.60/449,153，提交日期2003年2月21日、美国昨时申请No.60/490,089，提交日期2003年7月24日、美国临时申请No.60/511,719，提交日期2003年10月15日、美国临时申请No.60/511,919，提交日期2003年10月15日、美国临时申请No.60/511,869专利申请，提交日期2003年10月15日和美国名称为“进入非吞噬细胞被减毒的利斯特氏菌(Listeria)、含有该利斯特氏菌的疫苗及其用途”的临时专利申请，提交日期2004年2月2日。引入上述内容作为参考。

技术领域

总体而言，本发明的领域涉及用于疫苗的减毒细菌。特别地本发明涉及在用于疫苗中的减毒单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和在治疗中应用这种疫苗的方法。

技术背景

微生物已经被开发成为递送异种抗原的疫苗。可以用经过修饰以含有编码来自不同物种的蛋白质或抗原的核酸序列的微生物递送异种抗原。异种抗原递送的特别优点是能治疗或预防毒性或致死性病原如：癌症和病原性因子(例如：HIV或乙肝病毒)所导致的疾病或病症。注射天然或毒性感染因子对受体生物体具有潜在的危害。同样，在被感染个体中偶然出现的癌细胞能够随即增殖并且同样对受体生物体具有潜在的危害。异种抗原递送的特别优势还在于已有证据表明给予减毒的或杀死的制剂或细胞不能成功地引起有效的免疫应答，或其优点还在于感染性因子或癌细胞的充分减毒的可靠性差。最近，某些细菌菌株已经被开发成重组疫苗。例如：经修饰表达鼠疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子抗原的减毒沙门氏菌口服疫苗在小鼠中表现出抗疟疾作用(Aggarwal等人，1990，J.Exp.Med.172：1083)。

可能用做异种疫苗的一类细菌是兼性细胞内细菌。针对这类细菌的免疫应答是体液性应答或细胞介导的应答或兼有上述两种应答。不过，死的细胞内细菌或细胞内细菌成分不能引发充分的细胞介导的免疫应答(Lauvau等人，2001，Science 294：1735-9)。这些细菌在其宿主循环系统或淋巴系统中游离地度过一段生命周期，在上述系统遇到宿主免疫系统的先天抗体应答(例如：体液性)。

兼性细胞内细菌也能在宿主细胞中度过一段隔绝的生命周期，在宿主细胞中免于宿主免疫系统的体液应答，而易受宿主的免疫系统产生细胞介导的应答。细胞介导的免疫应答是刺激效应T淋巴细胞(该细胞会依次成为记忆性(效应或中枢)T淋巴细胞)的免疫应答。在宿主细胞表面的抗原呈递造成细胞介导的免疫应答。宿主免疫系统的吞噬细胞可以吞入活的细菌、死的细菌或细菌成分进入溶酶体，该溶酶体成熟成为吞噬性溶酶体并且将蛋白抗原降解成肽。吞噬细胞中的吞噬性溶酶体中的抗原肽可以通过MHC II型分子呈递到这些吞噬细胞的表面以供CD4+T细胞识别和T辅助应答的激活。哺乳动物体内任何细胞的胞浆中表达的抗原肽都可以通过MHC I型分子呈递到该细胞的表面以供CD8+T细胞识别和细胞毒性T细胞(CTL)反应的激活。不过，死的细胞内细菌或细胞内细菌的成分不能侵入非吞噬细胞或不能逃脱吞噬细胞的吞噬性溶酶体而进入胞浆，结果造成吞噬细胞如巨噬细胞和树突细胞的激活和成熟。所以死的细胞内细菌或细胞内细菌成分抗原不能直接被MHC I呈递，而且不能激活CTL反应。在宿主的吞噬性溶酶体中和/或胞浆中细胞内细菌产生蛋白的能力是充分引发有效的细胞介导的免疫应答所必需要的。

最近，单核细胞增生利斯特氏菌菌株已经被开发作为异种蛋白的细胞内递送载体，该载体将抗原递送到免疫系统诱导针对不允许注射致病因子的临床病症如：癌症(美国6,051,237号专利，Paterson；美国第6,565,852号专利)和HIV(美国5,830,702号专利，Portnoy& Paterson)的免疫应答。作为兼性细胞内细菌，单核细胞增多性利斯特氏菌同时引发体液和细胞介导的细菌性抗原特异性的免疫应答。随着利斯特氏菌进入宿主生物体的细胞，利斯特氏菌产生能够使其逃脱吞噬性宿主细胞的吞噬性溶酶体的利斯特氏菌特异性蛋白，进入细胞的胞浆。在细胞中，单核细胞增生利斯特氏菌增殖，表达存活所必需的蛋白同时还表达可操作地连接到利斯特氏菌启动子上的异种基因。通过MHC蛋白将这些异种蛋白的肽呈递到吞噬细胞表面，产生T细胞反应。因为单核细胞增生利斯特氏菌是革兰氏阳性、食品携带的(food-borne)的人和动物病原，它能造成免疫妥协(immuno-compromise)个体和孕妇的严重感染，所以必需将这些细菌菌株减毒，以降低对宿主的毒性，同时保持疫苗的免疫原性。该毒性是对宿主的多个组织和器官如：肝脏、脾脏和中枢神经系统的细菌性侵入的结果。降低与使用单核细胞增生利斯特氏菌的风险而不影响其诱导特异于与选择的感染性和恶性疾病相关的异种编码抗原的获得性细胞介导的免疫性的能力是有益的。

发明简述

总体而言，本发明提供减毒的利斯特氏菌(Listeria)，具体而言提供了单核细胞增生利斯特氏菌，以及提供了将这些利斯特氏菌应用到疫苗中的方法。该疫苗对于诱导免疫应答和治疗和/或预防广泛的包括癌症在内的疾病有用。

一方面，本发明提供了分离的进入非吞噬细胞被衰减(例如：是内化素缺陷，如：内化素B)并含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子的利斯特氏菌。在某些实施方案中，该细菌的细胞到细胞的扩散被进一步衰减(例如：是ActA缺陷)。在某些实施方法中，该减毒利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。在某些实施方案中，通过使该利斯特氏菌结合抗体或抗体片段而使该细菌减毒。还提供了含有所述利斯特氏菌的免疫原性组合物，其为疫苗含有该细菌和药学上允许的载体和/或佐剂。另外，还提供了在宿主中诱导对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法，该方法包括对宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物，还提供了预防或治疗宿主疾病(如癌症或感染性疾病)的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物。还提供了含有减毒利斯特氏菌的分离的专门的抗原呈递细胞。

另一方面，本发明提供了分离的利斯特氏菌，其进入非吞噬细胞(例如：内化素缺陷性，如：内化素B)和细胞到细胞扩散(例如：ActA缺陷)被衰减。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。在某些实施方案中，利斯特氏菌的核酸已用核酸靶向性化合物加以修饰使该菌细胞到细胞间的扩散能力减弱。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌在inlB和actA基因上含有至少一个突变(如缺失突变)。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB菌株(又称为单核细胞增生利斯特氏菌actA^-inlB^-菌株)，该菌株保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其检索号是PTA-5562，或是该保藏菌株的内化素B和ActA同时缺陷的的突变体。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。还提供了含有该减毒利斯特氏菌的抗原性组合物，作为疫苗，其中含有减毒利斯特氏菌和药学上允许的载体和/或佐剂。另外，还提供了包括给予宿主有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物以诱导宿主对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法。还提供了包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物以预防或治疗宿主疾病(如：癌症、李氏特菌病或由非利斯特氏病原体引起的疾病)的方法。进一步提供了含有利斯特氏减毒细菌的专门的抗原呈递细胞。

在另外的方面，本发明提供了疫苗，其中含有(a)进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌，和(b)药学上允许的载体和/或佐剂。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是内化素B缺陷的。在某些实施方案中，在该疫苗中的减毒利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是利斯特氏菌株的突变株。提供了包括向宿主给予有效量的该疫苗以诱导宿主对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法。还提供了包括向宿主给予有效量的该疫苗以预防或治疗宿主疾病的方法。

另外，本发明提供了含有利斯特氏菌的、分离的、专门抗原呈递的细胞，其中该利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减(例如：内化素如内化素B缺陷)。在某些实施方案中，该细菌的细胞到细胞的扩散被进一步衰减(例如：ActA缺陷)。在某些实施方案中，在专门抗原呈递细胞中的减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。在某些实施方案中，该利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。本发明还提供了诱导宿主对某一抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的专门抗原呈递细胞，其中减毒利斯特氏菌含有编码抗原的核酸。另一方面，本发明提供包括给予宿主有效量的该专门的抗原呈递细胞以预防或治疗宿主疾病的方法。

另外，本发明提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHCII类抗原呈递(体内或体外)的方法，该方法包括用抗呈递细胞接触减毒的利斯特氏特细菌，其中的减毒的利斯特氏菌进入非吞噬型细胞被衰减。而且该利斯特氏菌中含有编码包括MHC I类表位或MHC II类表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。

另外，本发明提供诱导宿主对某一抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)用抗原呈递细胞(例如：来自宿主的抗原呈递细胞)接触减毒利斯特氏菌，其中的减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，而且该利斯特氏菌中含有编码该抗原的核酸分子，和(b)向宿主给予该抗原呈递分子。

另外，本发明提供预防或治疗宿主疾病(如：癌症)的方法，该方法包括向宿主给予含有突变的利斯特氏菌株的疫苗，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。

另外，本发明提供了诱导宿主对某一抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有突变的利斯特氏菌株的组合物，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，而且该菌株中含有编码该抗原的核酸分子。

另外，本发明提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHCII类抗原呈递的方法，该方法包括用抗原呈递细胞接触突变的利斯特氏特菌株，其中突变的利斯特氏菌株相对非突变的利斯特氏菌株，进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且该菌株中含有编码分别包含MHC I类表位或MHC II类表位的抗原的异源核酸分子。

另外，本发明提供了诱导宿主对某一抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)在适宜的条件下用来自宿主的抗原呈递细胞接触突变的利斯特氏菌株充分的时间，使抗原呈递细胞荷载(load)，其中的突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且其中含有编码抗原的核酸分子。和(b)向宿主给予抗原呈递细胞。在某些实施方案中，该抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。

另外，本发明提供了降低在疫苗中应用的利斯特氏菌株的病原性的方法，该方法包括修饰该菌株使该菌株进入非吞噬细胞能力降低，但基本上保留了该菌株进入吞噬细胞的能力。这些方法可包括编码指导对于特别的非吞噬细胞的细菌趋性(侵染素)的蛋白的基因中的缺失突变，或可包括用屏蔽所述的侵染素的多克隆或单克隆抗体处理细菌，从而抑制非吞噬细胞感染。

另外，本发明提供了选择性地将蛋白递送到宿主吞噬(相对非吞噬性)细胞中的方法，该方法包括向宿主给予组合物，该组合物含有突变的利斯特氏菌株其相对非突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减、但基本保留了进入非吞噬细胞的能力，其中的突变的利斯特氏菌株基因组表达的蛋白在至少一个编码侵染素(又称为“侵染素蛋白质”)如：内化素的基因上含有至少一个突变。

另外，本发明提供了制造疫苗的方法。例如：本发明提供了制造疫苗的方法，其包括用抗原呈递细胞在体内或离体接触突变的利斯特氏菌株充分的时间，使抗原呈递细胞荷载，其中的突变的利斯特氏菌株相对于非突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且含有编码抗原的核酸分子。

在上述的各方面的某些实施方案中，突变的利斯特氏菌株是突变的单核细胞增生利斯特氏菌株，该菌株内化素B缺陷和/或在该编码内化素B(inlB)的基因上和/或调节其表达的元件上至少含有一个突变。另外，在上述各个方面的实施方案中，该突变的菌株内化素B和actA都缺陷和/或在inlB基因和actA基因二者上和/或调节它们表达的元件上含有至少一个突变。

另外，本发明提供了多种在上述方法中有用的组合物和菌株及其应用。例如：一方面，本发明提供了含有突变的利斯特氏菌株和药剂上允许的载体的药物组合物，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。在一个实施方案中，突变的菌株的基因组在编码侵染素(例如：侵染素蛋白)如：内化素的至少一个基因上和/或在调节它表达的元件中含有至少一个突变。

另外，本发明提供了一种免疫原性组合物，其中含有突变的利斯特氏菌株，其中相对非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且含有编码抗原的异源核酸分子。

一方面，本发明提供了含有突变利斯特氏菌株的疫苗，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。

另外，本发明提供了专门抗原呈递的细胞，如：树突细胞，其包含突变的利斯特氏菌株，相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。

在上述各方面的某些实施方案中，突变的利斯特氏菌株是单核细胞增生利斯特氏菌的突变株。

在上述各方面的某些实施方案中，该突变的利斯特氏菌株是内化素B缺陷的。在上述各方面的某些实施方案中，具有内化素B缺陷的突变的利斯特氏菌株的基因组中在编码内化素B(inlB)的基因、和/或调控它表达的元件上含有至少一个突变。在其它实施方案中从突变的利斯特氏菌株的基因组中缺失了inlB。

在上述各方面的另外的实施方案中，该突变的菌株的内化素B和ActA缺陷，在某些实例方案中，该突变的菌株在inlB基因(和/或调节inlB基因表达的元件)和actA基因(和/或调节actA基因表达的元件)上含有至少一个突变。

另外，本发明提供了预防或治疗宿主疾病(如：癌症)的方法。该方法包括向宿主给予含有突变的利斯特氏菌株的疫苗的方法，其中的突变的利斯特氏菌株内化素B缺陷。

另外，本发明提供了诱导宿主对某一个抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有突变的利斯特氏菌株的组合物，其中的突变的利斯特氏菌株内化素B缺陷，并且含有编码该抗原的核酸分子。

另外，本发明提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHC II类抗原呈递的方法(在体外或体内)，该方法包括用抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B缺陷，并且含有分别编码包括MHC I类表位或MHC II类表位的抗原的异源核酸分子。

另外，本发明提供诱导宿主对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括下列步骤：(a)在适宜的条件用来自宿主的抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触充分的时间，使抗原呈递细胞荷载，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B缺陷，而且含有编码抗原的核酸分子；和(b)向宿主给予该抗原呈递细胞。在一个实施方案中，该抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。

另外，本发明提供降低应用于疫苗的利斯特氏菌株的病原性的方法，该方法包括修饰该利斯特氏菌株，使之内化素B缺陷。

另外，本发明提供制造疫苗的方法。例如：本发明提供制造疫苗的方法，其包括用抗原呈递细胞在适宜的条件和充分的时间下接触突变的利斯特氏菌株，使抗原呈递细胞荷载，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B缺陷。

另外，本发明提供多种组合物和在上述方法中有用的菌株以及其它应用。例如：一方面，本发明提供含有突变的利斯特氏菌株和药学上可接受的载体的药物组合物，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B缺陷。在一个实施方案中，突变的菌株的基因组中在inlB或在调节它表达的元件上含有至少一个突变。

另外，本发明提供含有突变的利斯特氏菌株的免疫原性组合物，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B突变，并且含有编码抗原的异源核酸分子。

另外，本发明提供含有突变的利斯特氏菌株的疫苗，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B缺陷。

另外，本发明提供专门的抗原呈递细胞，如：树突细胞，其含有突变的利斯特氏菌株，其中的突变的利斯特氏菌株的内化素B突变。

在上述各方面的某些实施方案中，该突变的利斯特氏菌株是突变的单核细胞增生利斯特氏菌株。

在上述各方面的某些实施方案中，突变的利斯特氏菌株的基因组为内化素B缺陷，其中包括在编码内化素B基因(inlB)和/或调控它表达的元件上至少含有1个突变。在其它实施方案中，从突变的利斯特氏菌株的基因组中缺失了inlB。

在上述各方面的其它实施方案中，该突变的菌株为内化素B和ActA同时缺陷。在某些实施方案中，该突变的菌株在inlB基因(和/或调节inlB基因表达的元件)和actA基因(和/或调节actA基因表达的元件)双方上含有至少一个突变。

另外，本发明提供了单核细胞增生利斯特氏菌株，该菌株同时具有内化素如：内化素B和ActA缺陷。一方面，本发明提供了单核细胞增生利斯特氏菌株，其为内化素B和ActA都缺陷。在某些实施方案中，inlB基因和actA基因均已经突变。在一个实施方案中，inlB基因和actA基因均已被缺失。在一个实施方案中，该菌株是单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB双突变株(又称为单核细胞增生利斯特氏菌actA^-inlB^-双突变株)。该菌株在2003年10月3日保藏到美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且检索号为PTA-5562。在另外的实施方案中，该菌株是定义为PTA-5562的突变的菌株。其中相对于野生型单核细胞增生利斯特氏菌该突变株进入非吞噬细胞被衰减。

还提供了包括含有上述任何菌株的疫苗的培养物、免疫原性组合物和药物组合物。还提供了用于任何一个或全部上述的方法的这些特殊菌株的应用。

附图说明

图1是注射到用所示的利斯特氏菌株或对照载体免疫的小鼠后的靶细胞群。相对于非特异靶细胞，抗原特异性靶细胞的降低的水平表明在体内产生了对接种疫苗的细胞毒性T细胞反应。图1A表示用ΔactA突变株或ΔactAΔinlB双突变株IV或IM疫苗接种的小鼠的体内细胞毒性。图1B表示用ΔactA突变株或ΔactAΔinlB双突变株IV疫苗接种的小鼠的体内细胞毒性。图1C表示用ΔactAΔinlB双突变株IV疫苗接种的小鼠的体内细胞毒性。

图2表示用突变的利斯特氏菌株或对照治疗性接种带有建立的CT26肺肿瘤的小鼠的肺(图2A)。可以在肺上看到肺转移的斑点。关于小鼠生存期的另外2个研究表示在图2B-C中。

图3表示用IFN-γ和TNF-α细胞内细胞因子染色(ICS)分析来自用突变的利斯特氏菌株接种、用SL8OVA_257-264肽(图3A-B)、LLO₁₉₀肽(图3C-D)或LLO₂₉₆肽(图3E-F)刺激的小鼠的脾的CD8+T细胞结果。(PCT表示S-59/UVA失活细胞的数据)。

图4表示INF-γICS分析来自用突变利斯特氏菌接种、用SL8OVA_257-264肽、活的或S-59/UVA灭活的EL-4细胞、或活的或S-59/UVA灭活的OVA表达EG7细胞刺激的小鼠的脾细胞的结果。

图5表示IFN-γICS分析来自用不同剂量的突变的利斯特氏菌接种(静脉内)、用SL8 OVA_257-264肽刺激的小鼠的脾细胞的结果。

图6表示IFN-γICS分析来自以不同途径用突变的利斯特氏菌接种、用SL8 OVA_257-264肽刺激的小鼠的脾细胞的结果。

图7A和图7B表示在体内单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株的加速清除。图中显示了肝中细菌水平随时间的变化。

图8A和图8B表示在体内单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株的加速清除。图中展示了在脾细胞中细菌水平的经时变化。

图9表示在体外进入非吞噬细胞而不是吞噬细胞被衰减的单核细胞增生利斯特氏菌ΔinlB株和单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株。

图1O表示高滴度抗利斯特氏菌血清抑制非吞噬细胞而不是吞噬细胞的摄取。

图11A表示含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌株的衰减作用作为补骨质素S-59的浓度的函数和向树突细胞系呈递OVA抗原的测量。相对于未处理的细菌的对数滴度和抗原呈递的百分比(线性范围，1利斯特氏菌株/DC2.4细胞)对于nM S-59(5.5J/cm²UVA作用、洗涤1次利斯特氏菌，再用0.5J/cm²的UVA作用)作图。

图11B表示含有OVA抗原的DP-L4029ΔuvrAB利斯特氏菌株的衰减作为补骨质素S-59的浓度的函数和向树突细胞系呈递OVA抗原的测量。相对于未处理的细菌的对数滴度和抗原呈递的百分比(线性范围，1利斯特氏菌株/DC2.4细胞)对nM S-59(剂量为5.5J/cm²UVA作用、洗涤1次利斯特氏菌，再用0.5J/cm²的UVA作用)作图。

图11C表示含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌株的衰减作为补骨质素S-59的浓度的函数和向树突细胞系呈递OVA抗原的测量。

图11D表示含有OVA抗原DP-L4029ΔuvrAB(ΔactAΔuvrAB)利斯特氏菌株的衰减作为补骨质素S-59的浓度的函数和向树突细胞系呈递OVA抗原的测量。

图12A表示在抗利斯特氏菌免疫性存在的情况下诱导的OVA特异性的T细胞应答。

图12B表示在利斯特氏菌免疫性存在的情况下，刺激的有效的抗肿瘤免疫应答。

图12C表示利斯特氏菌免疫血清的转换不能防止OVA特异性的CD8+细胞的致敏(priming)。

发明详述

I前言

本发明提供进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌(例如：内化素如内化素B缺陷的突变的利斯特氏菌株)。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散进一步衰减。在某些实施方案中，已经通过对该菌株的修饰极大地减小了重组利斯特氏菌的毒性，并且充分保留了该菌株的免疫原性。所以，首次实现了该减毒利斯特氏菌的免疫原性和该菌株的毒性的成功分离。本发明提供了含有该减毒利斯特氏菌的药物组合物、免疫原性组合物和疫苗和这些减毒利斯特氏菌和含有利斯特氏菌的组合物诱导包括对宿主有治疗效果的免疫应答的免疫应答的应用。该疫苗和方法可用于预防由利斯特氏菌造成的感染性疾病或进行异种性抗原如肿瘤相关抗原或源自非利斯特氏菌的病原的抗原的递送。

特别是，本发明提供减毒的单核细胞增生利斯特氏菌株，该菌中已经缺失了inlB基因(例如：进入非吞噬细胞(如通过c-met受体进入肝细胞)被衰减的菌株，)或同时缺失了actA基因和inlB基因(例如：进入非吞噬细胞和细胞到细胞的传递被衰减的菌株)。据测定，和野生型单核细胞增多性利斯特氏菌株相比，该ΔactAΔinlB菌株的毒性低将近1000倍(见下述实施例2和表1)。已证明ΔactAΔinlB利斯特氏菌株和ΔinlB利斯特氏菌株进入非吞噬性人细胞被衰减(见下述实施例9和图9)。用表达异种抗原的ΔinlB和ΔactAΔinlB利斯特氏菌株接种表明能够诱导出抗原特异性的T细胞(见下述实施例5-7和图3A、3B和4-6)。另外，用表达异种抗原的ΔactAΔinlB利斯特氏菌株接种还表明能够在体内诱导针对抗原特异的靶细胞的有效的强大的细胞毒性反应(见下述实施例3和图1)。而且，用表达异种抗原的ΔactAΔinlB利斯特氏菌株进行治疗性接种表明在结直肠癌的小鼠模型中能够有效地降低肺转移的数量和增加生存率(见下述实施例4和图2A-C)。另外，已经表明ΔactAΔinlB利斯特氏菌从肝和脾中的清除要比野生型利斯特氏菌、ΔactA利斯特氏菌株、或ΔinlB利斯特氏菌株快很多(见下述实施例8和图7-8)。即actA和inlB的缺失突变组合的作用是协同的，造成当给予高IV剂量的细菌时，从动物的肝脏中的清除很快。

因此，本发明提供了进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌(例如：内化素如内化素B缺陷)，其中含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在某些实施方案中，该细菌细胞到细胞的扩散被进一步衰减(例如，ActA缺陷)。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。还提供了含有利斯特氏菌的免疫原性组合物、其为疫苗，含有细菌和药剂上可接受的载体和/或佐剂的疫苗。另外，提供了诱导宿主对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物，还提供了预防或治疗宿主疾病(如癌症或感染性疾病)的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物。还提供了用含有减毒利斯特氏菌的专门的抗原呈递细胞。

本发明还提供了进入非吞噬细胞(例如内化素如内化素B缺陷)和细胞到细胞扩散(如ActA缺陷)被衰减的利斯特氏菌。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌在inlB和actA基因上含有至少一个突变(如缺失突变)。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，检索号为PTA-5562的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB株，或该保藏菌株的突变体，该突变体为同时内化素B和ActA缺陷。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌含有编码非利斯特氏抗原的核酸分子。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏属。还提供了含有减毒利斯特氏菌的的免疫原性组合物，其为疫苗同时含有减毒利斯特氏菌和药剂上允许的载体和/或佐剂。另外提供了在宿主中诱导对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物。还提供了预防或治疗宿主疾病(如癌症、利斯特氏菌病或由非利斯特氏菌病原引起的疾病)，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物。进一步提供了含有减毒性利斯特氏菌的专门的抗原呈递细胞。

本发明进一步提供了一种疫苗，其中含有(a)减毒的利斯特氏菌，其中减毒性利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，和(b)药剂上可接受的载体和/或佐剂。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是内化素B缺陷的。在某些实施方案中，在该疫苗中的减毒利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。提供了在宿主中诱导产生对非利斯特氏菌抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的该疫苗。还提供了预防或治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主给予有效量的该疫苗。

另外，本发明提供了含有减毒利斯特氏菌的专门的抗原呈递细胞，其中的减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减(如内化素如内化素B缺陷)。在某些实施方案中，该细菌细胞到细胞的扩散被进一步衰减(如ActA缺陷)。在某些实施方案中，专门抗原呈递细胞中的减毒利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株。在某些实施方案中，该利斯特氏菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。本发明还提供了在宿主中诱导对某一抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的专门的抗原呈递细胞，其中的减毒利斯特氏菌含有编码抗原的核酸分子。另外，本发明还提供了预防或治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主给予有效量的专门的抗原呈递细胞。

本发明还提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHC II类抗原呈递的方法(体外或体内)，该方法包括用抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌接触，其中的突变的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，而且其中含有编码包括MHC I类表位或MHC II类表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。

另外，本发明提供在宿主中诱导对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)用来自宿主的抗原呈递细胞和减毒的利斯特氏菌接触，其中减毒的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且其中含有编码该抗原的核酸分子；和(b)向宿主给予抗原呈递细胞。

另外，本发明提供在宿主中诱导对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有突变的利斯特氏菌株的组合物，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且其中含有编码该抗原的核酸分子。在宿主内，通过突变的利斯特氏菌表达该抗原诱导免疫应答。

本发明还提供了预防或治疗宿主疾病(如癌症)的方法，该方法包括向宿主给予包含突变的利斯特氏菌株的疫苗，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。

本发明还提供了抗原呈递细胞上诱导MHC I类抗原呈递或MHC II类抗原呈递的方法，该方法包括用抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触，其中相对于非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留进入吞噬细胞的能力，而且其中含有编码分别包括MHC I类表位或MHC II类表位的抗原的异源核酸分子。

另外，本发明提供了在宿主中诱导对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)在适宜的条件下用来自宿主的抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌接触充分的时间，使抗原呈递细胞荷载，其中相对非突变的利斯特氏菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且其中含有编码抗原的核酸分子；和(b)向宿主给予抗原呈递细胞。在一个实施方案中，该抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。

本发明提供了在宿主中诱导对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的包含突变的利斯特氏菌株的组合物，其中突变的利斯特氏菌株内化素B缺陷，并且其中含有编码该抗原的核酸分子。在宿主中，突变的利斯特氏菌表达该抗原诱导免疫应答。

本发明还提供了预防或治疗宿主疾病(如癌症)的方法，该方法包括向宿主给予有效量的包含突变的利斯特氏菌的疫苗，其中突变的利斯特氏菌株为内化素B缺陷。

本发明还提供了抗原呈递细胞上诱导MHCI类抗原呈递或MHC II类抗原呈递的方法，该方法包括用抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌接触，其中突变的利斯特氏菌内化素B缺陷，而且其中含有编码分别包括MHC I类表位或MHC II类表位的抗原的异源核酸分子。

另外，本发明提供了在宿主中诱导对某种抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)用来自宿主的抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触，在适宜的条件和充分的时间下，使抗原呈递细胞荷载，其中突变的利斯特氏菌内化素B缺陷，并且其中含有编码抗原的核酸分子；和(b)向宿主给予抗原呈递细胞。

本发明还提供了药物组合物、免疫原性组合物和疫苗，含有突变的利斯特氏菌株，相对于非突变的菌株，突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，该利斯特氏菌的突变株为一个或多个侵染素缺陷，如内化素B。例如，在某些实施方案中，该突变的利斯特氏菌株是突变的单核细胞增生利斯特氏菌株，在一个或多个编码内化素蛋白(如内化素B)的基因和/或在调节某个内化素蛋白基因(如inlB基因)表达元件上含有突变。在某些实施方案中，该菌株为内化素蛋白缺陷，如内化素B，或另一种利斯特氏蛋白缺陷，如ActA。

本发明进一步提供了新型的单核细胞增生利斯特氏菌株，该菌株为同时内化素B和ActA缺陷。例如：在某些实施方案中，同时缺失inlB基因和actA基因。在一个实施方案中，该菌株是在2003年10月3日保藏到美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其检索号为PTA-5562的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔinlB双突变株。

II减毒利斯特氏菌

已将本发明的减毒利斯特氏菌开发用于向专门的抗原呈递细胞(APCs)如：巨噬细胞、噬中性细胞和树突状细胞的溶酶体和/或胞质(cytosol)表达和递送一种或多种抗原，同时减少细菌进入非APCs，如器官的细胞和非免疫系统的细胞。相应的，应用于本发明的组合物、疫苗和方法的利斯特氏菌，进入非吞噬行细胞(相对于未进行相关的减毒修饰的如野生型的利斯特氏菌株的利斯特氏菌)被衰减。

此处的术语“减毒的(衰减的)利斯特氏菌”和“修饰的利斯特氏菌”(或减毒的利斯特氏菌和修饰的利斯特氏菌)互换使用，表示利斯特氏细菌(或利斯特氏菌)，其进入非吞噬行细胞的能力(相对于野生型利斯特氏菌)被衰减。可以明确此处描述的减毒的利斯特氏菌(如：修饰的利斯特氏菌)或是非天然存在的利斯特氏菌或是天然存在的利斯特氏菌，但现在已经被分离出来和/或现在已经不是天然存在的形式。用于此处的术语“非减毒的利斯特氏细菌”和“未修饰的利斯特氏细菌”(或“非减毒的利斯特氏菌”和“未修饰的利斯特氏菌”)是可以互换使用的，表示利斯特氏细菌(或利斯特氏菌)不含有特别的修饰，该修饰使另外的利斯特氏细菌或利斯特氏菌进入非吞噬细胞(相对于野生型利斯特氏菌)衰减毒。与此相对应，野生型利斯特氏菌是未修饰的利斯特氏菌的一个例子。

在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏细菌是突变的利斯特氏菌株成员，其中在该突变的利斯特氏菌株的基因组中的突变使该利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减。在某些实施方案中，已经用不同于或除了突变以外的手段对该减毒利斯特氏细菌进行修饰，使其进入非吞噬细胞被衰减(如用抗体结合该利斯特氏菌)。

在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏细菌不仅进入非吞噬细胞相对于未修饰的利斯特氏菌如野生型利斯特氏菌被衰减，而且该减毒利斯特细菌细胞到细胞的扩散相对于未修饰的利斯特氏菌被进一步衰减。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌属于突变的利斯特氏菌株，其中含有1个或多个突变使利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散被衰减。在某些实施方案中，已经用不同于或除了突变以外的手段对该利斯特氏细菌进行修饰，使其细胞到细胞的扩散被衰减(如用S-59/UVA处理)。

该减毒利斯特氏菌属于利斯特氏菌属，在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌属于选自单核细胞增生利斯特氏菌、伊氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)、斯氏利斯特氏菌(Listeria seeligeri)或无害利斯特氏菌(Listeria innocua)的种。而且，本发明包括多种利斯特氏菌种的菌株的突变(例如：正常表达内化素B的菌株或等价物)，特别是这些细菌通常是病原性的和/或用侵染素入侵非吞噬性真核细胞。在一个实施方案中，突变的利斯特氏菌株是利斯特氏菌病原性菌株。在一个实施方案中，被突变的利斯特氏菌株产生至少一种侵染素。在另外的实施方案中，该菌株是单核细胞增生利斯特氏菌株、伊氏利斯特氏菌、斯氏利斯特氏菌或无害利斯特氏菌。在另外的实施方案中，该利斯特氏菌突变株是单核细胞增生利斯特氏菌突变株。

本发明还进一步提供了所述减毒利斯特氏菌的培养物，如突变菌株的培养物。

A.进入非吞噬细胞的衰减

通常，本发明的减毒的利斯特氏菌是包括一个或多个修饰的利斯特氏菌，因此相对于没有使进入非吞噬细胞被衰减的修饰的相同的利斯特氏菌(“未修饰的利斯特氏菌”或“非减毒的利斯特氏菌”)，其进入非吞噬细胞被衰减(“修饰的利斯特氏菌”或“减毒的利斯特氏菌”)。进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌对来自非吞噬细胞的细胞外环境中的非吞噬细胞中的至少一种类型的感染能力小于相同种属的野生型的利斯特氏菌。在某些实施方案中，相对于野生型利斯特氏菌，该减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力至少降低大约10％、至少降低大约25％、至少降低大约50％、至少降低大约75％、或至少降低大约90％。在某些实施方案中，相对于相同属的野生型利斯特氏菌，该减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力至少降低大约50％。在其它的实施方案中，该减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力至少降低大约75％。

在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌属于突变的利斯特氏菌株，相对于不带有一个或多个突变的相同的利斯特氏菌(“非突变的”利斯特氏菌株)，在该菌株的基因组上含有一个或多个能够引起进入非吞噬细胞被衰减的突变(“突变的”利斯特氏菌株)。相对于未修饰的(未突变的)利斯特氏菌株，该减毒利斯特氏菌株进入非吞噬细胞的能力可以降低至少大约10％、至少降低大约25％、至少降低大约50％、至少降低大约75％、或至少降低大约90％。

可以理解该减毒的利斯特氏菌，如突变的利斯特氏菌株并非必需进入一种以上的非吞噬细胞被衰减。例如：该减毒菌株可以进入肝细胞被衰减，而不是进入上皮细胞被衰减。在其它实例中，该减毒菌株可以进入上皮细胞衰减而不是进入肝细胞衰减。还可以明确特别修饰的利斯特氏菌进入非吞噬细胞的衰减是突变指定的基因的结果，如：缺失突变编码和特定的细胞受体作用促进了非吞噬细胞的感染的侵染素蛋白质。例如：利斯特氏ΔinlB突变菌株进入包括肝细胞系(如HepG2)和原发性肝癌细胞在内的表达肝细胞生长因子受体(c-met)的非吞噬细胞被衰减。

在某些实施方案中，即使该利斯特氏菌(突变的利斯特氏菌)进入非吞噬细胞被衰减，该利斯特氏菌仍然能被例如至少被树突细胞和/或巨噬细胞的吞噬细胞所摄取。在一个实施方案中，该减毒利斯特氏菌进入吞噬细胞的能力不会因为对该菌株的修饰而减小，如：侵染素的突变(例如：据测定，在修饰后该菌株被吞噬细胞所摄取的能力保留了将近95％或更多)。在其它实施方案中，该减毒利斯特氏菌进入吞噬细胞的能力被减少不超过大约10％、不超过大约25％、不超过大约50％或不超过大约75％。

用本领域技术人员已知的方法在体外分析测定利斯特氏菌(如突变的利斯特氏菌)进入非吞噬细胞是否被衰减。例如：在Dramsi等人，Molecular Microbiology 16：251-261(1995)和Gaillard等人，Cell 65：1127-1141(1991)中都描述了筛选分析单核细胞增生利斯特氏菌突变株进入特定细胞系的能力的方法。例如：测定和比较带有特定修饰的减毒利斯特氏菌进入特定类型的非吞噬细胞的能力和没有修饰的相同利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力，由此测定该减毒利斯特氏菌进入特定类型的非吞噬细胞是否被衰减。与此类似，测定和比较带有特定突变的减毒的利斯特氏菌进入特定类型的非吞噬细胞的能力和没有突变的利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力，由此测定该减毒利斯特氏菌进入特定类型的非吞噬细胞是否被衰减。

在本发明的某些实施方案中，该利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力的减毒量的范围从降低2倍到更大水平的衰减。在某些实施方案中，该利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力的衰减至少在大约0.3log、大约1log、大约2log、大约3log、大约4log、大约5log或至少大约6log。在某些实施方案中，衰减范围至少大约为0.3至＞8log、大约2至＞8log、大约4至＞8log、大约6至＞8log、大约0.3-8log、大约0.3-7log、大约0.3-6log、以及大约0.3-5log、以及大约0.3-4log、以及大约0.3-3log、大约0.3-2og、大约0.3-log。在某些实施方案中，该衰减范围为大约1至＞8log、1-7log、1-6log、大约2-6log、大约2-5log、以及大约3-5log。

在某些实施方案中，通过该利斯特氏菌在宿主中的生物学作用测定本发明的利斯特氏菌的衰减。在小鼠或其它脊椎动物上测定其LD₅₀评价利斯特氏菌株的病原性(实施例2、表1)。LD₅₀是将利斯特氏菌注射到脊椎动物中引起50％脊椎动物死亡所需的数量或剂量。比较具有特定修饰(如突变)的利斯特氏菌和不具有特定修饰的利斯特氏菌的LD₅₀，评价衰减水平。例如：如果没有特定突变的利斯特氏菌株的LD₅₀为10³个细菌，具有特定突变的利斯特氏菌株的LD₅₀为10⁵菌，则该菌株被衰减，LD₅₀增加100倍或到2log。

另外，可以在体外非常直接测定利斯特氏菌感染非吞噬细胞的能力的衰减程度。修饰的利斯特氏菌感染非吞噬细胞如肝细胞的能力可以和未修饰的利斯特氏菌或野生型利斯特氏菌感染非吞噬细胞的能力比较。在该分析中，通常在体外将修饰的和未修饰的利斯特氏菌添加到非吞噬细胞中，经过有限定的时间周期(例如：1小时)，用含有庆大霉素的溶液洗涤细胞，并杀死细胞外细菌，裂解该细胞并且铺板测定滴度。下述实施例9和实施例10提供这种分析的例子。

可以通过其它生物学作用如组织病理学程度或血清肝酶水平对这种衰减程度进行定性测定。在用本发明的利斯特氏菌注射小鼠的临床实验中，检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白和胆红素水平。可以对带有或不带有特定修饰/突变的利斯特氏菌在小鼠上的这些作用进行比较，将其作为评价该利斯特氏菌衰减的方式。还可以用组织病理学测定和本发明相关的利斯特氏菌的衰减。从感染的脊椎动物的多种组织中如肝、脾和神经系统回收的利斯特氏菌的量也可以用于减毒水平的测定，即比较用突变的和非突变的利斯特氏菌注射的脊椎动物中的这些值。例如，从感染组织如肝或脾中回收利斯特氏菌的量作为时间的函数可以用于通过比较用突变的和非突变的利斯特氏菌注射的小鼠中的上述值测定减毒。

相应地，可以通过在已知是野生型利斯特氏菌靶向的小鼠的特定器官中的细菌载量测定本发明的利斯特氏菌的衰减。例如，可以将来自肝或脾的匀浆(在H₂O+0.2％NP40中匀浆)稀释液铺板BHI琼脂培养基上，通过集落计数(集落形成单位，CFU)测定本发明的利斯特氏菌的衰减。可以测定该肝或脾的cfu，例如：测定通过包括静脉内、腹膜内、肌肉内和皮下中的任何途径给予本发明的修饰的利斯特氏菌(如参见下述实施例8)后时程变化。另外，可以测定按照所述的竞争性指数分析进行给药后，肝或脾(或任何其它选定的器官)中本发明的利斯特氏菌的时程变化，并与抗药的野生型利斯特氏菌比较。

为了提供安全和有效的疫苗，在本发明的疫苗中的被非吞噬细胞摄取的细菌的衰减程度不需要达到完全衰减。在某些实施方案中，该衰减程度为能降低其毒性足以防止或降低该毒性症状不达到威胁生命的水平。

1.包含使利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减的突变的利斯特氏菌

在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌含有1个或多个突变，该突变使利斯特氏菌的其通常产生的1种或多种侵染素(又称为侵染蛋白)如内化素缺陷。在本发明的某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力的衰减是通过应用影响该细菌表达的1种或多种侵染素的突变而实现的。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株成员，该菌株进入非吞噬细胞被衰减。

在一个实施方案中，该减毒利斯特氏菌的1种或多种侵染素缺陷。如果利斯特氏菌或产生的功能性形式的侵染素的量减少、或表达部分或全部无功能的侵染素形式，或同时产生上述两种情况，则该减毒的利斯特氏菌是侵染素产生缺陷的。同样，如果该菌株的细菌或产生的功能性形式的侵染素的量减少、或表达部分或全部无功能的侵染素形式，或同时产生上述2种情况，则该利斯特氏菌株是侵染素产生缺陷的。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌的基因组在编码侵染素如内化素的基因上含有1个或多个突变。该突变任选是点突变、插入突变、终止突变、移码突变、或部分或全部编码该侵染素基因的缺失。在某些实施方案中，编码侵染素的基因(例如：inlB)缺失。

在某些实施方案中，编码侵染素基因的突变是在编码序列上的。在这些实施方案中，编码侵染素基因的突变使该蛋白与未突变的序列相比，其作为侵染素的功能减少。在某些实施方案中，编码侵染素基因的突变使该蛋白完全失去功能。

在另外的实施方案中，相对于非突变的菌株，在突变菌株中，至少有1个编码侵染素的基因的表达受到抑制。例如，该突变的利斯特氏菌的基因组可能在编码侵染素的基因上含有至少1个突变，其中的突变阻止表达。例如，该突变可在1个或多个该基因的控制序列(如启动子或核糖体结合区域)上，由此导致降低或停止该侵染素基因的表达。另外，该突变的利斯特氏菌可以在不是编码侵染素的基因上含有至少1个突变，但是该突变能造成1种或多种侵染素的表达水平降低。

侵染素是利斯特氏菌表达和所选宿主细胞表达受体相互作用的蛋白，该作用的结果是促进利斯特氏菌穿透进入宿主细胞。在利斯特氏菌的细胞壁上发现某些侵染素。其它侵染素由利斯特氏菌分泌。利斯特氏菌的侵染素包括不过不局限于内化素相关蛋白家族成员(内化素)。内化素蛋白质通常指导非吞噬细胞如肝、脾或脑细胞对利斯特氏菌的摄取。

已经在单核细胞增生利斯特氏菌中鉴定了多个内化素(Boland等人，Clinical Microbiology Reviews，2001，14：584-640)。这些内化素包括不过不局限于InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlE、InlF、InlG和InlH(Drams i等人，Infection and immunity，65：1615-1625(1997))、Raffelsbauer等人，Mol.Gen.Genet.260：144-158(1988))。以前已经报导了编码这些蛋白的基因序列。例如，在Gaillard等人，Cell，65：1127-1141(1991)中已经报导了inlA和inlB的序列，GenBank登录号M67471。在Glaster等人，Science，294：849-852(2001)(www.sciencemag.org/cgi/content/full/294/5543/849/DC1)Supplementary Web材料的Web表2中鉴定了编码其它内化素相关蛋白家族成员的基因，包括lmo0327、lmo0331、lmo0514、lmo060、lmo0732、lmo1136、lmo1289、lmo2396、lmo0171、lmo0333、lmo0801、lmo1290、lmo2026和lmo2821(可以在单核细胞增生利斯特氏菌EGD基因组，GenBank检索号第AL591824号和/或在单核细胞增生利斯特氏菌EGD-e基因组，GenBank检索号第NC_003210号中找到每个内化素相关蛋白家族成员的序列。Glaser等指出了多种内化素相关基因的定位。

在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌内化素缺陷，如上述的1种或多种内化素蛋白质或上述内化素基因编码的。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌的内化素B或其等价物是缺陷的(取决于所用的利斯特氏菌的种)。在其它实施方案中，该减毒的利斯特氏菌的内化素A或其等价物是缺陷的(取决于所用的利斯特氏菌的种)。在其它实施方案中，该减毒的利斯特氏菌的非内化素A或其等价物的1种或多种内化素是缺陷的(取决于所用的利斯特氏菌的种)。

例如，该突变的利斯特氏菌株任选是单核细胞增生利斯特氏菌株，该菌株已经被修饰而在产生功能性内化素B方面缺陷。在其它实施方案中，该单核细胞增生利斯特氏菌株被修饰，在产生内化素A(InlA)以外的内化素方面缺陷。(可以理解为包括内化素B在内的上述列出的内化素功能等价物的蛋白可存在于单核细胞增生利斯特氏菌以外的利斯特氏菌种中。相应地，在某些实施方案中，该突变的利斯特氏菌株已经被修饰，在产生功能上和内化素B等价的蛋白质方面缺陷)。

本发明的突变的利斯特氏菌株可表达比非突变利斯特氏菌株少的野生型内化素序列。另外，该突变的利斯特氏菌可表达内化素的突变形式，与非突变的利斯特氏菌表达的内化素相比，该形式是无功能的或功能减少的。在其它实施方案中，该突变的利斯特氏菌不表达特定的内化素，如内化素B，因为其中编码该内化素的大部分或全部基因序列已经缺失。

在一个实施方案中，突变的利斯特氏菌的基因组在1个或多个内化素基因上含有减毒性突变(包括但是不局限于上述所列出的)。在一个实施方案中，该进入非吞噬细胞被衰减的突变的利斯特氏菌的基因组包括在选自下述组的基因上含有至少1个突变：inlA基因、inlB基因、inlC基因、inlC2基因、inlD基因、inlE基因、inlF基因、inlG基因和inlH基因。在其它实施方案中，该突变利斯特氏菌基因组在选自下述组的基因上含有至少一个突变：inlB基因、inlC基因、inlC2基因、inlD基因、inlE基因、inlF基因、inlG基因和inlH基因。在一个实施方案中，该突变利斯特氏菌是突变的单核细胞增生利斯特氏菌，其内化素B缺陷。在其它实施方案中，该突变的利斯特氏菌是突变的单核细胞增生利斯特氏菌，而且其基因组在inlB基因上含有至少一个突变。在其它实施方案中，该突变的利斯特氏菌在inlA基因以外的内化素基因上含有至少一个突变。在其它实施方案中，该突变的利斯特氏菌在inlA基因含有至少一个突变。

在全部说明(包括图)中，另外的术语用来表示基因突变，不管其是否使利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减的突变或是其它突变(如细胞到细胞扩散的突变)。此处术语“xyz^-”、“Δxyz”和“xyz缺失突变”是可以互换的，表示至少大部分或全部xyz基因的编码序列的缺失突变体。(很多情况下，在这些突变体中，全部xyz基因被缺失)。例如，此处术语“inlB^-”、“ΔinlB”和“inlB缺失突变”通常可以互换。

InlA(内化素A)(Gaillard等人，Cell，65：1127-1141(1991)；Genbank的检索号为NC_003210)和这些内化素一样，指导上皮细胞对利斯特氏菌的摄取。通过使利斯特氏菌内化素A缺陷而使该菌株的衰减可改进该疫苗在药物和疫苗组合物的应用中的安全性。利斯特氏菌侵入肠上皮细胞能造成以发烧、头疼、腹泻或恶心为特征的胃肠道感染。

InlB(内化素B)(Gaillard等人，Cell，65：1127-1141(1991))Genbank检索号AL591975(单核细胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因组，片段3/12，inlB基因区域：nts.97008-98963)和Genbank检索号NC_003210(单核细胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因组，inlB基因区域：nts.457008-458963)，它们共同于此引入作为参考)指导肝细胞或内皮细胞如组成血脑屏障的大脑微血管的血管内皮细胞对利斯特氏菌的摄取。(内化素B的进一步描述，参见Ireton等人，J.ofBiological Chemistry，274：17025-17032(1999)；Dramsi等人，Molecular Microbiology 16：251-261(1995)；Mansell等人，J.ofBiological Chemistry，276：43597-43603(2001)和Bierne等人，J.of Cell Science 115：3357-3367(2002)，全部在此引入作为参考)。通过使菌株的内化素B缺陷而使利斯特氏菌的减毒可改进该菌株在疫苗和药物组合物中应用的安全性。利斯特氏菌感染肝细胞能造成由于肝细胞裂解产生肝炎。感染脑微血管内皮细胞造成脑膜炎，其特征是头痛、斜颈、失去平衡、慌乱、失去知觉、抽搐或死亡。成人中，利斯特氏菌引起的脑膜炎是死亡的一个重要原因。

在某些实施方案中，本发明的突变的利斯特氏菌株是其基因组含有一个或多个突变的利斯特氏菌株，所述的突变使该菌株相对于没有1个或多个突变的利斯特氏菌株，其内化素B缺陷。如果该菌株的细菌或产生功能性形成的内化素B的量减少或表达的内化素B是部分或全部无功能的，或同时发生上述两种情况，则该利斯特氏菌株内化素B缺陷。(应当理解此处的术语“内化素B”不仅指单核细胞增生利斯特氏菌的内化素B，还指其它种的利斯特氏菌的其等价物。)

在某些实施方案中，利斯特氏菌的基因组在编码内化素B(inlB)基因上含有1个或多个突变。该突变任选是点突变、插入突变、终止突变、移码突变或部分或全部编码内化素B序列的缺失突变。在某些实施方案中，利斯特氏菌的基因组中缺失全部或至少大部分的编码内化素B的序列。在某些实施方案中，缺失大部分或全部的inlB基因。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌产生无功能性的内化素B。

在某些实施方案中，inlB的突变在编码序列中。在这些实施方案中，inlB的突变使内化素B比未突变inlB序列所产生的蛋白质功能低。在某些实施方案中，inlB的突变使内化素B完全不具有功能(比未突变的利斯特氏菌的大约低100％)。在某些实施方案中，突变的利斯特氏菌表达的内化素B和未突变的利斯特氏菌的内化素B相比，至少降低大约90％的功能性、至少降低大约75％的功能性、至少降低大约50％的功能性或至少降低大约25％的功能性。

在其它的实施方案中，相对于未突变的菌株，突变的菌株的inlB表达受到抑制。例如，该突变的利斯特氏菌的基因组在inlB上含有至少1个突变，其中的突变阻止表达。例如：该突变可以在inlB的1个或多个控制序列上(如启动子或核糖体结合区域)，所以inlB的表达减少或停止。另外，突变的利斯特氏菌可以在不是inlB^-的基因上含有至少1个突变，不过该突变还是能造成内化素B的表达水平减小。在某些实施方案中，内化素B的表达可以降低大约100％、至少大约90％、至少大约75％、至少大约50％或至少大约25％。

应当理解，侵染素(invasions)是能够促进感染非吞噬细胞的细菌性蛋白，可选自内化素基因或任何其它细菌基因，所述基因编码的产物促进结合和被非吞噬细胞摄取。

通过传统的突变方法可以实现细菌突变。如：化学诱变剂或放射突变后选择突变体。还可以通过本领域技术人员重组DNA技术实现细菌突变。例如：Camilli等人Molecular Micro.8：143-147(1993)中描述的等位基因交换方法，该方法适用于产生如缺失突变体的突变体。(Camilli等人，引于此处作为参考)(参见下述实施例1，描述了等位基因交换的示范性应用)。另外，也可使用在Biswas等人，J.Bacteriol.175：3628-3635(1993)中描述的基因置换的方法。本领域技术人员已知其它类似的方法。

可以用领域内公知的多种方法确认在利斯特氏菌株中存在的特定的突变，如特定的inlB突变和/或确认该菌株的特定内化素如内化素B的产生缺陷。例如，可以克隆或测序菌株基因组的相关部分。另外，可以用编码缺失或其它突变的边缘区域的成对引物通过PCR确定特异性突变。还可用Southern印迹检测细菌基因组的改变。而且，可以用领域内的标准技术如Western印迹分析菌株是否表达了特定的蛋白质。还可以通过比较以前报道的表型和该菌株的表型的方法确定菌株在目的基因上含有突变。例如，可以比较以前报道的内化素B突变体表型和该菌株的表型，以确定该菌株的内化素B缺陷。

突变菌株任选被评价在本发明中的用处，通过评价是否该菌株进入至少1种非吞噬细胞被衰减(参见上述II.A部分)。为了测定用于本发明的方法和组合物的适宜性，还可以对该突变菌株被吞噬细胞摄取的能力进行评价。

可以通过测定菌株的LD₅₀、菌株对野生型利斯特氏菌攻击的防御、该菌株诱导针对抗原的特异性T细胞反应的能力、该菌株诱导针对表达抗原的细胞的体内细胞毒性反应的能力和/或该菌株在体内针对靶向病原体的治疗效果(例如在小鼠模型申)以及其它在领域技术人员已知的其它类型的分析方法来确定用于疫苗的特定利斯特氏菌突变体如：在特定的内化素基因(例如：inlB)上含有缺失突变的利斯特氏菌的适宜性。在下述的实施例2-7中展示了部分这些分析中的特异性的实施例。在下述的实施例2中例举了测定突变的利斯特氏菌的LD₅₀。在下述实施例5-7中，用ICS分析检测了多种突变菌株的免疫原性。在下述实施例3中，展示了1个可以评价突变利斯特氏菌株体内细胞毒性的例子。下述实施例4提供了突变利斯特氏菌株的治疗效果分析检测的例子。

如上所述，本发明还进一步提供了降低利斯特氏菌株进入非吞噬细胞的能力，同时基本保留了该菌进入吞噬细胞的能力的方法，该方法包括在菌株的编码侵染素的至少一个基因上导入至少1个突变，以降低菌株产生活性侵染素的水平。在一个实施方案中，该侵染素是InlA以外的内化素。

2.含有其它影响进入非吞噬细胞修饰的利斯特氏菌。

在某些实施方案中，利斯特氏菌和对特定的侵染素蛋白质(如内化素B)特异的、或针对表达在该细菌表面的多抗原或重复性分子形式特异的多克隆或单克隆抗体(或它们的片段)反应。相对于未用Ab处理的相同的利斯特氏菌株(“未调理的”利斯特氏菌株)，对选定的侵染素蛋白或多蛋白和/或大分子特异的抗体(Ab)使利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减(“抗体调理的”利斯特氏菌株)。(参见下述实施例10)。相对于未结合抗体的利斯特氏菌株，抗体结合利斯特氏菌株进入非吞噬细胞的能力可被降低至少大约10％、至少大约25％、至少大约50％、至少大约75％或至少大约90％。

在本发明的某些其它实施方案，通过封闭利斯特氏菌表面上的1个或多个关键部分(moieties)，使利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力衰减。例如：用能够结合细胞表面的蛋白质和阻断其结合它在非吞噬细胞表面的受体的无能性(inability)的实体封闭与利斯特氏菌进入吞噬细胞相关的蛋白质。在某些实施方案中，封闭在利斯特氏菌表面的内化素蛋白质。在某些实施方案中，该细胞表面蛋白质是内化素B。在某些实施方案中，用抗体或抗体片段，如Fab片段封闭在利斯特氏菌表面的该关键部分。在某些实施方案中，用抗利斯特氏菌抗体或抗体片段包被利斯特氏菌表面。

在某些实施方案中，利斯特氏菌进入非吞噬细胞的能力受到利斯特氏菌调理的影响。在某些实施方案中，用高滴度的抗利斯特氏菌血清调理减毒的利斯特氏菌。在某些实施方案中，用多克隆抗体调理减毒的利斯特氏菌。在某些实施方案中，用单克隆抗体调理减毒的利斯特氏菌。在某些实施方案中，用于通过调理作用修饰利斯特氏菌的抗体是多克隆抗利斯特氏菌抗体。在某些实施方案中，用于调理利斯特氏菌的抗体是抗内化素抗体，如：内化素B特异的单克隆抗体或多克隆抗体或它们的片段。

可以用领域内公知的方法生产利斯特氏菌特异性抗体，如：用利斯特氏菌静脉注射感染小鼠以产生高滴度的利斯特氏特异的小鼠血清，用抗利斯特氏小鼠血清温育欲被减毒的利斯特氏菌制备调理的利斯特氏菌。本发明人表明这种获得的调理的利斯特氏菌进入非吞噬细胞、而不是吞噬细胞被衰减(参见下述实施例10)。

相应地，在某些实施方案中，减毒的利斯特氏菌是经过调理的。在某些实施实施方案中，该调理的利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散还被衰减。例如：减毒的利斯特氏菌可以是ActA缺陷(如：actA缺失突变体)的调理的利斯特氏菌。

B.利斯特氏菌细胞到细胞的扩散被衰减

在某些实施方案中，用于所述组合物、疫苗和方法的减毒利斯特氏菌不仅进入非吞噬细胞被衰减，细胞到细胞的扩散也被衰减。如果利斯特氏菌不能进行从一个感染细胞(在它的胞质中含有利斯特氏菌的细胞)到邻近细胞中的细胞间扩散，则该利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散被衰减。换言之，相对于相同种属的野生型的利斯特氏菌，减毒利斯特氏菌的生长和扩散能力被减弱了。在某些实施方案中，利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散的衰减被直接影响。例如：在某些实施方案中，因为相对于野生型，利斯特氏菌株从感染细胞形成进入邻近细胞的突出(protrusion)能力被削减，所以该利斯特氏菌细胞到细胞的扩散被衰减。在其它实施方案中，该利斯特氏菌细胞到细胞的扩散的衰减是因为小的直接削弱，但仍衰减了细胞到细胞的扩散。例如：在另外的实施方案中，利斯特氏菌存在于吞噬细胞空泡中的能力被减弱。

在某些实施方案中，相对于野生型利斯特氏菌，减毒利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散能力被降低至少大约10％、至少大约25％、至少大约50％、至少大约75％或至少大约90％。在某些实施方案中，相对于野生型利斯特氏菌，减毒利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散能力被降低至少大约50％、至少大约75％或至少大约90％。在某些实施方案中，相对于野生型利斯特氏菌，减毒利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散能力被降低至少大约50％。

在某些实施方案中，在减毒利斯特氏菌的基因组上含有突变，该突变减弱了该利斯特氏菌细胞到细胞的扩散。例如：在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌属于利斯特氏菌突变株。在本发明的某些实施方案中，该利斯特氏菌突变株的基因组中，在侵染素以外的基因上含有1个或多个突变。例如：在某些实施方案中，该利斯特氏菌突变株的基因组在inlB以外的基因上含有一个或多个突变。例如：该突变菌株可能还缺少一个或多个影响细胞到细胞扩散的毒性因子。在其它实施方案中，通过其它手段衰减了利斯特氏菌的细胞到细胞扩散。

甚至在那些减毒的利斯特氏菌细胞到细胞的扩散被衰减的实施方案中，优选该减毒利斯特氏菌仍然能进入吞噬细胞如树突细胞和/或巨噬细胞。在一个实施方案中，减毒利斯特氏菌株进入吞噬细胞的能力不因为在该利斯特氏菌上所做的修饰所减弱(例如：该菌株在经过修饰后进入吞噬细胞的能力保留了大约95％或更多)。在其它实施方案中，相对于野生型，该减毒利斯特氏菌进入吞噬细胞的能力被减弱不超过大约10％，不超过大约25％、不超过大约50％或不超过大约75％。

本领域技术人员已知确定利斯特氏菌细胞到细胞的扩散是否被衰减的体外方法。例如：可以测定感染选定的培养细胞单层后，一段时间形成的噬菌斑的直径。可以按照以前报导的方法(Sun，A.，A.Camilli，和D.A.Portnoy.1990，Isolation of Listeriamonocytogenes small-plaque mutants defective for intracellulargrowth and cell-to-cell spread.Infect.Immun.58：3770-3778)和该测定方法的修正(Skoble，J.，D.A.Portnoy，和M.D.Welch.2000，Three regions within ActA promote Arp2/3complex-mediatedactin nucleation and Listeria monocytogenes motility.J.Cell.Biol.150：527-538)进行L2细胞单层内的噬菌斑分析。简而言之，在6孔组织培养皿中L2细胞生长至融合，然后用细菌感染1小时。感染后，将细胞铺到加热到40℃的培养基中，该培养基由含有0.8％琼脂糖的DME、胎牛血清(如2％)和要求浓度的庆大霉素组成。培养基中的庆大霉素的浓度对噬菌斑的大小有很大影响，而且是选定的利斯特氏菌株的细胞到细胞的扩散能力的量度(Glomski，IJ.，M.M.Gedde，A.W.Tsang，J.A.Swanson，and D.A.Portnoy.2002.J.CellBiol.156：1029-1038)。例如：当所铺的培养基中含有的庆大霉素的浓度为50μg/ml时，和野生型相比，在单层感染3天后具有细菌到细菌扩散表型缺陷的利斯特氏菌株的噬菌斑的大小被降低至少50％。另外，当将感染的单层铺在仅含有5μg/ml庆大霉素的琼脂糖+培养基中时，具有细胞到细胞扩散缺陷表型的利斯特氏菌株和野生型菌株的噬菌斑大小相似。所以，可以通过改变含琼脂糖培养基中的庆大霉素的浓度来测定相对于野生型菌株，选定菌株在感染的细胞单层中的细胞到细胞扩散的相对能力。任选地，通过在感染后第48小时向铺板中添加含有中性红(GIBCO BRL；1：250稀释到DME+琼脂糖培养基中)的培养基，有利于噬菌斑的可见性和直径测量。另外，可以在来自其它原代细胞或传代细胞的单层细胞进行噬菌斑分析。例如：可以用HepG2细胞，来自肝细胞的细胞系或原代人肝细胞，评价相对于野生型利斯特氏菌株的选定突变对细胞到细胞的扩散能力。在某些实施方案中，含有使利斯特氏菌细胞到细胞的扩散衰减毒的突变或其它修饰的利斯特氏菌在高浓度庆大霉素(大约50μg/ml)下产生“针尖(pinpoint)”噬菌斑。

还可以不太直接(less directly)地通过利斯特氏菌在宿主中的生物学作用测定本发明的减毒利斯特氏菌株的衰减。可以在小鼠或其它脊椎动物上测定其LD₅₀评价减毒利斯特氏菌株的致病性(实施例2、表1)。LD₅₀是将利斯特氏菌注射到脊椎动物中引起50％脊椎动物死亡的数量或剂量。可以比较具有特定突变或修饰的利斯特氏菌和不具有特定突变或修饰的利斯特氏菌的LD₅₀值作为衰减水平的量度。例如：如果没有特定突变的利斯特氏菌株的LD₅₀为10³个细菌，具有特定突变或修饰的利斯特氏菌株的LD₅₀为10⁵个细菌。则该菌株已经被减毒，其LD₅₀增加了100倍或2log。

可以通过其它生物学作用如组织病理学范围或血清肝酶水平对这种减毒程度进行定性测定。在用本发明的利斯特氏菌注射小鼠的临床实验中，检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白和胆红素水平。比较带有或不带有特定突变的利斯特氏菌在小鼠或其它脊椎动物上的这些作用，将其作为评价该利斯特氏菌减毒的手段。还可以用组织病理学测定与本发明相关的利斯特氏菌的减毒。从感染的脊椎动物的多种组织中如肝、脾和神经系统回收的利斯特氏菌的量也可以用于减毒水平的测定，即，通过比较减毒利斯特氏菌和未减毒利斯特氏菌注射的脊椎动物的上述值。例如：从感染组织如肝或脾中回收利斯特氏菌的量作为时间的函数可以用作减毒的量度，通过比较减毒和未减毒利斯特氏菌注射的小鼠中的上述值。

为了提供安全而且有效的疫苗，本发明的疫苗相关的细菌的细胞到细胞的扩散的衰减程度不必是完全衰减。在某些实施方案中，该减毒程度为能降低其毒性足以防止或降低该毒性症状不达到威胁生命的水平。

1.含有影响细胞到细胞扩散的突变的利斯特氏菌

在某些实施方案中，减毒的利斯特氏菌含有一个或多个突变，该突变进一步衰减细胞到细胞的扩散。例如：在某些实施方案中，减毒的利斯特氏菌是突变的利斯特氏菌株，其与细胞到细胞的扩散相关的一种或多种利斯特氏菌蛋白质缺陷，如：选自ActA、硫辛酸蛋白连接酶、PI-PLC、PC-PLC、锌依赖性金属蛋白酶和LLO(或这些蛋白质的等价物，取决于所用利斯特氏菌株的种)的蛋白质。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是在选自actA、lplA、plcA、plcB、mpl和hly(或这些基因的等价物，取决于所用利斯特氏菌株的种)的基因上含有一个或多个突变的突变利斯特氏菌株，其中的在基因上的突变衰减了细胞到细胞的扩散。

在某些实施方案中，该利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减(例如：一个或多个内化素如内化素B缺陷)，同时是一种或多种肌动蛋白聚合蛋白缺陷。所述肌动蛋白聚合蛋白之一是actA基因编码的肌动蛋白聚合酶(Kocks等人，Cell，68：521-531(1992)，Genbank检索号AL591974，nts 9456-11389)。该肌动蛋白聚合酶蛋白质参与在利斯特氏菌的一极宿主的F-actin募集和聚合。肌动蛋白聚合和解聚后造成利斯特氏菌突出穿过胞质进入邻近的细胞。这种运动能让细菌直接从细胞到细胞扩散，而不用进一步暴露到细胞外环境中，能够逃避宿主的防御，如生成抗体。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌任选在内化素基因如inlB上和在actA上同时含有突变。本发明的这个实施方案的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减。术语“actA^-”、“ΔactA”和“actA缺失突变”在此处是可以互换使用的。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌是突变的单细胞增生利斯特氏菌株，其为内化素B和actA所编码的肌动蛋白聚合酶缺陷。在其它实施方案中，突变利斯特氏菌株的基因组是在inlB和actA都包含突变(例如：缺失大部分或全部编码内化素B和ActA序列)的突变的单核细胞增生利斯特氏菌株的基因组。在一个实施方案中，该菌株是在2003年10月3日，保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的检索号是PTA-5562的ΔactAΔinlB双突变单核细胞增生利斯特氏菌。在其它实施方案中，该菌株是指定为PTA-5562的菌株的突变体，其中该突变体相对于野生型的单核细胞增生利斯特氏菌是内化素B和ActA缺陷的。如前所示，此处的术语“actA^-”和“ΔactAΔinlB”可以互换使用，指的是双缺失突变体。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌的基因组是lplA基因编码的硫辛酸蛋白连接酶缺陷的(O’Riordan等人，Science，302：462-4(2003)；Genbank检索号NC_003210)。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是内化素B和硫辛酸蛋白连接酶都缺陷的。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是在lplA基因上含有突变的突变体。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌在inlB和lplA上含有突变。在公开的美国申请2004/0013690中描述了某些具有范例性的lplA突变体，该文引于此作为参考。

在某些实施方案中，进入非吞噬细胞衰减的利斯特氏菌还是一种或多种磷脂酶缺陷的。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是一种或多种内化素(如内化素B)缺陷以及一种或多种磷脂酶也缺陷和/或突变的利斯特氏菌菌株。磷脂酶是一类催化磷酸甘油酯水解的酶。磷脂酶C是释放在其它细菌通路中作为第二信使的二酰甘油的磷酸二脂酶。该酶在利斯特氏菌中的作用是在溶酶体膜上形成孔。在某些实施方案中，在本发明涉及的利斯特氏菌中突变的磷脂酶基因选自plcA、plcB和smcL。在某些实施方案中，该减毒的利斯特氏菌为PC-LPC和/或PI-PLC缺陷。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌在plcA和/或plcB基因(Genbank检索号NC-003210；Angelakopolous H.等人，2002，Infect.Immun.70：3592-3601)上含有一个或多个突变。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌在smcL基因上含有突变。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌在inlB和plcA和/或plcB上含有突变。在本发明的这些实施方案中的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞以及逃避溶酶体进入宿主细胞的胞质而进行细胞到细胞的扩散被痕减。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌的基因组是mpl基因编码的锌依赖性金属蛋白酶(Marquis等人，J.Cell.Biol.137：1381-92(1997)；Genbank检索号NC_003210)缺陷的。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌的内化素B和锌依赖性金属蛋白酶都缺陷。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌是在mpl基因上含有突变的突变体。在某些实施方案中，该减毒利斯特氏菌同时在inlB和mpl上含有减毒突变。

在某些实施方案中，进入非吞噬细胞痕减的利斯特氏菌还是LLO缺陷的。在某些实施方案中，一个或多个侵染素(如内化素B)缺陷的突变利斯特氏菌株还是在介导利斯特氏菌从最初侵入位点逃避和扩散中有效的一种或多种利斯特蛋白缺陷和/或突变的。这种逃避蛋白质包括天然的利斯特氏菌溶胞素O(LLO；Genbank检索号M24199，引入此处作为参考)和LLO的突变形式。在某些实施方案中，减毒的利斯特氏菌的基因组在编码LLO的基因hly上含有突变。LLO是一种能在包含有入侵的利斯特氏菌吞噬溶酶体的膜上形成孔的溶细胞素蛋白质。这些孔能够使利斯特氏菌逃脱吞噬溶酶体的杀伤环境进入宿主细胞的胞质，利斯特氏菌在细胞质中能够生长和扩散到邻近的细胞中。一种利斯特氏菌的LLO蛋白质的可能突变体包含氨基酸替代。这种氨基酸替代可以涉及LLO蛋白质的一个或多个氨基酸，并且能够通过改变最适pH或产生的蛋白质的稳定性而影响LLO的细胞毒性。本发明涉及的利斯特氏菌的另一种突变的LLO蛋白质包括LLO的一个或多个氨基酸缺失。这种氨基酸缺失也可以通过改变产生的LLO蛋白质的稳定性而影响其细胞毒性。本发明所涉及的利斯特氏菌为一种或多种内化素缺陷，而且为LLO蛋白质的缺陷或突变，其进入非吞噬细胞衰减以及从吞噬溶酶体逃脱从而生长和直接从细胞到细胞扩散衰减。在公开的美国申请2004/0013690中介绍了某些范例性的hly突变，引入此处作为参考。

相应地，在某些实施方案中，进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌的基因组的细胞到细胞的扩散被进一步衰减，并且在一个或多个选自actA、hly、lplA、plcA、mpl和plcB的基因上含有至少一个突变。在其它实施方案中，该突变菌株的基因组在actA上含有至少一个突变。例如，被修饰的利斯特氏菌的基因组可能在inlB和选自actA、hly、lplA、plcA、mpl和plcB的基因上含有至少一个突变。另外，减毒利斯特氏菌的基因组在inlB和actA上含有至少一个突变。

可以按照上述II.A部分或下面的实施例介绍的相同方式在利斯特氏菌中引入另外的突变并筛选。多个突变通常可依次引入。例如：从野生型利斯特氏菌开始，可使用等位基因交换缺失actA基因。最后，通过等位基因交换的方法从actA突变体或actA/uvrAB突变体中缺失inlB，生成actA/inlB突变体。

在其它实施方案中，进一步修饰本领域技术人员已知的现存的突变的利斯特氏菌株以导入突变，减弱其进入非吞噬细胞的能力和/或使该菌株的内化素B缺陷。例如：以前报道了许多突变的利斯特氏菌株。在Glomski等人，J.Cell.Biol.156：1029(2002)中介绍了突变菌株LLO L461T(DP-L4017)，引入此处作为参考。在Skoble等人，J.of Cell Biology 150：527-537(2000)中介绍了ΔactA突变体(DP-L4029)为DP-L3078菌株，于此全部引入作为参考，该菌株已经去除了原噬菌体。(在Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177(2002)；美国专利公开号2003/0203472中介绍了原噬菌体去除(prophagecuring))。以前还报道了LLO^-突变体(DP-L4027)(Lauer等人，J.ofBacteriology，184：4177-4186(2002)和LLOΔ26(DP-L4042)(Decatur等人，Science 290：992(2000))。这些菌株中的任何一个均、可包含产生本发明的突变的利斯特氏菌株的初始点。另外，都可以用前面介绍的等位基因交换的方法或本领域技术人员已知的其它方法首先用野生型利斯特氏菌产生多种突变利斯特氏菌株中的任何一个，然后再导入使进入非吞噬细胞衰减的突变(如inlB)。

可以用前面II.A部分的评价影响侵染素的合适的突变的相同类型的分析评价进入非吞噬细胞衰减的(例如：内化素B缺陷菌株)、细胞到细胞的扩散也衰减的特定利斯特氏菌株用于疫苗的适宜性。

应当理解本发明的减毒利斯特氏菌的基因组可以含有使进入非吞噬细胞或细胞到细胞的扩散都不被衰减的另外的突变。

2.含有影响细胞到细胞扩散的其它修饰的利斯特氏菌

在某些实施方案中，已经用其它手段(或除了)上述的突变修饰了进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减的利斯特氏菌。例如：在某些实施方案中，已经修饰了利斯特氏菌的利斯特氏菌核酸使该利斯特氏菌增殖衰减，进而使细胞到细胞的扩散衰减。

在某些实施方案中，该利斯特氏菌增殖衰减是可以剂量依赖的形式控制的。在某些实施方案中，利斯特氏菌的利斯特氏菌基因表达基本上不受该微生物增殖衰减的影响。在某些实施方案中，当向个体给予疫苗时，利斯特氏菌表达了足够水平的抗原诱导个体对该抗原产生免疫应答。

在某些实施方案中，该细菌的核酸已经通过与核酸靶向化合物的反应修饰，减弱该细菌的增殖。在某些实施方案中，利斯特氏菌的核酸已经通过与直接和核酸作用的核酸靶向化合物的反应而修饰。在某些实施方案中，该核酸靶向化合物是核酸烷化剂。例如：在某些实施方案中，核酸烷化剂是β-丙氨酸、N-(吖啶-9-类)，2-[双(2-氯乙烯)氨基]乙酯。在某些实施方案中，核酸靶向化合物被辐射活化。在某些实施方案中，该核酸靶向化合物是UVA照射激活的补骨脂素化合物，而且通过与用UVA照射激活的补骨脂素化合物接触减毒利斯特氏菌的核酸被修饰。例如：在某些实施方案中，核酸靶向化合物是4’-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(此处又称为“S-59”)。在下面的实施例11中提供了利斯特氏菌的S-59/UVA失活的示范性方法。在相关美国申请60/446,051、60/449,153和60/511,869中还介绍了靶向化合物如交联化合物的应用，在此全部引入作为参考。与此相似，也全部引入相关的2004年2月6日提交的题目为“Modified Free-Living Microbes，Vaccine Compositions，andMethods of Use Thereof，”美国专利申请在此作为参考。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌不仅进入非吞噬细胞衰减，它的核酸被修饰，使之增殖减弱(如上所述)，不仅如此，它用于修复利斯特氏核酸修饰的蛋白质缺陷。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌DNA修复酶缺陷。在某些实施方案中，利斯特氏突变菌株内化素B和修复它的核酸的修饰的蛋白质都缺陷。例如：在inlB上含有突变的利斯特氏菌的突变菌株还在任何一个与微生物DNA修复机制有关的多种基因上含有突变(Aravind等人，Nucleic Acids Research 27(5)：1223-1242(1999))。在一个实施方案中，修复缺陷突变体不能制造PhrB(一种光解酶)，该酶能修复嘧啶二聚体。例如：可以在phrB基因或不同利斯特氏菌种的功能等价的基因上存在另外的突变。该突变体可与微生物的紫外照射(例如：UVB、UVC)联用以在微生物的核酸上产生嘧啶二聚体。在其它实施方案中，内化素B突变体还不能修复链间交联。这些突变体包括但不局限于：在一个或全部uvr基因，如uvrA、uvrB、uvrC和uvrD基因以及recA基因或不同微生物种属的功能等价基因的突变。这些突变造成相应的UVrA酶(ATP酶)、UvrB(解旋酶)、UvrC(核酸酶)、UvrI)(解旋酶II)和RecA(重组酶)的活性减弱。这些突变体通常与交联化合物如补骨脂素联用。在一个实施方案中，在uvrA和uvrB(uvrB)上含有减毒性突变。

相应地，在一个实施方案中，进入非吞噬细胞衰减的突变的菌株的基因组还在选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的至少一个基因上含有至少一个突变。例如：突变利斯特氏菌的基因组可以在inlB和选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的基因上含有至少一个突变。另外，减毒利斯特氏菌是在inlB、actA和uvrAB上含有至少一个突变的单核细胞增生利斯特氏菌。

可以以上面II.A部分或下面相同的方式在利斯特氏菌中引入另外的突变并筛选。通常多个突变可以依次引入。例如：从野生型利斯特氏菌开始，用等位基因交换使actA基因缺失。然后，用等位基因交换任选地缺失ΔactA突变体中的uvrA和uvrB基因。(2003年10月3日，单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrB突变株保藏于美国典型培养物保藏中心，检索号为PTA-5563)。最后，用等位基因交换方法从ΔactA突变体或ΔactAΔuvrB(又称为“actA^-/uvrAB^-”)突变体中缺失inlB基因得到ΔactAΔinlBΔuvrB(又称为“actA^-/inlB^-/uvrAB^-”)突变体。

在其它实施方案中，可以进一步修饰本领域已知的现存的利斯特氏菌株突变体以引入能够减弱其进入非吞噬细胞能力的突变和/或使菌株内化素B缺陷。例如：共同未决美国临时申请60/446,051，提交于2003年2月6日，以L4029/uvrAB(参见该申请的实施例7)描述了ΔactAΔuvrB菌株的构建。该菌株可包含产生本发明的突变利斯特氏菌株的起点。另外，可以用上面介绍的等位基因交换方法或其它本领域技术人员已知的其它方法从野生型利斯特氏菌首先生成任何一种突变的利斯特氏菌株，然后向该菌株导入使该细菌进入非吞噬细胞的能力减弱的突变(如：inlB)。

可以用上述II.A部分的评价影响侵染素合适突变的方法同样的方法评价用于疫苗的特定减毒利斯特氏菌株(如内化素B缺陷菌株)(同时细胞到细胞的扩散也衰减的)的适宜性。

在美国临时申请60/446,051、60/449,153和60/511,869(分别引入作为参考)中提供了有关制备和评价含有使利斯特氏菌修复其已被修饰的核酸的能力减弱的基因突变的减毒利斯特氏菌的其它信息。与此相似，2004年2月6日提交的名为“Modified Free LivingMicrobes，Vaccine Compositions，and Methods of Use Thereof，”的相关的美国专利申请也引于此作为参考。

C.抗原和异种蛋白质表达

在本发明的某些实施方案中，减毒利斯特氏菌(例如：突变的利斯特氏菌)含有编码抗原的核酸分子。在某些实施方案中，该抗原是利斯特氏菌抗原。或该抗原是非利斯特氏菌抗原。在本发明的某些但不是全部实施方案中，该编码抗原的核酸相对突变利斯特氏菌是异源的。该编码抗原的核酸分子可被整合到突变利斯特氏菌的基因组中。或该编码该抗原的核酸分子可以在利斯特氏菌内的质粒中等。

突变利斯特氏菌株中的异源核酸所表达的抗原可以相对于给予突变利斯特氏菌株的宿主动物为自体的或异源的，其中的菌株是疫苗或其它组合物中的一部分。

本领域技术人员已知制备含有能表达抗原的异源核酸的利斯特氏菌的常用方法。可以用本领域技术人员已知的重组DNA方法(参见如：Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000))改变该利斯特氏菌。抗原或它的片段和/或变体的编码序列操作性连接到适当的控制序列上以实现该抗原序列在利斯特氏菌中的表达。本领域技术人员已知合适的启动子序列。例如：hly启动子适合用于该表达构建体。在某些实施方案中，该表达构建体含有抗原编码序列，还含有操作性连入的信号肽序列。在某些实施方案中，该抗原序列直接或间接融合到编码至少一部分利斯特氏菌蛋白质如LLO的序列上。在Laue r等人，J.Bacteriol.184：41777-4186(2002)中和美国专利公开号2003/0203472A1中介绍了适于在利斯特氏菌中表达抗原的整合性载体的详细例子包括pPL2和pPL1，全部引入此处作为参考。

该异源核酸序列可以编码至少一种特异性蛋白质抗原或其它蛋白质，例如：提供缓解性治疗疾病的蛋白质。可改变利斯特氏菌以含有一个或多个编码一种或多种抗原或其它目的蛋白质的序列。编码特异性抗原的异源核酸序列不限于确定的核酸序列，但是当给予到个体时，该序列足以提供能够引发目的免疫应答的抗原表达。编码其它蛋白质的异源序列与之相似，编码给定蛋白质的序列可以变化，只要能表达目的蛋白质以在给予个体后，提供期望的效果(如缓解效果)。该异源序列可以表达为和特定疾病有关的抗原。表达这种抗原的利斯特氏菌可以用做疫苗，其中该疫苗可以用做预防性治疗或治疗性治疗。能用这种疫苗治疗的疾病包括但不局限于：感染性疾病、自体免疫性疾病、过敏、癌症以及其它过度增生性疾病。

本发明涉及的利斯特氏菌可以被改变以含有编码肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原的抗原的异源核酸序列。已经鉴定了大量能被T细胞识别的肿瘤相关抗原(Renkvist等人，Cancer，Immunol Innumother50：3-15(2001))。这些肿瘤相关抗原可以是分化抗原(如：PSMA、酪氨酸酶、gp100)、组织特异性抗原(如：PAP、PSA)、发育抗原、肿瘤相关的病毒性抗原(如：HPV 16 E7)、癌-睾抗原(如：MAGE、BAGE、NY-ESO-1)、胚抗原(如CEA、甲种胎儿球蛋白)、癌蛋白抗原(如：Ras、p53)、过度表达蛋白质抗原(如：ErbB2(Her2/Neu)、MUC1)或突变蛋白质抗原。可被异源核酸序列编码的肿瘤相关抗原包括但是不局限于：707-AP、Annexin II、AFP、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、BCL-2、bc r-abl、bcr-ablp190、bcr-abl p210、BRCA-1、BRCA-2、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK-4/m、CEA(Huang等人，Exper.Rev.Vaccines(2002)1：49-63)、CT9、CT10、Cyp-B、Dek-cain、DAM-6(MAGE-B2)、DAM-10(MAGE-B1)、EphA2(Zantek等人，Cell Growth Differ.(1999)10：629-38；Carles-Kinch等人，CancerRes.(2002)62：2840-7)、ELF2M、ETV6-AMLl、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GnT-V、gp100、HAGE、HER2/neu、HLA-A^*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、细胞凋亡抑制剂(如：survivin)、KIAA0205、K-ras、LAGE、LAGE-1、LDLR/FUT、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D、MART-1、MART-1/Melan-A、MC1R、MDM-2、间皮素(mesothelin)、肌球蛋白/m、MUC1、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-polyA聚合酶、NA88-A、NY-ESO-1、NY-ESO-1a(CAG-3)、PAGE-4、PAP、蛋白酶3(Molldrem等人，Blood(1996)88：2450-7；Molldrem等人，Blood(1997)90：2529-34)、P15、p190、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RCAS1、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SP17、SPAS-1、TEL/AML1、TPI/m、酪氨酸酶、TARP、TRP-1(gp75)、TRP-2、TRP-2/INT2、WT-1和或是翻译的NY-ESO-ORF2或CAMEL蛋白质、或源自NY-ESO-1和LAGE-1基因。本发明的减毒利斯特氏菌可含有能够引发肿瘤特异性免疫应答的任何肿瘤相关抗原，这些抗原包括将被鉴定的抗原。利斯特氏菌可被改变以含有一个以上的编码一种以上肿瘤相关抗原的异源序列。在一个实施方案中，该抗原是间皮素(mesothelin)(Argani等人，Clin Cancer Res.7(12)：3862-8(2001))、Sp17(Lim等人，Blood 97(5)：1508-10(2001))、gp100(Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci美国91：6458(1994))、PAGE-4(Brinkmann等人，Cancer Res.59(7)：1445-8(1999))、TARP(Wolfgang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国97(17)：9437-42(2000))或SPAS-1(美国专利申请公开号2002/0150588)。

在某些实施方案中，异源核酸编码的抗原与肿瘤相关抗原不相同，但是源自肿瘤相关抗原。例如：突变利斯特氏菌表达的抗原可包括肿瘤相关抗原片段、肿瘤相关抗原变体或肿瘤相关抗原变体的片段。某些情况下，疫苗中的的抗原如：肿瘤抗原，当序列和宿主的内源序列不同时，该抗原能诱导比较显著的免疫应答。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原的变体或肿瘤相关抗原变体的片段和肿瘤相关抗原或它们相应的片段存在一个或多个氨基酸不同。源自肿瘤相关抗原的抗原将含有在向宿主给予该突变利斯特氏菌时，能够诱导希望的免疫应答的至少一个表位序列。

相应地，在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码抗原如：间皮素(mesothelin)、SPAS-1、蛋白酶-3、EphA2、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、Her-2/neu、WT-1、NY-ESO-1、PSMA、K-ras或CEA、或源自这些蛋白质之一的抗原的核酸分子。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码抗原如间皮素(mesothelin)、SPAS-1、蛋白酶-3、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、Her-2/neu、WT-1、NY-ESO-1、PSMA、K-ras或CEA或源自这些蛋白质之一的抗原的核酸分子。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码抗原如间皮素(mesothelln)、SPAS-1、蛋白酶-3、EphA2、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、WT-1、NY-ESO-1或CEA或源自这些蛋白质之一的抗原的核酸分子。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码抗原如间皮素、SPAS-1、蛋白酶-3、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、WT-1、NY-BSO-1或CEA或源自这些蛋白质之一的抗原的核酸分子。在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码人间皮素或源自人间皮素抗原的核酸分子。在其他实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码人EphA2或源自人EphA2的核酸分子。在其他实施方案中，减毒利斯特氏菌含有编码人NY-ESO-1或源自人NY-ESO-1抗原的核酸分子。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌表达的异种抗原是蛋白酶-3或源自蛋白酶-3的抗原。例如，在一个实施方案中，抗原含有HLA-A2.1-限制性肽PR1(aa169-177；VLQELNVTV(AEQ ID NO：1))。可以从下述参考文献得到蛋白酶3和/或PR1表位的信息：美国专利5,180,819，Molldrem等人，Blood，90：2529-2534(1997)、Molldrem等人，Cancer Research，59：2675-2681(1999)、Molldrem等人，Nature Medicine，6：1018-1023(2000)和Molldrem等人，Oncogene，21；8668-8673(2002)。

或者，本发明的减毒利斯特氏菌可被改变以含有编码自体免疫疾病特异性抗原的异源核酸序列。在T细胞介导的自体免疫疾病中，T细胞对自身抗原的应答造成自体免疫疾病。用于用本发明的疫苗治疗自体免疫疾病的抗原中的抗原的类型是可以靶向造成自体免疫疾病的特异性T细胞。例如：该抗原可以部分T细胞受体，特异型地针对引起自体免疫应答的T细胞的独特型，其中加到本发明的疫苗中的抗原将引发针对这些引起自体免疫应答的T细胞特异性的免疫应答。消除这些T细胞可作为治疗机制缓解自体免疫疾病。另外可以加入能引起针对在自体免疫疾病中针对自身抗原产生的抗体或针对分泌该抗体的特异性B细胞克隆的免疫应答的抗原。例如：可在利斯特氏菌中引入独特型抗原，其能够引起针对在自体免疫疾病中这些B细胞和/或与自体抗原反应的抗体抗独特型的免疫应答。

在本发明的其他实施方案中，抗原源自人或动物病原体。病原体任选是病毒、细菌、真菌或原生动物、在一个实施方案中，抗原是病原体产生的蛋白质或病原体产生的蛋白质的片段和/或变体。

例如：抗原可以源自人类免疫缺陷病毒(如gp120、gp160、gp41、gag抗原，如p24gag和p55gag以及源自pol、env、tat、Vif、reV、nef、vpr、vpu和HIV的LTR区域的蛋白质)、猫科动物免疫缺陷病毒或人或动物的疱疹病毒。在一个实施方案中，抗原源自1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)(如gD、gB、gH、急早期蛋白质，如ICP27)、来自巨细胞病毒(如gB和gH)、源自Epstein-Barr病毒或来自水痘-带状疱疹病毒(如gpI、II或III)(参见如Chee等人(1990)巨细胞病毒(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等人，(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574；美国专利5,171,568；Baer等人，(1984)Nature 310：207-211和Davison等人，(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816)。

在某些实施方案中，抗原源自肝炎病毒如乙肝病毒(例如：乙肝表面抗原)、甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒或已肝病毒。参见WO 89/04669、WO 90/11089和WO 90/14436。肝炎抗原可以是表面、核心或其他相关抗原。HCV基因组编码多个病毒蛋白质，包括E1和E2。参见，Houghton等人，Hepatology 14：381-388(1991)。

抗原为病毒性抗原时任选来自下列任一种病毒：小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如：脊髓灰质炎病毒，鼻病毒等)、杯状病毒科、披膜病毒科(例如风疹病毒、革登病毒等)、黄病毒科、冠状病毒科、呼肠孤病毒科(如轮状病毒等)、双RNA病毒科、棒状病毒科(例如狂犬病病毒等)、正粘病毒科(如：A、B和C型流感病毒等)、丝状病毒科、副粘病毒科(例如：腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科、逆转录病毒科(例如：HTLV-I、HTLV-11、HIV-1、HIVI11b、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV))、乳头瘤病毒、壁虱脑炎病毒等。关于这些或其它病毒的介绍参见例如Virology，3rd Edition(W.K.Joklik ed.1988)、Fundamental Virology，3rd Edition(B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley，Eds.1996)。在一个实施方案中，抗原是Flu-HA(Morgan等人，J.Immunol.160：643(1998))。

在某些其它实施方案中，抗原来自细菌性病原体。如：分枝杆菌属、芽孢杆菌属、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟菌氏属、疏螺旋菌属(例如：Os pA或Os pB或它们的衍生物)、衣原体或博德特氏杆菌属(例如：P.69、PT和FHA)、或来自寄生虫如：疟原虫属或弓形虫属。在一个实施方案中，抗原来自结核分枝杆菌(如：ESAT-6、85A、85B、72F)、炭疽杆菌(如PA)、鼠疫杆菌(如，F1，V)。另外，适于应用于本发明的抗原可以得自或来自已知的导致疾病的病原体，所述疾病包括但是不局限于：Diptheria、百日咳、破伤风、结核、细菌性的或真菌性肺炎、中耳炎、淋病、霍乱、伤寒、脑膜炎、单核细胞增多症、鼠疫、细菌性痢疾或沙门氏菌病、军团杆菌病、莱姆病、麻风病、疟疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、Trypamasomialsis、Lesmaniasis、贾第虫病(Giardia)、阿米巴病、丝虫病、Borelia和旋毛虫病。进一步抗原可以得自或来自非传统性的病原体。如：库鲁病、克-雅病(CJD)、搔痒病、传染性水貂脑病和慢性消耗性病的病原体或来自类蛋白质性感染粒子，如和疯牛病有关的朊病毒。

在其它实施方案中，抗原得自或来自与神经退化性疾病(如阿尔茨海默氏病)、代谢性疾病(如I型糖尿病)和药物成瘾症(如尼古丁成瘾)的发作或恶化有关的生物物质。或含有表达抗原的突变的利斯特氏菌株的组合物用于疼痛治疗，而且该抗原氏疼痛受体或其它与疼痛信号转导有关的物质。

在某些实施方案中，该抗原序列可是密码子优化的以与表达抗原的利斯特氏菌宿主偏爱的密码子匹配。另外，编码融合到抗原性肽的信号肽的序列可是密码子优化的以与利斯特氏菌宿主密码子偏爱匹配。关于抗原密码子优化和利斯特氏菌中的信号肽的信息可以参见美国临时申请60/532,598，提交于2003年12月24日。引入此处作为参考。

D.减毒利斯特氏菌的免疫原性

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌(例如：突变的利斯特氏菌株)能在宿主动物中诱导免疫应答。在一个实施方案中，该免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，由减毒利斯特氏菌诱导的有效的免疫应答含有T细胞应答，如：CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答或这两种应答。

可以通过体外和体内方法测定这些细胞免疫应答，由此判断本发明的利斯特氏菌的免疫应答是否有效。可以通过比较减毒利斯特氏菌的这些测量值和未减毒利斯特氏菌的这些值确定对任何特定抗原或异源蛋白质的效果。可以测定通过已经和利斯特氏菌群混合的抗原呈递细胞对目的蛋白质或抗原的呈递。利斯特氏菌可以和适当的抗原呈递细胞或细胞系混合，例如：树突细胞，并且可以测定树突细胞向可以识别该蛋白质或抗原的T细胞的抗原呈递。如果利斯特氏菌表达了足够的该蛋白质或抗原，它将被树突细胞加工成肽片段并且以I型或MHCII类的形式呈递给T细胞。为了检测呈递的蛋白质或抗原，可以使用对该特定蛋白质或抗原有反应的T细胞克隆或T细胞系。该T细胞可以是T细胞杂交瘤，其中的T细胞通过和癌症细胞系融合被永生化。这种T细胞杂交瘤、T细胞克隆或T细胞系可包括CD8+或CD4+T细胞。树突细胞可以呈递给CD8+或CD4+T细胞，该呈递取决于抗原的加工途径。CD8+T细胞识别MHC I类抗原，同时CD4+识别MHC II类抗原。T细胞通过它的受体特异性地识别呈递的抗原而被刺激，结果产生特定的蛋白质，如：IL-2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或干扰素γ(IFN-γ)，可以定量测定这些物质(例如：用ELISA分析、ELISPOT分析或细胞内细胞因子染色(ICS))。关于详细的免疫原性测定分析的例子可参见下面的实施例5-7。

另外，可设计杂交瘤含有报告基因，如：β-半乳糖苷酶，其通过呈递抗原对T细胞杂交瘤的刺激而活化。可以通过其对底物如氯苯酚红-B-半乳糖苷(造成颜色改变)的活性方便测定β-半乳糖苷酶的产生的增加。该颜色改变可以直接加以测定作为特异性抗原呈递的指示。

其它测定本发明的利斯特氏菌疫苗的抗原表达的体外和体内方法为本领域技术所知。还可用利斯特氏菌直接测定特定异种抗原的表达。例如：可向细胞群中加入放射性标记的氨基酸，可以测定掺入特定蛋白质的放射性的量。可分离细胞群合成的该种蛋白质，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳，可定量测量放射性的量进而评价特定蛋白质的表达水平。或者，该蛋白质可无放射性表达而是采用多种方法使之可见，如：用酶联抗体或荧光标记抗体的ELISA分析或通过凝胶电泳和Western印迹检测。

另外，在某些实施方案中，表达异种抗原或自体抗原的减毒利斯特氏菌(如突变的利斯特氏菌株)诱导针对表达或带有这种抗原的细胞的体内细胞毒性(参见下述实施例3)。在某些实施方案中，表达异种或自体抗原的减毒利斯特氏菌具有治疗效果(参见下述实施例4)。

虽然有这种可能，和未减毒的利斯特氏菌相比，对利斯特氏菌的修饰可降低蛋白质表达水平，但应当理解在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌在免疫原性组合物或疫苗中仍然有效。在本发明的某些实施方案中，减弱对非吞噬细胞的侵入和充足的蛋白表达二者相结合是很重要的。疫苗的效力通常和可被微生物递送的抗原的剂量有关。利斯特氏菌对非吞噬细胞侵入的减弱程度可以达到几个log，而利斯特氏菌基因表达仍充分保持。如果用相同剂量的减毒利斯特氏菌和无减毒修饰的利斯特氏菌比较，在减毒利斯特氏菌群中获得的抗原表达(用上述讨论的方法评价)是无减毒修饰的利斯特氏菌的抗原表达的至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或至少90％。因为对非吞噬细胞的侵入可减弱几个log，所以减毒利斯特氏菌的剂量可安全地增加几个log，当接种时，相对于无减毒修饰的利斯特氏菌，减毒利斯特氏菌可产生更大量的抗原。

III.含有减毒利斯特氏菌的疫苗和其他组合物

除了此处描述的减毒利斯特氏菌之外，本发明提供了多种含有该减毒利斯特氏菌的组合物，包括免疫原性组合物、药物组合物、细胞和疫苗(在上述II.A-C部分和下述实施例中范例性地介绍了在本发明组合物中有用的减毒利斯特氏菌)。

例如：本发明提供药物组合物，其含有(a)减毒利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子，和(b)药剂上允许的赋形剂。本发明还提供了药物组合物，其含有(a)减毒利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散被衰减，和(b)药剂上允许的载体。

本发明还提供了含有突变利斯特氏菌株和药剂上允许的载体的药物组合物，其中的突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株，进入非吞噬细胞被衰减，但该菌保留了进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，突变利斯特氏菌株内化素B缺陷。在另一实施方案中，突变菌株的基因组在至少一个编码侵染素如内化素B这种内化素的基因上含有至少一个突变。在另一实施方案中，从菌株的基因组中缺失了inlB的编码序列(或基因)。在另外的实施方案中，inlB和actA的编码序列(或基因)都被缺失。本领域技术人员已知多种药剂允许的适用于细菌菌株的载体。

本发明还提供了降低药物组合物毒性的方法，该方法包括向宿主给予利斯特氏菌第一菌株，包括用突变的利斯特氏菌株替代该第一菌株，其中的突变利斯特氏菌株相对于第一利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，突变利斯特氏菌株内化素B缺陷。在其他实施方案中，该突变菌株内化素B和ActA缺陷。

本发明还提供了含有此处所描述的减毒利斯特氏菌的免疫原性组合物。例如：本发明提供含有减毒利斯特氏菌的免疫原性组合物，该菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本发明还提供了含有减毒利斯特氏菌的免疫原性组合物，该菌是进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散被衰减。

另外，本发明提供了含有突变利斯特氏菌株的免疫原性组合物，其中的突变利斯特氏菌株相对于非突变利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，而且含有编码抗原的异源核酸分子。在某些实施方案中，该菌株内化素B缺陷，而且含有编码抗原的异源核酸分子。在其他实施方案中，该突变菌株的内化素B和ActA都缺陷。

本发明还提供了多种含有此处描述的减毒利斯特氏菌的疫苗组合物。例如：本发明提供了疫苗，其含有(a)减毒的利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞被衰减，而且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子和(b)药剂上允许的载体和/或佐剂。本发明进一步提供了疫苗，其含有(a)减毒的利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散被衰减，和(b)药剂上允许的载体和/或佐剂。本发明进一步提供了疫苗，其含有(a)减毒的利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞被衰减，和(b)药剂上允许的载体或佐剂。在某些实施方案中，此处描述的疫苗含有一种类型以上的减毒利斯特氏菌。例如：在某些实施方案中，疫苗含有多种不同类型的减毒利斯特氏菌。不同类型的减毒利斯特氏菌在其表达的抗原和/或它们的修饰和突变特征上彼此不同。

本发明进一步提供了含有突变利斯特氏菌株的疫苗，其中的突变菌株相对于未突变利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，该菌株为内化素B缺陷。在其他实施方案中，在疫苗中的突变菌株内化素B和ActA都缺陷。在某些实施方案中，疫苗含有1种以上的突变利斯特氏菌株，每个进入非吞噬细胞都被衰减。

用于此处的术语“疫苗”包括预防性疫苗，如：用于为了使个体在接触抗原时产生更强的免疫应答，预先接触含有该抗原的物质诱导免疫应答，以此增加对该物质或载有该物质的细胞的抵抗能力的疫苗。术语“疫苗”还包括治疗性疫苗，如：给予已患有与疫苗抗原相关的疾病的个体的疫苗，其中的疫苗能激发个体对抗原的免疫应答，以此增加抵抗该疾病或载体该抗原的细胞的能力。

本领域已知这种疫苗组合物的给予方法，包括：体外、口、静脉内、皮内、腹膜内、肌肉内、淋巴内、鼻内和皮下途径给药。疫苗组合物还可以进一步含有领域公知的如佐剂或共刺激分子这种添加成分，以此促进对疫苗的免疫应答。例如：共刺激分子含有一种或多种选自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-14、IL-15、B7.1、B7.2和B7-DC的因子，而且任选包含在本发明的疫苗组合物中。本领域技术人员已知其它刺激分子。

疫苗制剂为领域内公知并可以包括多种添加剂，如：防腐剂、稳定剂、佐剂、抗生素和其他物质。添加稳定剂如：乳糖、或谷氨酸-钠(MSG)使疫苗制剂在多种条件下保持稳定。如：温度变化或冻干过程。疫苗制剂还可包括如无菌水或盐水的悬液。在某些实施方案中，疫苗是含有一种或多种药剂允许的适用于非肠道或口服给药的赋形剂的冷冻或冻干制剂。在其他实施方案中，疫苗是含有一种或多种药剂允许的适用粘膜给药或以气溶胶给药的赋形剂的冷冻的或冻干制剂。

可用体内模型评价疫苗的效力，如在小鼠模型上。可以对疫苗提供针对特定疾病的或预防性或治疗性能力进行评价。例如：对于感染性疾病，用所需量的本发明的适宜的疫苗接种一群小鼠，该细菌表达感染性疾病相关抗原。该抗原可来自利斯特氏菌本身或是异种抗原。然后用和疫苗抗原相关的感染性物质感染小鼠，评价其对感染的抵抗能力。可以相对于对照组(或未进行疫苗接种，或仅用载体接种或不表达该适当的抗原的利斯特氏菌的接种)观察该感染性疾病的进展。

当是癌症疫苗时，可以用肿瘤细胞模型，其中在用本发明的含有目的肿瘤相关抗原或衍生自肿瘤相关抗原的利斯特氏菌接种之前(治疗性模型)或之后(预防性模型)，将表达目的肿瘤抗原的肿瘤细胞系注射到一群小鼠中。用含有肿瘤抗原的利斯特氏菌的接种和没有接种的、或用载体接种的、或用不表达目的抗原的利斯特氏菌接种的对照群相比较。在这种模型上通过肿瘤注射后肿瘤体积作为时间的函数或通过肿瘤注射后生存数量作为时间的函数对疫苗的效力进行评价。通常，相对于阴性对照(如未接种的样品)，疫苗会在多数或全部时间点导致肿瘤体积的减小，而且还会导致中值生存期延长。

在本发明的某些实施方案中，用突变利斯特氏菌接种的这些小鼠的肿瘤体积小于或等于对照小鼠的肿瘤体积。在一个实施方案中，用突变利斯特氏菌接种的小鼠的肿瘤体积至少几乎相同于对照组小鼠的肿瘤体积。在另外的实施方案中，用突变利斯特氏菌接种的小鼠的肿瘤体积比对照小鼠的肿瘤体积小至少大约10％、至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％或至少大约50％。在其他实施方案中，在肿瘤植入小鼠后的至少7、14、30或至少60天后观察到肿瘤体积的差异。在一个实施方案中，用突变利斯特氏菌接种的小鼠的中值生存时间和用对照利斯特氏菌接种的小鼠几乎相同。在其他实施方案中，用减毒利斯特氏菌接种的小鼠的中值生存时间比用对照利斯特氏菌接种的小鼠长至少大约1天、至少大约3天或至少大约5天。在其他实施方案中，用减毒利斯特氏菌接种的小鼠的中值生存时间比用对照利斯特氏菌接种的小鼠长至少大约10天、至少大约20天、至少大约30天。在本发明的一个实施方案中，用突变的利斯特氏菌的接种所用的利斯特氏菌的剂量和对照利斯特氏菌的剂量几乎相同。在其他实施方案中，突变利斯特氏菌的接种以比对照利斯特氏菌的接种剂量高至少大约2、大于5、大约10、大约10²、大约10³或至少大约10⁴倍的水平安全进行。

除了测量疫苗的效力之外，还测定了安全性和毒性。这种测定安全性的方法包括测定突变利斯特氏菌进入吞噬细胞的数量，和未突变的利斯特氏菌比较。在某些实施方案中，突变利斯特氏菌内化素B缺陷。在另外的实施方案中，该突变利斯特氏菌内化素B和ActA都缺陷。

一方面，本发明提供了使用于疫苗中的利斯特氏菌株的致病性降低的方法，包括修饰菌株使之进入非吞噬细胞的能力降低，但基本保留该菌株进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，本发明提供了使用于疫苗中的利斯特氏菌株的致病性降低的方法，包括修饰该菌株使之内化素B缺陷。在某些实施方案中，该菌株进一步被修饰成ActA缺陷。

另一方面，本发明提供了制造疫苗的方法。例如：本发明提供了制造疫苗的方法，包括在适当的条件下用专门的抗原呈递细胞和减毒的利斯特氏菌(如突变的利斯特氏菌株)接触，经过足够的时间，使专门的抗原呈递细胞荷载，其中的利斯特氏菌相对于未修饰的利斯特氏菌如野生型进入非吞噬细胞被衰减(如带有内化素B缺陷)，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且含有编码抗原的异源核酸分子。在另一方面，本发明提供了含有利斯特氏菌的专门的抗原呈递细胞其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减。本发明还提供了含有突变的利斯特氏菌株的专门的抗原呈递细胞，其中突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。在某些实施方案中，突变的利斯特氏菌和专门的抗原呈递细胞在体内或离体接触。在某些实施方案中，专门的抗原呈递细胞是树突细胞。在其他实施方案中，专门的抗原呈递细胞是巨噬细胞。关于某些范例性抗原的介绍可以参见上述II.C部分。

IV.诱导免疫应答的方法和治疗方法

本发明还提供诱导免疫应答和治疗和/或预防疾病的方法，该方法包括应用所述的减毒利斯特氏菌、细胞、组合物和疫苗(在上述II.A-D部分和下面的实施例中介绍了用于本发明的方法的范例性的减毒利斯特氏菌；在上述III部分介绍了范例性的组合物、疫苗和细胞)。

例如：本发明提供了诱导宿主对非利斯特氏菌抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有进入非吞噬细胞被衰减的、并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子的利斯特氏菌的组合物。本发明还提供了诱导宿主对抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减的利斯特氏菌的组合物，其中的突变的利斯特氏菌株含有编码抗原的核酸。本发明进一步提供了诱导宿主对抗原产生免疫应答的方法，包括向宿主给予有效量的含有(a)进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌和(b)药剂上允许的载体和/或佐剂的疫苗。

本发明还提供了诱导宿主对抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有突变利斯特氏菌株的组合物，其中的突变利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株，进入非吞噬细胞被衰减，不过保留了进入吞噬细胞的能力，而且含有编码该抗原的核酸。该免疫应答可以是细胞介导的应答。在一个实施方案中，该免疫应答是CD8+T细胞应答。在其他实施方案中，该免疫应答是CD4+T细胞应答。在其他的实施方案中，在宿主细胞中诱导的免疫应答同时包括CD8+和CD4+T细胞应答。对于某些范例性抗原的介绍参见上述II.C部分。在一个实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或衍生自肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，该突变菌株内化素B缺陷。在一个实施方案中，该突变菌株内化素B和ActA都缺陷。

另一方面，本发明提供了诱导专门抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递(在体外、在体内或离体)的方法，该方法包括用专门的抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触，其中的突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，不过保留了进入吞噬细胞的能力，而且含有编码包含MHC I类表位的抗原的异源核酸分子。在某些实施方案中，该突变菌株内化素B缺陷。在其他实施方案中，该突变菌株内化素B和ActA都缺陷。

另外，本发明提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHCII类抗原呈递(或在体内或在体外)的方法，该方法包括用抗原呈递细胞和利斯特氏菌接触，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码包含MHC I类表位或MHC II类表位的非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本发明进一步提供了诱导专门的抗原呈递细胞上MHC II类抗原呈递(在体外、在体内或离体)的方法，该方法包括用专门的抗原呈递细胞和突变的利斯特氏菌株接触，其中的突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力，并且含有编码包括MHC II类表位的抗原的异源核酸分子。在某些实施方案中，该突变的利斯特氏菌株内化素B缺陷。在其他实施方案中，该突变菌株内化素B和ActA都缺陷。

本发明还提供了诱导宿主对抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的专门的抗原呈递细胞，其中的减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码该抗原的核酸。

本发明进一步提供了诱导宿主产生对抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)在适当的条件下，用来自宿主的抗原呈递细胞接触减毒的利斯特氏菌，经过足够的时间使抗原呈递细胞荷载，其中的减毒利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，而且含有编码该抗原的核酸分子，和(b)向宿主给予该抗原呈递细胞。本发明还提供了诱导宿主产生对抗原的免疫应答的方法，该方法包括下述步骤：(a)在适当的条件下，用来自宿主的抗原呈递细胞接触突变的利斯特氏菌株，经过足够的时间使抗原呈递细胞载荷，其中的突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留进入吞噬细胞的能力，而且含有编码抗原的核酸分子，和(b)向宿主给予该抗原呈递细胞。在一个实施方案中，该抗原是肿瘤相关抗原或是衍生自肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，该突变菌株内化素B缺陷。在其他实施方案中，该突变菌株内化素B和ActA都缺陷。

在另一方面，本发明提供了选择性地递送异种蛋白质进入宿主吞噬细胞的方法，该方法包括向宿主给予含有突变利斯特氏菌株的组合物，其中该菌相对于未突变利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，但基本保留了进入吞噬细胞的能力，其中的突变的利斯特氏菌株的基因组在至少一种编码侵染素如内化素的基因上含有至少一个突变。

本发明进一步提供了用所述的减毒利斯特氏菌预防或治疗宿主疾病(如癌症、感染性疾病或利斯特氏菌病)的方法。例如，本发明提供了预防或治疗宿主疾病的方法，包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物，该细菌进入非吞噬细胞被衰减，而且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。本发明还提供了预防或治疗宿主疾病的方法，包括向宿主给予有效量的含有减毒利斯特氏菌的组合物，该细菌进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减。本发明进一步提供了预防或治疗宿主疾病的方法，包括向宿主给予有效量的含有(a)减毒利斯特氏菌，该菌进入非吞噬细胞被衰减，和(b)药剂上允许的载体和/或佐剂的疫苗。

一方面，本发明提供了预防或治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主给予含有突变利斯特氏菌株的疫苗，其中的突变的利斯特氏菌株相对于未突变的利斯特氏菌株进入非吞噬细胞被衰减，但保留了进入吞噬细胞的能力。通过诱导针对和疾病有关的抗原的有治疗作用的免疫应答实现疾病的预防或治疗。在某些实施方案中，突变菌株内化素B缺陷。在其他实施方案中，突变菌株内化素B和ActA都缺陷。在一个实施方案中，该疾病是癌症。在其他实施方案中，该疾病是自体免疫性疾病。在另外的实施方案中，该疾病是感染性疾病或由病原体如病毒、细菌、真菌或原生动物所引起的其他疾病。

本发明还提供了预防或治疗宿主疾病的方法，包括向宿主给予有效量的专门抗原呈递的细胞，该细胞含有减毒的利斯特氏菌，其中的减毒的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减。

本发明进一步提供了含有利斯特氏菌的医用组合物，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，而且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。在其他实施方案中，本发明提供了医用利斯特氏菌，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。

本发明还提供了含有利斯特氏菌的医用组合物，其中的细菌进入非吞噬细胞被衰减。本发明还提供了医用利斯特氏菌，其中的细菌进入非吞噬细胞被衰减。

另外，本发明还提供了用于医药的利斯特氏菌的组合物，其中的细菌进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减。本发明还提供了用于医药的利斯特氏菌，其中的细菌进入非吞噬细胞和细胞到细胞的扩散都被衰减。

另外，本发明还提供了利斯特氏菌在制造用于治疗与利斯特氏菌无关和/或不是利斯特氏菌引起的疾病的药物中的应用，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且其中含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子。例如，在某些实施方案中，该疾病是癌症，而且该抗原是肿瘤抗原或是衍生自肿瘤抗原的抗原。

本发明还提供了利斯特氏菌在制造用于治疗与利斯特氏菌无关和/或不是利斯特氏菌引起的疾病的药物中的应用，其中的细菌进入非吞噬细胞被衰减。在某些实施方案中，该利斯特氏菌细胞到细胞的扩散还被衰减。在某些实施方案中，该疾病是癌症，而且该抗原是肿瘤抗原或是衍生自肿瘤抗原的抗原。

在某些实施方案中，减毒利斯特氏菌在癌症的预防或治疗中的应用包括向个体的免疫系统的细胞递送减毒的利斯特氏菌，以此预防或治疗癌症，或向具有增加的风险因子的个体递送减毒的利斯特氏菌，如环境接触和/或家族性质。在某些实施方案中，用疫苗治疗的个体曾经切除过肿瘤和/或曾经患过癌症。

减毒利斯特氏菌或含有减毒利斯特氏菌的组合物的递送可以采用任何适当的方法，包括但不局限于：皮内、皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、淋巴内、经口或鼻内。在某些实施方案中，肠胃外递送减毒的利斯特氏菌。在某些实施方案中，用粘膜递送。

在某些实施方案中，结合免疫刺激性制剂，向宿主给予含有减毒利斯特氏菌的组合物。可以同时、相继或分别给予减毒利斯特氏菌和免疫刺激性制剂。免疫刺激性制剂的例子包括但是不局限于：IL-2、IL-12、GMCSF、IL-15、B7.1、B7.2、B7-DC和IL-14。在某些实施方案中，免疫刺激性制剂是抗体或靶向T细胞调节分子的小分子。例如：在某些实施方案中，免疫刺激性制剂是CTLA-4或BTLA-4。在某些实施方案中，免疫刺激性制剂是能靶向调节T细胞的制剂。例如：用于缀合减毒利斯特氏菌的免疫刺激性制剂可以是抗CD25抗体、抗LAG-3抗体或环磷酰胺。

所述方法中的宿主是任意的脊椎动物，优选哺乳动物包括驯养动物、运动动物(sport animals)和灵长类动物，包括人。

给予宿主的药物组合物或疫苗的剂量根据宿主种属、宿主的大小和宿主的病情或疾病相应变化。组合物的剂量还取决于给予组合物的频率和给予途径。在某些实施方案中，单个剂量含有大约10²到大约10¹²个减毒利斯特氏菌的生物体。在某些实施方案中，单个剂量含有大约10⁶到大约10¹¹个减毒利斯特氏菌的生物体。在其他实施方案中，单个剂量的药物组合物或疫苗含有大约10⁷到大约10¹⁰个减毒生物体。

V.试剂盒

本发明进一步提供了含有本发明的减毒利斯特氏菌(如前面介绍的和在下面的实施例中的)的试剂盒(或制造的商品)。

一方面，本发明提供了试剂盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的组合物，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子；和(b)将该组合物用于预防或治疗宿主的疾病的说明书。在某些实施方案中，该说明书在试剂盒上或试剂盒中的标签上。在其他实施方案中，该说明书在包含于试剂盒中的插入物上。

另一方面，本发明提供了试剂盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的组合物，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减，并且含有编码非利斯特氏菌抗原的核酸分子；和(b)将该组合物给予宿主的说明书。在某些实施方案中，该说明书在试剂盒上或试剂盒中的标签上。在其他实施方案中，该说明书在包含在试剂盒中的插入物上。在某些实施方案中，该说明书在试剂盒上或试剂盒中的标签上。在其他实施方案中，该说明书在包含在试剂盒内的插入物上。

另一方面，本发明提供了试剂盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的组合物，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减；和(b)将该组合物用于预防或治疗宿主疾病的说明书。在某些实施方案中，该利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散还被衰减。在某些实施方案中，该说明书在试剂盒上或试剂盒中的标签上。在其他实施方案中，该说明书在包含在试剂盒内的插入物上。

本发明进一步提供了试剂盒，其含有(a)含有利斯特氏菌的组合物，其中的利斯特氏菌进入非吞噬细胞被衰减；和(b)将该组合物给予宿主的说明书。在某些实施方案中，该利斯特氏菌的细胞到细胞的扩散还被减毒。在某些实施方案中，该说明书在试剂盒上或试剂盒中的标签上。在其他实施方案中，该说明书在包含在试剂盒内的插入物上。

实施例

用下述实施例解释本发明，不过本发明不局限于此。

实施例1.构建突变利斯特氏菌株

A.制备突变的利斯特氏菌株

利斯特氏菌株来自10403S(Bishop等人，J.Immunol.139：2005(1987))。用已有的SOE-PCR和等位基因交换的方法(Camilli等人，Mol.Microbiol.8：143(1993))产生带有所示基因的符合读框的(in-frame)缺失的利斯特氏菌株。在Glomski等人J.Cell.Biol.156：1029(2002)中介绍了突变菌株LLO L461T(DP-L4017)，引入此处作为参考。ΔactA突变株(DP-L4029)是在Skoble等人，J.of Cell Biology，150：527-537(2000)中介绍的DP-L3078菌株，引入此处作为参考，其去除了原噬菌体。(在(Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177(2002)、美国专利申请公开号2003/0203472)中介绍了原噬菌体去除(curing))。以前还报道了LLO^-突变体(DP-L4027)(Lauer等人，J.of Bacteriology，184：4177-4186(2002))、和LLOΔ26(DP-L4042)(Decatur等人，Science290：992(2000))。在共同未决的美国临时申请60/446,051(提交于2003年2月6日)中介绍了名为L4029/uvrAB的ΔactAΔuvrAB菌株的构建(参见该申请的实施例7)。DP-L4029uvrAB(又称为ΔactAΔuvrAB或actA^-/uvrAB^-)在2003年10月3日保藏于ATCC，检索号为PTA-5563。

B.通过等位基因交换使利斯特氏菌中缺失inlB所构建的pKSV7-dl inlB。

可以通过如Gamilli等人，Mol.Microbiol.8：143-147(1993)中所描述的等位基因交换实现利斯特氏菌DP-L4029(或从其它选定的突变菌株或从野生型利斯特氏菌)中的inlB缺失。可以用拼接重叠延伸(SOE)PCR制备用于等位基因交换步骤的构建体(construct)。内化素B基因的来源是列在Genbank中的序列，其检索号是AL591975(单核细胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因组、片段3/12；inlB基因区域：nts.97008-98963)，引入此处作为参考，和/或列在Genbank中的检索号为NC-003210(单核细胞增生利斯特氏菌株EGD，完整基因组，inlB基因区域：nts.457008-458963)，引入此处作为参考。

在初次PCR反应中，用下述模板和引物扩增分别从利斯特氏菌inlB基因的5’端和3’端上游和下游大约1000bp的序列：

模板：DP-L4056或DP-L4029基因组DNA

引物对1(用于扩增inlB 5’端的上游区域)：

Lm-96031F：5’-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG(SEQ ID NO：2)

(T_m：72℃)

Lm-(3’inlB-R+)97020R：5’-AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT(SEQ ID NO：3)(T_m：114℃)

(下划线的序列和InlB的羧基末端的下游区域互补。)

扩增子大小(bp)：1007

引物对2(用于扩增inlB3’端的下游区域)：

Lm-(5’inlB-F+)98911F：5’-CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC(SEQ ID NO：4)(T_m：118℃)

(下划线序列和InlB的氨基末端的下游区域互补。)

Lm-99970R：5’-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC(SEQ ID NO：5)(T_m：74℃)

扩增子大小(bp)：1074

在二次PCR反应中，利用在引物对1的反向引物和引物对2的正向引物间的互补性，通过SOE PCR将初次PCR扩增子融合。结果得到精确的inlB编码序列：nts.97021-98910＝1889bp缺失。下面的模板和引物用于次级PCR反应：

模板：纯净的初次PCR反应产物

引物对：

Lm-96043F：5’-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG(SEQ ID NO：6)

(T_m：74℃)

Lm-99964R：5’-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC(SEQ ID NO：7)

(T_m：74℃)

(扩增子大小(bp)：2033)

完成该构建流程的操作如下：

用Vent DNA聚合酶(NEB)和10μl洗涤后的利斯特氏菌DP-L4056或DP-L4029在30℃的过夜培养物进行初次PCR反应(3个温度循环)。用1％的琼脂糖凝胶检测预计大小的利斯特氏菌扩增子(1007bp和1074bp)。凝胶纯化初次PCR反应物，用GeneClean(BIO 101)洗脱DNA。

用大约等量的每种初次PCR反应物作为模板(ca.5μl)进行二次PCR反应。用1％的琼脂糖凝胶确定来自二次PCR反应的预计大小的利斯特氏菌扩增子(2033bp)。用Taq聚合酶将腺苷残基添加到利斯特氏菌dl inlB扩增子的3’末端。

然后将该利斯特氏菌dl inlB扩增子插入到pCR2.1-TOPO载体中。用XhoI和KpnI酶切pCR2.1-TOPO-dl inlB质粒DNA，凝胶纯化2123bp片段。该KpnI/XhoI 2123bp片段插入到已经用KpnI和XhoI酶切并且用CIAP处理过的pKSV7载体中(pKSV7-dl inlB)。然后测定在pKSV7-d1inlB中的dl inlB序列的保真度。用pKSV7-dl inlB质粒通过等位基因交换从目的利斯特氏菌株中缺失inlB基因。

C.构建抗原表达菌株

制备突变利斯特氏菌株，其表达截短形式的模型抗原卵白蛋白(OVA)、名为AH1(SPSYVYHQF)(SEQ ID NO：8)的来自小鼠结直肠癌的免疫显性表位(CT26)和改变的表位AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ IDNO：9)；Slansky等人，Immunity，13：529-538(2000)。用pPL2整合性载体(Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177(2002)；美国专利公开号2003/0203472)得到含有单拷贝整合到利斯特氏菌基因组的无害位点(innocuous site)的OVA和AH1-A5/OVA重组利斯特氏菌株。

i.表达OVA利斯特氏菌的构建(DP-L4056)。

首先制备由溶血素-缺失的LLO与截短的OVA融合组成的并包含于pPL2整合载体(pPL2/LLO-OVA)中的抗原表达盒。在PSA(Phage fromScottA)的附着位点tRNA^Arg-attBB’处将pPL2/LLO-OVA导入到噬菌体-去除的(phage-cured)的单核细胞增生利斯特氏菌株DP-L4056中得到利斯特氏-OVA疫苗菌株。

用下述的模板和引物通过PCR扩增溶血素缺失LLO：

来源：DP-L4056基因组DNA

引物：

正向引物(KpnI-LLO nts.1257-1276)：

5’-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO：10)

(T_m：LLO-spec：52℃。整体：80℃)

反向引物(BamHI-XhoI-LLO nts.2811-2792)：

5’-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQ ID NO：11)

(T_m：LLO-spec：52℃。整体：102℃)

用下述的模板和引物还通过PCR扩增截短的OVA：

来源：来自DP-E3616大肠杆菌的pDP 3616质粒DNA(Higgins等人，Mol.Molbiol.31：1631-1641(1999))。

引物：

正向引物(XhoI-NcoI OVA cDNA nts.174-186)：

5’-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQ ID NO：12)

(T_m：OVA-spec：60℃。整体：88℃)

反向引物(XhoI-NotI-HindIII)：

5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT(SEQ ID NO：13)

(T_m：整体：82℃)

完成该构建过程的操作包括首先是用KpnI和BamHI切割LLO扩增子，并插入到KpnI/BamHI位点导入到pPL2载体中(pPL2-LLO)。然后用XhoI和NotI切割OVA扩增子并插入到已经经过XhoI/NotI切割的pPL2-LLO中(注意：该pPL2载体不含有任何XhoI位点；pDP-3616含有1个XhoI位点，该位点在OVA的反向引物设计中形成的)。用限制性分析(KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和测序验证构建体pPL2/LLO-OVA。通过转化将pPL2/LLO-OVA质粒导入到大肠杆菌中，然后通过Lauer等人所述的接合方法使之导入并整合到利斯特氏菌(DP-L4056)中(或其他目的利斯特氏菌株中，如ΔinlB突变体或ΔactAΔinlB双突变体)。

可以在美国临时申请名称为“Free Living Microbe BasedVaccine Compositions”，美国系列号60/511,869，提交于2003年10月15日的专利的实施例8中发现表达OVA的抗原表达盒插入的描述。

ii.表达AH1/OVA或AH1-A5/OVA的利斯特氏菌株的构建。

为了制备表达AH1/OVA或AH1-A5/OVA的抗原序列的利斯特氏菌株，首先从寡核苷酸制备携带该抗原的插入片段，然后连接到pPL2-LLO-OVA载体中(如上述描述制备的)。

用下述寡核苷酸制备AH1或AH1-A5的插入片段：

AH1表位插入片段(ClaI-PstI相容末端)：

上链(Top strand)寡核苷酸(AH1 Top)：

5’-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQ ID NO：14)

下链(Bottom strand)寡核苷酸(AH1 Bottom)：

5’-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQ ID NO：15)

AH1-A5表位插入片段(ClaI-AvaII相容性末端)：

AH1-A5表位序列为SPSYAYHQF(SEQ ID NO：9)(5’-AGT CCA AGTTAT GCA TAT CAT CAA TTT-3’)(SEQ ID NO：16)

Top：5’-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQ ID NO：17)

Bottom：5’-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQ IDNO：18)

将该既定表位的寡核苷酸对等摩尔比混合，95℃加热5分钟。让该寡核苷酸混合物缓慢冷却。然后按照200∶1的摩尔比将退火的寡核苷酸对与用相应限制性酶消化制备的pPL2-LLO/OVA质粒连接。用限制性分析和/或测序鉴定该新的构建体。

通过转化将该质粒导入到大肠杆菌中，然后通过Lauer等人所述的接合方法使之导入并整合到利斯特氏菌(DP-L4056)中(或其他目的利斯特氏菌株中，如ΔinlB突变体或ΔactAΔinlB双突变体)。

实施例2.利斯特氏菌致病性研究

用IV感染小鼠测定某些突变利斯特氏菌株的中值致死剂量(LD₅₀)。用三份所述菌株的5倍稀释液IV感染3到5只雌性C57BL/6小鼠。每天观测小鼠，连续10天，并且当其表现出痛苦征兆时处死小鼠。计算中值致死剂量。其数据如下述表1所示。结果表明和actA缺失联用时的内化素B缺陷(ΔinlB、ΔactAΔinlB和ΔactAΔinlAB)的突变利斯特氏菌株的毒性较小。仅ΔinlB的菌株表现出和野生利斯特氏菌相似的毒性。

表1.减毒的单核细胞增生利斯特氏菌株

  菌株  基因型  表型  在C57BL/6小鼠上的  致病性LD₅₀(cfu)  亲本(Parental)  DP-L4056  野生型；10403S，  无噬菌体  野生型  1×10⁵  DP-L4406  ΔinlB  ΔinlB介导的感染被破坏  1×10⁵  DP-L4029  ΔactA  细胞到细胞的扩散缺陷  1×10⁸  ΔactAΔinlB  无宿主肌动蛋白成核；细  胞到细胞扩散缺陷；Δ   inlB介导的感染被破坏  1×10⁸  ΔactAΔinlAB  1×10⁹

实施例3.单细胞增生利斯特氏菌接种小鼠的体内细胞毒性活性评价

用一系列实验对接种小鼠体内裂解抗原特异性靶细胞的能力进行评价。在第一个实验中，如表2所示，通过静脉内(IV)或肌肉内(IM)用单核细胞增生利斯特氏菌株DP-L4029(ΔactA)、DP-L4029ΔinlB(ΔactAΔinlB)和经改造表达AH1-A5的相同的菌株接种Balb/c小鼠。表达AH1-A5的利斯特氏菌构建体还表达溶血素缺失LLO和截短的OVA(参见上述实施例1.C)。接种剂量为0.1LD₅₀。在RPMI1640培养基中收获10个原初Balb/c小鼠的脾，制备靶细胞群。分离该细胞并且裂解红细胞。计数白细胞并分成两等份。用0.5μg/ml的靶(AH1，SPSYVYHQF(SEQ ID NO：8)，购自SynPep，Dublin，CA)或对照(β-gal，TPHPARIGL(SEQ ID NO：19))的特异性肽37℃的条件下对每组进行脉冲处理90分钟。然后用培养基洗涤细胞3次，再用PBS+0.1％BSA洗涤2次。将细胞按照1×10⁷/mL重悬浮在温热的PBS+0.1％BSA(10mL或小于10mL)中用于用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Molecular Probes公司，Eugene OR)进行标记。向靶细胞悬浮液中加入1.25μl的5mM的CFSE储液，并将样品涡旋混合。向对照细胞悬浮液中加入10倍稀释的CFSE储液，并将样品涡旋混合。将细胞在37℃温育10分钟。通过添加大量(＞40ml)的冰预冷的PBS使染色终止。用PBS在室温下洗涤细胞2次，然后重悬并计数。将每种细胞悬浮液稀释到50×10⁶/mL，并且各取100μl混匀的细胞，经过尾静脉注射到原初的或疫苗接种6天后的小鼠上。在12-24小时后，收获脾，并用流式细胞术分析共5×10⁶个细胞。计数高(靶)和低(对照)的荧光峰，并用二者的比确定相对于HBSS对照群的靶细胞裂解的百分比。结果如表2和图1A所示。(本实施例的表中所示的是3只小鼠的平均值，而在图中则表示为单个小鼠的代表性的柱状图)。当用IV而不是IM给药时，用ΔactAinlB接种和用ΔactA的相比，显示抗原特异性体内细胞毒性的改善。

表2.按照所示接种的Balb/c小鼠体内细胞毒性(靶细胞相对于未接种的对照样本的杀伤百分比)

  免疫物  小鼠数量  接种剂量  靶细胞的  杀伤百分比  HBSS  3  100μL IV  0  ΔactA  3  5×10⁶在100μL中IV  -0.1  ΔactA AH1-A5  3  5×10⁶在100μL中IV  11.5  ΔactAΔinlB  3  1×10⁷在100μL中IV  1.7  ΔactAΔinlB AH1-A5  3  1×10⁷在100μL中IV  23.5  ΔactA  3  5×10⁶在100μL中IM  1.5  ΔactA AH1-A5  3  5×10⁶在100μL中IM  8.5  ΔactAΔinlB  3  1×10⁷在100μL中IM  2.8  ΔactAΔinlB AH1-A5  3  1×10⁷在100μL中IM  8.7

按照表3通过IV接种，用表达AH1-A5的ΔactA和ΔactAΔinlB双突变这两种菌株进行了另一项研究。在这个研究中，用β-gal、AH-1或P60-217(KYGVSVQDI(SEQ ID NO：20)利斯特氏菌特异性对照)脉冲(pulsed)原初脾细胞。β-gal脉冲的细胞用低CFSE标记，而AH1和P60-217脉冲的细胞用高CFSE标记。在第5天，用β-gal和AH1脉冲的细胞注射到各组的2只小鼠中。在第5天，向各组剩下的另外2只小鼠中注射β-gal和P60-217脉冲的细胞。结果如表3和图1B所示。

表3.按照所示接种的Balb/c小鼠体内细胞毒性(靶细胞相对于未接种的对照样本的杀伤百分比)

  免疫物  小鼠数量  接种剂量  靶  杀伤百分比  HBSS  2  100μL  P60-217  0  ΔactA AH1-A5  2  5×10⁶在100μL中  P60-217  62.4  ΔactAΔinlB AH1-A5  2  1×10⁷在100μL中  P60-217  42.0  HBSS  2  100μL  AH1  0  ΔactA AH1-A5  2  5×10⁶在100μL中  AH1  19.7  ΔactAΔinlB AH1-A5  2  1×10⁷在100μL中  AH1  28.0

按照表4通过IV接种有或没有AH1-A5的ΔactAΔinlB双突变体进行了另一项研究。在这个研究中，用β-gal、AH1或AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO：9))脉冲原初脾细胞。β-gal脉冲的细胞用低CFSE标记，AH1或AH1-A5脉冲的细胞用高CFSE标记。在第6天，上述用β-gal和AH-1脉冲的细胞注射到各组的3只小鼠中。在第6天，向各组剩下的3只小鼠中注射β-gal和AH1-A5脉冲的细胞。结果如表4和图1C所示。

表4.按照所示接种的Balb/c小鼠体内细胞毒性(靶细胞相对于未接种的对照样本的杀伤百分比)

  免疫物  小鼠数量  接种剂量  靶  杀伤百分比  HBSS  3  100μL  AH1  0  ΔactAΔinlB  3  1×10⁷在100μL中  AH1  0.7  ΔactAΔinlB AH1-A5  3  1×10⁷在100μL中  AH1  31.8  HBSS  3  100μL  AH1-A5  0  ΔactAΔinlB  3  1×10⁷在100μL中  AH1-A5  5.7  ΔactAΔinlB AH1-A5  3  1×10⁷在100μL中  AH1-A5  94.9

实施例4.用ΔactAΔinlB双突变单核细胞增生利斯特氏菌的治疗性接种

使用Blab/c小鼠，将CT26肿瘤细胞(ATCC CRL-2639)注射到小鼠中(2×10⁵在100μL HBSS中，IV)建立肺转移。CT26细胞是表达MMTV gp70表位AH1的鼠结肠腺癌(该细胞被进一步修饰使之表达人肿瘤抗原，但该特性与此处所示数据没有关系)。用一系列研究对用ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌作为有效的治疗性疫苗菌株进行评价。在一个研究中，用经修饰可表达AH1-A5的ΔactA单核细胞增生利斯特氏菌、和经修饰可表达AH1-A5的ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌免疫13只小鼠的组。所有菌株在BHI(BrainHeart Infusion，Fisher Scientific)培养基中，于37℃、300转/分钟的条件下生长，并且在使用前冷冻保存。将各菌株的冷冻存储物稀释到HBSS中，在植入肿瘤4天后，用1×10⁷CFU，100μL将各菌株经静脉内接种到小鼠中，并且用100μL HBSS作为对照。在植入肿瘤20天后，每组各处死3只小鼠并收获肺(如图2A所示)。

观察每组剩下的10只小鼠的存活(未出示数据)。在10只小鼠的组中进行其他实验(仅是存活的，未从任何1只小鼠中收获肺)，在一个实验中，使用ΔactA AH1-A5和ΔactAΔinlB AH1-A5以及表达OVA的L461T作为无关抗原对照，在另外一个实验中使用表达FluHA的ΔactA作为无关抗原。在图2B和2C分别表示这些实验的存活结果。AH1抗原对小鼠而言是内源性的，所以任何免疫作用将会打破小鼠的免疫耐受性。结果表明ΔactAΔinlB突变体是能够打破这些模型的耐受性的有效的疫苗，而且它能够显著提高荷瘤小鼠的存活。

实施例5.在肌肉内给药后各种单核细胞增生利斯特氏菌的免疫原性

将100μL含有0.1LD₅₀的表5所示单核细胞增生利斯特氏菌的HBSS通过IM注射到C57BL/6小鼠(每组3只)中。所有菌株在BHI(Brain Heart Infusion，Fisher Scientific)培养基中，于37℃、300转/分钟的条件下生长，并且在使用前冷冻保存。在接种后第7天处死小鼠，收取脾，并用细胞内细胞因子染色法(ICS)进行评价。

为了ICS，将来自接种和对照组的小鼠的脾细胞在存在BrefeldinA(Pharmingen)的情况下，和下述物质温育5小时，这些物质是：SL8OVA_257-264肽(SL8 OVA抗原，SIINFEKL(SEQ ID NO：21)Invitrogen，San Diego，CA)(该肽能刺激OVA特异的CD8+细胞)、LLO₁₉₀(NEKYAQAYPNVS(SEQ ID NO：22)，Invitrogen)(利斯特氏菌溶胞素的MHC II类表位)或LLO₂₉₆(VAYGRQVYL(SEQ ID NO：23)，Invitrogen)(利斯特氏菌溶胞素的MHC I类表位)。Brefeldin A能够抑制刺激T细胞时的细胞因子的分泌。脾细胞和不相关性MHC I类肽温育作为对照。用20ng/mL PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酯，Sigma)和2μg/mL的离子霉素(Sigma)刺激的脾细胞作为IFN-γ和TNF-α细胞内细胞因子染色的阳性对照。为了检测细胞质中细胞因子的表达，用FITC-抗-CD4mAb(RM4-5)和PerCP抗CD8mAb(53-6.7)进行细胞染色，并用Cytofix/Cytoperm溶液(Pharmingen)固定和透化，然后用PE缀合的抗TNFαmAb(MP6-XT22)和APC缀合的抗IFN-γmAb(XMG1.2)在冰上染色30分钟。用流式细胞术(FACScalibur，Becton Dickinson，Mountain View，CA)确定表达细胞内IFN-γ和/或TNFα的细胞的百分比，并用CELLQuest软件(Becton Dickins on ImmunocytometrySystem)进行数据分析。FACScalibur能够区分所有在各种抗体上的荧光标记，通过门控(gating)被抗IFN-γ或抗TNFα、或者被这两种染色的CD8+和CD4+的细胞确认合适的细胞。结果如图3A-F所示。ΔactAΔinlB菌株是比较有效的引发OVA特异免疫应答的菌株之一。

表5.用多种单核细胞增生利斯特氏菌株接种C57BL/6

  接种菌株  介绍  接种剂量  DP-L4029  ΔactA  1×10⁷  DP-L4017 OVA  L461T LLO突变体，表达OVA  7.5×10⁶  DP-L4027 OVA  Δhl^-(LLO^-)突变体，表达OVA  1×10⁸  DP-L4029 OVA  ΔactA突变体，表达OVA  1×10⁷  DP-L4038 OVA  ΔactA L461T双突变体，表达OVA  2×10⁷  DP-L4042 OVA  LLOΔ26(PEST^-)突变体，表达OVA  5×10⁷  DP-L4056 OVA  野生型，表达OVA  5×10⁴  DP-L4097 OVA  S44A LLO突变体，表达OVA  1×10⁷  DP-L4364 OVA  Δlpl突变体，表达OVA  2×10⁷  DP-L4384 OVA  LLO S44A/L461T双突变体，表达OVA  5×10⁷  DP-L4404 OVA  ΔinlAΔinlB双突变体，表达OVA  5×10⁴  DP-L4405 OVA  ΔinlA突变体，表达OVA  5×10⁴  DP-L4406 OVA  ΔinlB突变体，表达OVA  1×10⁵  P60-LL0 OVA  ΔP60突变体，表达OVA  1×10⁶  DP-L4029lplA^- OVA  ΔactAΔlplA双突变体，表达OVA  2×10⁸  DP-L4029ΔinlB OVA  ΔactAΔinlB双突变体，表达OVA  1×10⁸  MACKuvr^- LLO  OVA/AH1  Δuvr突变体，表达OVA/AH1  2×10⁵

实施例6.对单核细胞增生利斯特氏菌株在C57BL/6小鼠中诱导的OVA特异免疫性的评价

将200μL含有0.1LD₅₀的表6所示菌株的HBSS通过IV注射到C57BL/6小鼠(每组3只)中。ΔinlB菌株注射的剂量过高，这些小鼠没有生存7天。在接种后第7天处死小鼠，收取脾，按照实施例5中的ICS方法，对针对异种抗原卵白蛋白(OVA)、针对利斯特氏菌抗原、LLO的抗原特异性T细胞应答进行评价。除了用OVA、SL8(OVA257-264)和LLO(LLO190-201，LLO296-304)的T细胞表位刺激接种小鼠和对照小鼠的脾细胞之外，还用来自C57BL/6小鼠的鼠thymoma(EL-4)刺激细胞5小时，而且用编码卵白蛋白(EG-7)的质粒稳定转染EL-4细胞。使用活的或用150μM的补骨脂素S-59和3J/cm²UVA光(FX 1019辐射装置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)失活后的刺激细胞。用S-59失活指的是光化学处理(PCT)，并且造成该细胞的彻底失活。针对IFN-γ的除了LLO刺激样本的结果如图4所示。当用最佳的T细胞表位SL8或完整的肿瘤细胞、活的或失活的刺激5小时的时候，可以观察到对接种小鼠脾细胞的相当的刺激。用完整细胞刺激的结果表明OVA特异性T细胞识别肿瘤细胞的内源性OVA水平。ΔactAΔinlB菌株相对用肽和完整细胞刺激导致较强的OVA特异应答。

表6.用多种单核细胞增生利斯特氏菌株接种C57BL/6

  接种菌株  介绍  接种剂量(CFU)  HBSS  对照  100μL  DP-L4029ΔinlB  ΔactAΔinlB双突变体  1×10⁸  DP-L4056 OVA  野生型  5×10⁴  DP-L4017 OVA  L461T LLO突变体  7.5×10⁶  DP-L4029 OVA  ΔactA  1×10⁷  DP-L4364 OVA  lplA^-  2×10⁷  DP-L4406 OVA  ΔinlB  1×10⁶  DP-L4038 OVA  ΔactAL461T双突变体  2×10⁷  DP-L4029 lplA^-OVA  ΔactAΔlplA双突变体  2×10⁸  DP-L4017 lplA^-0VA  lplA^-L461T双突变体  1×10⁷  DP-L4029ΔinlB OVA  ΔactAΔinlB双突变体  1×10⁸

为了观察剂量反应，用单核细胞增生利斯特氏菌野生型、经修饰可表达OVA的ΔactA和ΔactAΔinlB菌株进行了另一项研究。在200μL含有下述物质的HBSS：野生型为5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹；ΔactA为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、5×10⁴、1×10⁴；ΔactAΔinlB为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、5×10⁴经IV注射到C57BL/6小鼠(每组3只)中。在接种7天后处死小鼠，收取脾，并用ICS评价，用SL8、LLO₁₉₀和LLO₂₉₆肽刺激。结果示于图5。

实施例7.经过不同途径对小鼠给药时表达LLO-OVA的ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌双突变体的免疫原性

用ΔactA(DP-L4029)单核细胞增生利斯特氏菌或ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌双突变体注射Balb/c小鼠，两种突变体均经过改造表达OVA抗原。用在HBSS中的1×10⁷CFU的ΔactA或1×10⁸CFU的ΔactAΔinlB，以200μL经过IV(静脉内)以100μL经过SC(皮下)、以100μL经过IM(肌肉内，每条腿的四头肌各50μL)、以50μL经过IM(25μL每条腿的胫骨肌)、以50μL经过ID(皮内)、或以200μL经过IP(腹膜内)向小鼠注射给药(每组3只)。接种经过7天后，取出脾并按照实施例5(仅对SL8，仅对IFN-γ)，用细胞内细胞因子染色进行评价(ICS)。图6显示了脾中CD-8+OVA特异性T细胞的％，表明经过多种途径给药，actA/inlB突变体比ΔactA产生的应答更大，同时IV、IP和IM途径表现出更高的应答。

实施例8.ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌突变体在原初免疫活性(competent)C57BL/6小鼠中的体内生长动力学

尽管和野生型相比，减毒的利斯特氏菌株能够给予更高剂量，但对于开发能够被迅速清除感染并且不损伤主要感染器官如肝或脾的安全疫苗非常重要。

用单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4056(野生型)、DP-L4029(ΔactA)、DP-L4406(ΔinlB)或ΔactAΔinlB菌株注射C57BL/6小鼠。注射为IV如表7所示水平的100μL HBSS，包括HBSS对照组在内，每组35只小鼠。所有的菌株均在BHI培养基(Brain Heart Infusion，Fisher Scientific)中、在37℃下、300转/分钟的条件下生长，并且在使用前冷冻保存。按照表7所示的时间点每组处死3只小鼠，取出血、脾、肝用于分析。在含有0.05％的Triton X-100的5mL双蒸水中匀浆肝和脾，通过系列稀释液铺板到BHI/链霉素平板中，测定存活的利斯特氏菌的数目。用10％缓冲的甲醛固定每组2只小鼠的肝和脾。在图7A和8A中显示了每个肝和脾的CFU结果。按照图7B和8B所示的菌株浓度重复该实验。

野生型利斯特氏菌对小鼠的感染在给药后8-11天内消除。野生型利斯特氏菌的数量持续显著增加超过4天，并且在第11天时下降到在脾和肝中检测的最低水平。有意思的是，ΔinlB突变体在脾和肝中表现出相似的动力学在第11天诱导无菌免疫。相反，ΔactA突变体的数目只在最初的24小时内在肝中、但是未在脾中增加超过10倍，而且在感染4天后终于降低。ΔactAΔinlB双突变体尽管给予了最高剂量，但是和其它3种菌株相比，在肝中被非常迅速地清除，并在第4天诱导无菌免疫细菌加速清除与其在肿瘤治疗模型中诱导有效的保护性和抗原特异性免疫的能力形成对比。

表8.减毒单核细胞增生利斯特氏菌的体内生长动力学研究的剂量和取样程序

  菌株  剂量  注射后取样的时间点  HBSS  100μL  2小时、第1、2、3、4、7和10天  野生型  5×10⁴  2小时、第1、2、3、4、7和10天  ΔactA  1×10⁷  2小时、第1、2、3、4、7和10天  ΔinlB  5×10⁴  2小时、第1、2、3、4、7和10天  ΔActAΔinlB  1×10⁷  2小时、第1、2、3、4、7和10天

实施例9.多种单核细胞增多性利斯特氏菌株体外感染非吞噬细胞和吞噬细胞的比较

用野生型、ΔactA、ΔinlB和ΔactAΔinlB单核细胞增生利斯特氏菌株与人单核细胞系THP-1(ATCC#TIB-202)、初级人单核细胞、人肝细胞系HepG2(来自Drew Pardoll，Johns Hopkins University，也可获自ATCC#HB8065)、或初级人肝细胞(In vitro Technologies，Baltimore，MD)温育(37℃，5％CO₂)。使用Ficoll分级(gradient)纯化淋巴细胞，然后用缀合到单核细胞特异性抗体(Miltenyi Biotec)上的磁珠分离单核细胞从全血中制备初级人单核细胞。在补充有10％加热失活的胎牛血清(FBS)、23.8mM碳酸氢钠、1×非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES缓冲液和1mM丙酮酸钠的RPMI培养基中孵育THP-1和人单核细胞。将5×10⁵CFU利斯特氏菌株添加到5×10⁵THP-1细胞中，以及将3.5×10⁷CFU添加到3.5×10⁵单核细胞细胞中，在补充有20％加热失活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸的Eagle基础培养基(Minimal Essential Media Eagle)中孵育HepG2细胞。将1×10⁶CFU利斯特氏菌株添加到1×10⁵HepG2细胞中。在添加利斯特氏菌之前，在肝细胞生长孵育培养基(HepatocyteGrowth Incubation Media)(In vitro Technologies)中孵育初级人肝细胞，在添加利斯特氏菌后在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸的DMEM培养基中孵育初级人肝细胞。将3.5×10⁶CFU利斯特氏菌株添加到3.5×10⁵肝细胞中。温育1小时后，为了杀死全部细胞外细菌，用含有庆大霉素(50μg/mL)的完全培养基洗涤细胞。然后用225μL无菌水裂解细胞，然后添加25mL10×PBS。将获得的溶液系列稀释铺到BHI上，对每个样本的细菌滴度进行评价。利斯特氏菌感染细胞的数目除以添加到细胞的利斯特氏菌，以此确定该菌株的感染性，针对野生型菌株进行标准化。

结果表示在图9中。如图9所示，所有的菌株都能以相似的比率感染THP-1细胞和人肝细胞，这表明缺少ActA或InlB不会影响对吞噬细胞的感染。不过，缺少InlB的利斯特氏菌株对肝细胞的感染显著降低。用ΔinlB或ΔactAΔinlB这些InlB无效突变菌株感染时，对人肝细胞的感染降低了将近60％，对HepG2细胞的感染降低了将近80％。这些研究表明InlB蛋白质缺失能通过防止培养的和初级肝细胞的感染而选择性地被吞噬细胞所摄取。

实施例10.调理的单核细胞增生利斯特氏菌在体外对非吞噬细胞和吞噬细胞的感染的比较

用来自经过静脉给予ΔactA利斯特氏突变体(1∶20稀释)或对照HBSS感染的小鼠的高滴度的利斯特氏菌特异性小鼠血清与野生型利斯特氏菌在冰上预温育1小时。分别在1和10MOIs下，于37℃感染吞噬性树突细胞样细胞系(DC2.4)和非吞噬性结肠上皮细胞系(Caco-2)1小时。洗涤细胞3次去除细胞外细菌。在50mg/ml庆大霉素存在下再培养细胞2小时，以此杀死残留的细胞外细菌。用含0.01％Triton X-100的dH₂O裂解细胞，以测定对细胞系的感染性。将系列稀释物铺到BHI琼脂板上，测定存活的利斯特氏菌数目。

如图10所示，和来自接种小鼠的高滴度免疫血清温育的ΔactA利斯特氏菌感染非吞噬细胞系Caco-2，而不是吞噬性树突细胞系DC2.4的能力降低。由调理的利斯特氏菌的对非吞撒细胞的感染的下降和用缺失actA和inlB的减毒利斯特氏菌株产生的结果相当(图9)。不想被理论所束缚，用利斯特氏特异性抗体(靶向内化素的单克隆抗体，或多克隆抗体Abs)可能封闭ΔactA利斯特氏菌表面的能进行体内非吞噬细胞感染的受体。

实施例11.S-59补骨脂索UVA处理利斯特氏菌的范例。

利斯特氏菌的ΔactAΔuvrAB突变株(DP-L4029uvrAB)经修饰可表达OVA抗原。用不同浓度的补骨脂素S-59处理该菌株和经修饰可表达OVA的DP-L4029。利斯特氏菌株在37℃下生长过夜，并且将2mL等份(aliquot)稀释到100mL的BHI中，在37℃下生长将近4小时，达到OD600为0.5(将近1×10⁹CFU/mL)。将5mL等份的每种利斯特氏菌加入到15mL的试管中，在2300×g离心20分钟，去除上清，将细菌重悬到5mL PBS中，最终大约为1×10⁹CFU/mL。对于uvrAB突变菌株，将3mM S-59储液33.3μL稀释到10mL PBS中以提供10μM溶液，并且向利斯特氏菌中加入适当等份的该溶液，使其终浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100nM，同时，对于DP-L4029，加入S-59，使其在5mL的终体积中，终浓度为100、200、400、800和1000nM。将这些菌转移到6孔培养板中，接受0.5J/cm²剂量的照射(FX1019 UVA装置)。将样本转移到15mL的试管中，添加5mL PBS，然后在2300×g下离心20分钟，以此洗涤未反应的补骨脂素。去除上清并且将细菌重悬在5mL的PBS中，再转移到新的6孔板中。为了将补骨脂素的单加成物(monoadduct)转变成交联物，这些菌接受5.5J/cm²剂量的UVA照射。将每种利斯特氏菌株的样本在72℃加热3小时，使之被加热杀死。

用鼠DC 2.4细胞系(来自Dana Farber Cancer Institute的树突细胞系，参见Shen等人，J Immuno1158(6)：2723-30(1997))和B3Z T细胞杂交瘤(得自Dr.Shastri，University of California，Berkeley)评价细菌样本的抗原呈递。B3Z是lacZ可诱导性CD8+T细胞杂交瘤，当识别MHC I类分子的OVA抗原时，该细胞能表达β半乳糖酶基因。用β半乳糖苷酶的底物CPRG(氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷，Calbiochem，La Jolla，CA)的代谢检测β半乳糖苷酶的产生水平，该水平与由DC 2.4细胞呈递的OVA的抗原量直接相关。在含有10％FBS(胎牛血清，HyClone)的PRMI1640培养基(RPMI，Invitrogen)中维持DC 2.4细胞和B3Z T细胞杂交瘤。将200μL等份的DC2.4细胞转移到96孔培养板中(每孔1×10⁵DC 2.4)。将50μL细菌样本的母液系列稀释到450μL PBS中使之达到1×10⁵CFU/mL(S-59处理样本是CFU相等的，即S-59处理前的集落形成单位数)。将各稀释度的20μL等份转移到含DC 2.4细胞的孔中，使之达到大约1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷或1×10⁸CFU/mL。另外，只加20μL等份的PBS作为阴性对照。样本在37℃、5％CO₂下温育1小时。用PBS洗涤平板3次，去除细胞外细菌。将200μL等份B3Z T细胞(1×10⁵个细胞)和100μg/ml庆大霉素(Sigma)添加到每个孔中。作为阳性对照，将100nM SL8 OVA_257-264肽(SL8 OVA抗原，SIINFEKL(SEQ ID NO：21)，Invitrogen，San Diego，CA)添加到各含1×10⁵的DC2.4和B3Z细胞的孔中。样本在37℃、5％CO₂下温育过夜。在400×g离心平板3分钟，并用250μL PBS洗涤各孔。向各个孔中加入含100μM 2-巯基乙醇、9mM MgCl₂、0.125％ Igepal CA-630((Octaphenoxy)polyethoxyethanol，Sigma)和0.15mM CPRG的100μL的PBS。样本在37℃温育至少4小时。用读板仪在595nm下(655nm参考测量)测量吸光度。

用S-59处理样本的结果如表8A、图11A和图11B(按照每个DC 2.4细胞1个利斯特氏菌，不扣除本底水平的情况下计算抗原呈递)所示。两种加热杀死的菌株的结果表现出滴度低于检测限(完全失活)，在B3Z分析中，该加热杀死的细菌不能呈递OVA抗原。结果表明uvrAB突变株显示非常强的抗原呈递，即使增殖减弱至检测限，而非uvrAB突变株在抗原呈递上显示极大的下降(作为增殖减弱的函数)(至大约基本完全失活的基底水平)。这表明uvrAB突变菌株保留了补骨脂素减毒的利斯特氏菌的MHC I类呈递的能力，而且提供了具有有效免疫应答和显著增强安全性水平的疫苗。

表8A在不同浓度补骨脂素S-59下经UVA处理的利斯特氏菌的Log衰减和OVA抗原呈递

  Log衰减  OVA抗原呈递％^*  [S-59]  nM  DP-LA029-  OVA  DP-LA029  uvrAB-OVA  DP-IA029-  OVA  DP-LA029  uvrAB-OVA  10  2.47  84  20  3.93  84  30  5.28  76  40  6.44  76  50  6.92  68  60  ＞7.62  84  70  ＞7.62  84  80  ＞7.62  88  90  ＞7.62  92  100  3.85  ＞7.62  50  92  200  5.48  47  400  6.78  19  800  ＞7.78  13  1000  ＞7.78  13

^*未处理的百分比、按照每DC2.4细胞1个利斯特氏菌测定。

用相同菌株进行了另一项研究。在这个研究中，利斯特氏菌在BHI中，于37℃下生长过夜。按照1∶50将这些菌稀释到BHI中，并且在37℃下、300转/分钟的条件下生长至OD₆₀₀为0.5，此时取出50mL该溶液转移到干净的摇瓶中，添加S-59使之达到表12B所示的水平。在37℃、300转/分钟的条件下培养这些样本大约1小时(OD₆₀₀大约1.0，大约1×10⁹/mL)，取出1mL等份用于评价滴度，将剩下的部分转移的150mM的培养皿中，在6J/cm²的剂量下照射(FX1019)。测定照射后每个样本的滴度，并且如上述方法测定OVA抗原呈递。可在表8B、图11C和图11D中看到结果(按照每个DC2.4细胞10利斯特氏菌的抗原呈递，不扣除本底进行计算)。结果表明母本菌株抗原呈递在基本上完全失活时是基底水平，而uvrAB突变株，在超过基本完全失活将近10倍范围的S-59浓度，还表现出充分的抗原呈递。

表8B在细菌生长过程中存在不同浓度补骨脂素S-59下经UVA处理的利斯特氏菌的Log衰减和OVA抗原呈递

  Log衰减  OVA抗原呈递％^*  [S-59]  μM  DP-LA029-  OVA  DP-IA029  uvrAB-OVA  DP-IA029-  OVA  DP-IA029  uvrAB-OVA  0.025  3.64  91  0.05  5.70  86  0.1  ＞8.10  87  0.2  ＞8.10  86  0.25  2.00  50  0.4  ＞8.10  74  0.5  5.28  31  0.8  ＞8.10  50  1.0  7.57  14  1.6  ＞8.10  35  2.0  ＞8.38  11  3.2  ＞8.10  16  4.0  ＞8.38  10  6.4  ＞8.10  11  8.0  ＞8.38  10  16.0  ＞8.38  11

^*未处理的百分比、按照每DC2.4细胞10个利斯特氏菌测定。

实施例12当存在预存免疫性(pre-existing immunity)和/或抗体时，利斯特氏菌突变体刺激抗原特异性应答的效力

经过IP将0.1LD₅₀的野生型利斯特氏菌感染C57BL/6小鼠1次或3次(间隔10天)，由此诱导出预存抗利斯特氏菌免疫性。当最后一次暴露于0.1 LD₅₀的所示利斯特氏菌株32天后，经ip对带有利斯特氏免疫性(1或3vx)以及原初小鼠接种。7天后收取脾，用针对IFN-g的细胞内细胞因子染色法测定OVA特异性CD8+T细胞的频率(frequency)。结果如图12A所示。发现在预存免疫性小鼠中的OVA特异性CD8+T细胞应答的致敏，其能够抵御致死量的野生型利斯特氏菌感染。

通过腹膜内用0.1LD₅₀的野生型利斯特氏菌，使所有C57BL/6小鼠感染，由此诱导出预存抗利斯特氏菌免疫性。用0.1LD₅₀所示利斯特氏菌株70天后经ip接种小鼠。21天后，向小鼠皮下植入2e5 B16-OVA肿瘤细胞并每周测量肿瘤2次。结果如图12B所示。肿瘤研究表明当存在抗利斯特氏菌免疫性时激发的OVA特异性免疫应答能够有效地抵御B16-OVA肿瘤的攻击。

通过静脉内用0.1LD₅₀的所示利斯特氏菌感染C57BL/6小鼠感染4次，由此得到高滴度免疫血清。收取免疫和非免疫血清，用利斯特氏菌特异性ELISA测定滴度。在第-1天和第1天，用200μL的盐水、血清(免疫或非免疫的)、或兔多克隆抗利斯特氏菌抗体iv注射原初的C57BL/6小鼠。在第0天，用0.1LD50的ΔactA-OVA利斯特氏菌经iv接种小鼠。回收脾，用针对IFN-g的细胞内细胞因子染色法测定OVA特异性CD8+T细胞的频率。结果如图12C所示。结果显示利斯特氏特异性抗体的被动转移到原初小鼠上没有降低处理小鼠的初级OVA特异性细胞免疫应答的致敏(priming)。

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                          (PCT实施细则第13条之二)

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