用乳酸菌发酵的人参、含有乳酸菌发酵人参的酸乳、及其制备过程中所用的乳酸菌

摘要

本发明涉及用乳酸菌对人参进行发酵所获得的人参的乳酸发酵产物，含有所述人参的乳酸发酵产物的酸乳以及用于制备所述人参的乳酸发酵产物的乳酸菌。

说明书

技术领域

本发明涉及用乳酸菌对人参进行发酵所获得的人参的乳酸发酵产物，含有所述人参的乳酸发酵产物的酸乳和在所述人参的乳酸发酵产物的制备中所用的乳酸菌。

背景技术

人参是一种多年生植物，在植物分类中属于五加科人参属。已知在地球上有约11种人参。有代表性的人参种包括高丽参(Panax ginseng C.A.Meyer)，它自然生长于北纬33°到48°的亚洲远东地区(韩国、中国东北的北部、俄罗斯地区)，并具有极好的药学功效；花旗参(Panaxquinquefolium L.)，它自然生长于或被栽培于美国和加拿大；三七(Panaxnotoginseng F.H.)，它自然生长于或被栽培于中国(云南省的东南地区和广西省的西南地区)；和珠子参(Panax japonicus C.A.Meyer)，它广泛分布于日本地区、中国东南部和尼泊尔。

人参根据植物功效在SINON HERBAL(在中国被称为神农本草经)这一中国最早的草药著述中被分类为高级，并在长时间内被用做贵重的滋补品。很多药理学实验都表明人参加强了人体对压力的非特异性抵抗力，还具有抗酸作用。还阐明了人参具有其他的药理功效，例如改善高血压、加强胰岛素的功能、降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平、降低大白鼠肝脏RNA的合成、促进蛋白合成、促进糖与脂质的代谢及抗癌功效。

在亚洲国家朝鲜、中国和日本，将人参用做一种天然的药物来治疗各种疾病，例如精神病、神经系统紊乱及糖尿病。皂苷为人参的一种主要的活性成分，其具有增强精力或持久力、镇静和抗高血压的功效。

目前，人参以下述形式进行利用：通过在室温对培育的天然人参进行干燥所得的白参的形式，和通过在98℃～100℃条件下对天然人参(绿人参)进行加热所得的红参的形式，或通过在120℃～180℃条件下对天然人参进行加热所制备的上等红参的形式。

另一方面，人参根含有约4％～10％的人参皂苷(例如高丽参含有约4％～8％的人参皂苷，花旗参含有4％～10％的人参皂苷)。所述人参皂苷是指不同人参皂苷的混合物。具体地，高丽参含有较高浓度的人参皂苷Rb1、Rc和Rg1，花旗参含有较高浓度的人参皂苷Rb1和Re。

人参中所包括的特定类型的人参皂苷和它们的药物学功效如下表1所示。

                          表1

  人参皂苷的  类型  功效  人参皂苷-  Rb1  通过镇静作用抑制中枢神经，抑制中枢神经性贪食，抑制好  斗行为，缓解疼痛，抗痉挛，抗忧虑，加速促肾上腺皮质激  素和皮质酮的分泌，促进胆固醇的生物合成，提高记忆力，  降低高胆固醇、中性脂肪和游离脂肪族酸，促进神经细胞的  存活，保护肝脏不受损伤，促进骨髓细胞中的DNA、RNA、  蛋白质和脂质的合成，加速乙酰胆碱的释放，血管舒张，抑  制血小板凝集，抑制脂质过氧化，促进胆固醇代谢，抗炎，  激活贪食功能，抑制肾小球肥大。  人参皂苷-  Rb2  加速糖和脂肪代谢，抗糖尿病作用，控制脂肪代谢的平衡，  加速蛋白质和脂肪的合成，降低高胆固醇和防止动脉硬化，  对癌毒性激素的拮抗，抑制平滑肌细胞的增殖，加速促肾上  腺皮质激素和皮质酮的分泌，DNA，RNA，改善食欲的压力  性降低，抑制肿瘤血管的生成，加速抗过氧化物质的产生，  激活肝组织的ATP供应，调节免疫力，促进胆固醇代谢、肝  细胞增殖和DNA合成的加速，抑制血小板凝集和缓解疼痛。  人参皂苷-  Rc  加速肝脏中RNA和血清胆固醇的合成，促进骨髓细胞中  DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，缓解疼痛，促进皮质酮  的分泌，促进前列环素的生物合成，抑制肾小球肥大。  人参皂苷-  Rd  加速促肾上腺皮质激素和皮质酮的分泌，抑制肾小球肥大。  人参皂苷-  Re  加速促肾上腺皮质激素和皮质酮的分泌，缓解疼痛，血管舒  张，抗高温应激，抑制平滑肌细胞的增殖，促进骨髓细胞中  DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，保护肝脏不受损伤，促  进胆固醇代谢。  人参皂苷-  Rg1  加强免疫功能，抑制血小板凝集，抗血栓形成，激活功效，  提高记忆和学习能力，抗疲劳，抗压力，使中枢神经兴奋，  血管舒张，抗炎，抗肾炎和用做增加肾脏血液流量的试剂，  保护不受诸如高温环境、抗热性-致热性物质等有害刺激损害  的功能，改善慢动作的压力性损害，促进神经细胞存活、肝  脏细胞的增殖和DNA合成的加速，加速促肾上腺皮质激素  的分泌，促进胆固醇代谢和保护肝脏不受损伤。  人参皂苷-  Rh1  抑制实验性肝损伤，促进肿瘤细胞分化，抑制血小板凝集，  抗炎和抗过敏。  人参皂苷-  Rh2  抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞再分化，抑制癌细胞渗透，抑  制肿瘤增殖，提高抗癌药物的抗癌活性，抗过敏。  化合物K  抑制肿瘤血管的显著生成和抑制癌细胞的扩散，阻断IV型  胶原酶的分泌，刺激形成抗再生血管，抑制血小板凝集，抗  过敏和抗炎。

已发现，与人参药理学功效相关的主要活性成分是诸如人参皂苷Rb1、Rb2和Rc等皂苷。然而，实际上具有抗肿瘤活性、抑制癌细胞转移的能力和/或抗过敏功能的活性物质包括诸如作为肠道细菌发酵产物的化合物K(20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇，(20-O-β-D-glucopyranocyl-20(S)-protopanaxadiol))、人参皂苷Rh1和Rh2以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等皂苷，但是这些皂苷是以极低量存在于人参中。

因此，有必要提高目前在天然人参中以极小量存在的诸如化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2(即人参皂苷Rk2和人参皂苷Rh3的混合物)等皂苷的量，以通过人参的药理学作用提高人体的抗癌活性、提高抗过敏功效以及加强免疫活性。

发明内容

因此，发明人还试图更有效地获得诸如化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等皂苷。结果，发明人发现用乳酸菌对人参进行发酵所获得的人参的乳酸发酵产物含有明显更多量的化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2。本发明是以所述的发现为基础。

因此，本发明的一个目的是提供人参的乳酸发酵产物。

其次，本发明的另一个目的是提供含有所述人参的乳酸发酵产物的酸乳。

再次，本发明的另一个目的是提供用于制备所述人参的乳酸发酵产物的乳酸菌。

具体实施方式

根据本发明，提供了：(1)人参的乳酸发酵产物，(2)含有所述人参的乳酸发酵产物的酸乳，和(3)用于有利地制备所述人参的乳酸发酵产物的乳酸菌。

下面将对本发明进行更具体的描述。

根据本发明，当采用乳酸菌对人参进行发酵时，发酵前的人参皂苷成分将被生物转换成化合物K(20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇)、人参皂苷Rh1和人参皂苷Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等皂苷成分，这些皂苷成分根本不包含于发酵前的所述人参中或包含的量极少。而人参的乳酸发酵产物至少含有一种下述成分：化合物K(20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇)、人参皂苷Rh1和人参皂苷Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2。

根据相关领域的普通知识，与人参皂苷Rb1、Rb2和Rc等皂苷成分相比，化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2，以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等皂苷成分具有更加优异的抗癌和抗过敏活性或抑制癌扩散的活性(参见以下文献：Bae等，Biol.Pharm.Bull.，25，743-747，2002；Bae等，25，58-63，2002；Wakabayashi等，Oncol.Res.，9，411-417，1998；Saiki等，Proceedings of the8th international symposium on Ginseng(Korea Ginseng Academy，Seoul，韩国)，305-316，2002；Hasegawa和Saiki，Proceedings of the 8th intemationalsymposium on Ginseng(Korea Ginseng Academy，Seoul，韩国)，317-334，2002)。

另一方面，可用于乳酸菌发酵的人参来源不受特殊的限制，可以使用以其天然形式或其加工产物形式存在的韩国人参(高丽参)以及诸如花旗参、三七和珠子参等其它种类的人参。更具体地，可以使用人参叶、人参提取物和人参粉末等中的至少一种或绿参、红参、白参及前面提及的其它种类的人参(以下统称为“人参”)。在加工方面，酸处理、高温和压力处理都可按需要于产生人参的乳酸发酵产物。

干粉形式人参的粉碎程度并没有特殊限制。可将人参粉碎，这样乳酸菌可以非常有效地渗透进人参的组织或纤维细胞中。人参的粉碎程度和其它粉碎方法已为相关领域普通技术人员所知。尽管酸处理、高温和压力处理可以很容易地应用于产物本身，考虑到其后的处理效果和发酵效率，优选采用干粉粉碎处理。

在干粉粉碎中人参的粉碎程度也不受特殊限制。

如果将至少一种粉碎过的、选自绿参、红参、白参、细参、花旗参、人参叶、人参提取物和人参粉末(以下统称为“人参来源”)的人参原料用乳酸菌发酵，则在乳酸菌发酵的人参产物中化合物K的含量显著提高。

酸处理的人参产物可以通过以下方法获得：向选自绿参、红参、白参、细参、花旗参、人参叶、人参提取物和人参粉末中的至少一种粉碎的人参原料中添加酸，在60℃混合培养5小时，然后用钙盐进行中和，所述酸优选乙酸、乳酸、柠檬酸、丁酸、酒石酸、丙酸或盐酸。根据本发明，当对酸处理过的人参用乳酸菌进行发酵时，在所得到的乳酸菌发酵产物中，人参皂苷Rh1和Rh2的量显著增加。

人参产物可以通过高温处理人参来制备，例如，红参可以通过将上述粉碎后的人参原料在100℃加热2小时～5小时来制备。根据本发明，当对高温处理过的人参用乳酸菌进行发酵时，在所得到的乳酸菌发酵产物中，化合物K和人参皂苷Rh1和Rh2的量显著增加。

压力处理的人参可以通过在压力下，于110℃～130℃对所述粉碎后的人参原料处理2小时～5小时来制备。根据本发明，当对压力处理的人参进行乳酸菌发酵时，在所得到的乳酸菌发酵产物中，人参皂苷Rh1和Rh2及Δ²⁰-人参皂苷Rh2的量显著增加，尽管化合物K的量低。

另一方面，制备人参的乳酸发酵产物的方法并无特殊限制，可采用相关领域常规使用的方法在适宜条件下进行乳酸菌发酵。

具体地，可通过以下方式制备人参的发酵产物：用粉碎后的人参原料在水中的悬浮液在适宜的温度下培养乳酸菌48～72小时，并经过用于获得人参的乳酸发酵产物的生物转化过程，然后将所得到的产物离心，接着仅过滤上清液并浓缩液体，从而得到人参的乳酸发酵产物。

只要生物转化为化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2、及Δ²⁰-人参皂苷Rh2的效率高，用于发酵的乳酸菌不受特殊限制。例如，可以使用乳杆菌、链球菌或双歧杆菌属。更具体地，可以使用以下双岐杆菌中的至少一种：双歧杆菌K-103(参见Arch.Pharm.Res.，21，54-61，1998，Dong-Hyun，Kim教授，the college of pharmacy，Kyung-Hee University，Seoul，韩国)、双歧杆菌K-506(参见Arch.Pharm.Res.，21，54-61，1998，Dong-Hyun，Kim教授，the college of pharmacy，Kyung-Hee University，Seoul，，韩国)、考来双歧杆菌(Bifidobacterium cholerium)KK-1(KCCM-10364)、最小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)KK-2(KCCM-10365)、双歧杆菌H-1(KCCM-10493)和双歧杆菌KK-11(Dong-Hyun，Kim教授，the collegeof pharmacy，Kyung-Hee University)。

在这些双岐杆菌中，双歧杆菌H-1、考来双歧杆菌KK-1和最小双歧杆菌KK-2是发明人首次使用的微生物以获得人参的乳酸发酵产物。所述的考来双歧杆菌KK-1、最小双歧杆菌KK-2和双歧杆菌H-1已经保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganism)，保藏号分别为KCCM-10364(2003年3月22日)、KCCM-10365(2003年3月22日)、KCCM-10493(2003年5月1日)。本发明的考来双歧杆菌KK-1和最小双歧杆菌KK-2、双歧杆菌H-1和双歧杆菌K-11是革兰氏阳性厌氧菌，而且是果糖-6-磷酸-磷酸转酮酶阳性。

这些细菌具有如下表所示的糖利用性。

   类别                   糖利用性  双歧杆菌   KK-1  双歧杆菌   KK-2  双歧杆菌   H-1  双歧杆菌   KK-11  amigladin  阿拉伯糖  纤维二糖  糊精  七叶灵  果糖  半乳糖  葡糖酸盐  葡萄糖  糖原  肌醇   菊粉   乳糖  麦芽糖  甘露醇  甘露糖  松三糖   蜜二糖  棉子糖   核糖  水杨苷  山梨醇  淀粉   蔗糖  海藻糖   木糖  -  -  -  +  -  -  +  -  +/-  +/-  -   -   +  +/-  -  +/-  -   +  +   +/-  +  +/-  +   -  -   -  -  +/-  +/-  +  -  +  +  -  +  +  -   +/-   +/-  +  +  +  -   -  -   +/-  +  -  +   +/-  -   +/-  -  +  -  -  +/-  +  +  -  +  -  -   +/-   +  +  +  +  -   +  +   +/-  +  -  -   +  -   +  -  +  -  -  +/-  +/-  +  -  +  -  -   +/-   +  +  +  +  -   +  +   +/-  +  -  -   +  -   +

所述双歧杆菌KK-1、KK-2、H-1和K-11与分类中的相同种的其它细菌的特征相同。然而，双歧杆菌能提供人参的乳酸发酵产物，因此当用于人参发酵过程的时候，所得的人参乳酸发酵产物含有更高量的化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2，以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2。

因此，本发明的人参的乳酸发酵产物含有更高量的化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2。特别地，优选所包含的(化合物K+人参皂苷Rh1)、(人参皂苷Rh1+人参皂苷Rh2)、(人参皂苷Rh2+Δ²⁰-人参皂苷Rh2+人参皂苷Rh1)或者(化合物K+人参皂苷Rh1+人参皂苷Rh2)的总量与(人参皂苷Rc+人参皂苷Rd+人参皂苷Rb1+人参皂苷Rb2+人参皂苷Re+人参皂苷Rg1)的总量的比例分别大于0.1。更优选，当生成(化合物K+人参皂苷Rh1)时，这两种成分的比例在1∶50至50∶1的范围；当生成(人参皂苷Rh2+人参皂苷Rh1)时，这两种成分的比例在1∶50至50∶1的范围；当生成(人参皂苷Rh2+Δ²⁰-人参皂苷Rh2+人参皂苷Rh1)时，(人参皂苷Rh2+Δ²⁰-人参皂苷Rh2)总量：人参皂苷Rh1的比例在1∶50至50∶1的范围；当生成(化合物K+人参皂苷Rh1+人参皂苷Rh2)时，化合物K：人参皂苷的比例在1∶50至50∶1的范围。在红参中不天然地包含化合物K，但采用本发明的乳酸菌进行发酵时，化合物K在红参中含量增加。

本发明的所述乳酸菌表现出能抑制肠道有害菌和/或抑制肠道有害酶的活性和/或抑制癌细胞的增殖。

另一方面，本发明还提供了一种含有所得到的乳酸菌发酵产物的人参酸乳。

由于所述人参酸乳包含本发明的所得到的人参的乳酸发酵产物，即包括大量的诸如化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等人参皂苷成分，因此本发明的酸乳也必然是一种能够发挥出化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2等的高生理学功能的多功能酸乳，更具体地，能够发挥抗癌、抗过敏和加强免疫的功能。这样的人参酸乳可以通过向常规酸乳中仅添加0.1重量％～10重量％的上述所得到的人参的发酵产物来制备。然而，这种方法需要单独地对酸乳的乳进行发酵的步骤，并需要另外的通过乳酸菌来对人参进行发酵的步骤以获得人参的乳酸发酵产物。因此，由于成本的原因，该方法在工业上是不可取的。因此，本发明的人参酸乳可以通过用乳酸菌同时对酸乳的乳和0.1重量％～10重量％的人参进行发酵来制备。用于发酵的反应物可以包含维生素。

用于制备人参酸乳的细菌并无特殊限制，只要能同时发酵人参和乳以制备酸乳即可。例如，乳杆菌、链球菌或双歧杆菌，优选使用下列双岐杆菌中的至少一种：双歧杆菌K-103、双歧杆菌K-506、考来双歧杆菌KK-1、最小双歧杆菌KK-2、双歧杆菌H-1和双歧杆菌KK-11。

用于制备酸乳的乳并无特殊限制，可以使用山羊乳、绵羊乳、脱脂乳、去乳脂的乳以及牛乳。

发酵制备酸乳后，乳酸菌被可任选除去。然而，因为乳酸菌具有改善肠道环境的有利功能，优选不除去所述乳酸菌。相应地，本发明的酸乳可以改善肠道环境。

另一方面，人参粉末酸乳可以通过向所得到的酸乳中添加人参粉末而得到。相应地，酸乳并不局限于形式类型。于是可以通过乳酸菌对乳进行发酵而制备不同类型的常规酸乳。

参考以下实施例将更易于理解本发明，然而，这些实施例仅用于解释本发明而非对本发明的范围进行限制。相关领域通常可接受的其修饰和应用都落在本发明的范围内。

优选实施方式

实施例A1

将未干燥的人参根(韩国锦山的5年生高丽参根，购自庆东市场)用热水彻底清洗，将其干燥并研成细粉末。随后，将1g如上制备的干人参粉末和0.1g维生素C悬浮于100ml的乳中。然后对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃发酵24小时来制得酸乳。

实施例A2

由未干燥的人参根或人参根须充分脱水来制备干燥人参粉末，将得到的干燥人参粉末各2g和0.1g的维生素C悬浮于100ml乳中。然后，对其接种预培养的双歧杆菌K-103和双歧杆菌K-506各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃发酵24小时来制得酸乳。

实施例A3

由未干燥的人参根充分脱水来制备干燥人参粉末，将得到的1g干燥人参粉末和0.1g的维生素C悬浮在100ml乳中。然后，对其接种预培养的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃发酵12小时来制得酸乳。

实施例A4

将1g干燥白参根的粉末和0.1g的维生素C悬浮于100ml乳中。然后，对其接种预培养的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌KK-1各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃发酵24小时来制得酸乳。

实施例A5

将1g干燥人参根粉末和0.1g的维生素C悬浮于100ml乳中。然后，对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得人参酸乳。

实施例A6

将干燥的人参根粉末用0.5％乳酸在60℃处理5小时，然后进行中和、干燥。将1g上述制备的干燥人参根粉末(酸处理人参)和0.1g维生素C悬浮于100ml乳中。然后向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得酸处理人参酸乳。

实施例A7

将干燥的人参根粉末悬浮于蒸馏水中，并在100℃下蒸制2小时，然后进行干燥。将1g上述制备的干燥的人参根粉末(高温处理人参)和0.1g维生素C悬浮在100ml的乳中。然后向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时以制得高温处理人参酸乳。

实施例A8

将干燥的人参根粉末于120℃加压2小时，随后进行干燥。将1g上述制备的干燥的人参根粉末(加压处理人参)和0.1g维生素C悬浮在100ml乳中。然后向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得加压人参酸乳。

实施例A9

将1g干燥的人参根粉末和0.1g维生素C悬浮在100ml乳中。然后向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得人参酸乳。

实施例A10

用5％的乳酸于60℃处理干燥的人参根粉末5小时，然后进行中和、干燥。将上述所制备的1g干燥的人参根粉末(高温处理人参)和0.1g维生素C悬浮在100ml乳中。然后，向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得高温处理人参酸乳。

实施例A11

将干燥的人参根粉末悬浮于蒸馏水中，并在100℃下蒸制2小时，然后进行干燥。将1g上述制备的干燥的人参根粉末(高温处理人参)和0.1g维生素C悬浮在100ml的乳中。然后，向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得高温处理人参酸乳。

实施例A12

将干燥的人参根粉末于120℃加压2小时，随后进行干燥。将上述制备的1g干燥的人参根粉末(加压处理人参)和0.1g维生素C悬浮在100ml乳中。然后向其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下发酵24小时来制得加压人参酸乳。

实施例A13～A24

通过同样重复上述实施例A1-A12的方法获得各乳酸菌发酵产物，区别在于使用2g(湿重)预培养的乳酸菌和100ml蒸馏水而不是100ml乳。

实验例A1：皂苷成分的含量分析

商购普通人参根(韩国锦山的Nonghyup 4～6年生高丽参，购自庆东市场)1g及其干燥粉末、酸处理、高温处理和加压处理的形式各1g(按照上述实施例中相同的方法制备)分别与含有0.1g维生素C的100ml的乳相混合。上述各个混合物随后用1g双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2接种，在37℃下发酵72小时，然后通过减压浓缩分别获得人参、高温处理人参、酸处理人参和加压处理人参的发酵酸乳。随后，2g人参和其干燥粉末形式、酸处理形式、高温处理形式和加压处理形式各2g，以及上述发酵产物各2g，分别用100ml甲醇提取3次。浓缩每一提取物并悬浮在水中，随后用100ml的乙醚提取3次。每一乙醚馏分被进一步用100ml丁醇提取3次。浓缩丁醇馏分，然后溶解在甲醇中，随后进行TLC分析(溶剂系统：CHCl₃∶MeOH∶H₂O＝65∶35∶10/CHCl₃∶EtOAc∶MeOH∶H₂O＝15∶40∶22∶9；喷射剂：溶于甲醇中的5％的硫酸；TLC扫描仪：岛津CS-9301PC)。获得的结果如表2所示。各组分的量以其占最终提取馏分的百分比进行计算。

实施例A1～A4和A9～A12也获得了与表2相似的结果。实施例A13～A24的发酵人参酸乳显示与前述发酵酸乳含有相似量的皂苷。

                                       表2

  组分名称                        组分含量(％)  人参  (实施例A5)  人参发酵酸乳  (实施例A5)  高温处理人参  (实施例A7)  高温处理人参  的发酵酸乳  (实施例A7)  人参皂苷Rb1  15.1  1.6  5.1  2.7  人参皂苷Rb2  8.2  1.1  3.5  2.1  人参皂苷Rc  9.5  0.5  3.8  2.9  人参皂苷Re  10.7  2.7  7.8  4.5  人参皂苷Rg3  ＜1  ＜1  14.6  8.5  20-人参皂苷Rg3  ＜1  ＜1  4.5  ＜1  化合物K  0  28.6  ＜1  2.9  人参皂苷Rh2  ＜1  ＜1  ＜1  3.2  Δ²⁰-人参皂苷Rh2  ＜1  ＜1  ＜1  ＜1  人参皂苷Rh1  ＜1  1.2  0.5  1.8  原人参二醇  ＜1  2.1  ＜1  2.1  组分名称                              组分含量(％)  酸处理人参  (实施例A6)  酸处理人参的  发酵酸乳  (实施例A6)  加压处理人参  (实施例A8)  加压处理人参  的发酵酸乳  (实施例A8)  人参皂苷Rb1  2.5  1.2  2.5  1.2  人参皂苷Rb2  2  0.9  1.2  0.8  人参皂苷Rc  1.8  1.1  1.5  1.0  人参皂苷Re  6.8  5.2  3.9  2.9  人参皂苷Rg3  25  7  16.1  4.5  20-人参皂苷Rg3  ＜1  ＜1  6.5  2.1  化合物K  0  2.2  0  1.2  人参皂苷Rh2  0.2  10.2  ＜1  4.5  Δ²⁰-人参皂苷Rh2  0.1  1.8  ＜1  3.8  人参皂苷Rh1  0.5  2.1  2.1  2.5  原人参二醇  ＜1  2.5  ＜1  2.8

实验例A2：抗癌功效的分析

将HepG2(人肝癌细胞系；KCLB-10023)、A-549(人肺癌细胞系；KCLB-10185)、P-388(小鼠淋巴瘤细胞系；KCLB-10046)和L-1210(小鼠淋巴细胞白血病细胞系；KCLB-10219)分别培养在添加了10％FBS、1％抗生素-抗菌素(GIBCO，美国)和2.2g NaHCO₃的RPMI 1640培养基中。随后，HepG2和A-549细胞通过胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶)消化收获，将每180μl收获的细胞接种至96孔板的每个孔(3×10⁴细胞/孔)。然后该板在含5％CO₂的温箱中于37℃孵育24小时。对于P-388和L-1210细胞，将每180μl通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶)收获的细胞接种至96孔板的每一孔(4×10⁴细胞/孔)。然后将该板在含5％CO₂的温箱中于37℃孵育2小时。将白参的丁醇提取物和表3所示的乳酸菌发酵人参高压灭菌，每种20μl分别加入到前述制备的96孔板的每一孔中，浓度为10mg/ml。然后将该96孔板在含5％CO₂的温箱中于37℃孵育48小时。48小时后，向96孔板的每一孔加入20mg/ml的MTT，然后在含5％CO₂的温箱中孵育4小时。4小时后，从96孔板的每一孔移走培养基并向其中添加100μl的DMSO(二甲基亚砜)。随后，在580nm处用ELISA读数测定每一孔的吸光率以此检测细胞毒性。所得结果如表3所示。

                             表3

  人参种类               ED50(μl/ml)  P388  L1210  A549  HepG2  普通人参的提取物  ＞100  ＞100  ＞100  ＞100  白参的乳酸菌发酵产物  98  50  160  96  酸处理人参的乳酸菌  发酵产物   82   51   102   95  高温处理人参的乳酸菌  发酵产物  78  45  87  91  加压处理人参的乳酸菌  发酵产物   85   52   105   92

实验例A3：对大肠杆菌(E.Coli)HGU-3和有害肠道酶的影响

从上述实施例中获得的发酵人参产物和经过24小时培养的E.ColiHGU-3(来自庆熙大学Dong-Hyun Kim药学院，其特性与一般大肠杆菌几乎完全相同)与双歧杆菌KK-1或双歧杆菌KK-2中的每一个以10⁷个的浓度一起接种到5ml GAM溶液中，并孵育24小时。随后测量细菌菌株所产生的β-葡糖醛酸酶和色氨酸酶的酶活性，这两种酶被认为分别是结肠癌和肝功能紊乱的原因。

β-葡糖醛酸酶的酶活性通过下述方法测定：向0.38ml的0.1M磷酸盐缓冲液中(pH7.0)添加0.02ml的10mM对硝基苯-β-D-葡糖苷酸和0.1ml的酶溶液，然后在37℃下孵育1小时，随后添加0.5ml的0.5N NaOH终止反应，并向其中添加1ml蒸馏水，然后进行离心(2000×g，20min)。测定每一所得产物上清液在405nm处的吸光率。

色氨酸酶的酶活性通过下述方法测定：添加0.2ml完全反应混合物(0.1M的N-(二羟乙基)甘氨酸，pH 8.0，4％吡哆醛-5-磷酸盐，20％牛血清白蛋白)，0.2ml的0.02M色氨酸和0.1ml的酶溶液，然后孵育30分钟。随后添加2ml染色溶液(对二甲氨基苯甲醛14.7g，95％乙醇948ml，C-H₂SO₄52ml)终止反应，然后以2000×g离心20分钟。测定每一终产物上清液在550nm处的吸光率。

从双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2所得的结果分别如图4和图5所示。

                                            表4

           抑制百分比  β-葡糖醛酸酶  色氨酸酶  对照组  (培养在GAM中的KK-1和总肠道菌群)   0   0  人参提取物  (培养在含有1％的人参提取物的GAM中的KK-1  和总肠道菌群)   32   45  人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％人参乳酸菌发酵产物的GAM中的  KK-1和总肠道菌群)   85   85  酸处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％酸处理人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-1和总肠道菌群)   75   78  高温处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％高温加工人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-1和总肠道菌群)   89   87  加压处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％加压处理人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-1和总肠道菌群)   78    85

                                             表5

            抑制百分比  β-葡糖醛酸酶  色氨酸酶  对照组  (培养在GAM中的KK-2和总肠道菌群)   0   0  人参提取物  (培养在含有1％人参提取物的GAM中的KK-2和总  肠道菌群)   32   45  人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％人参的乳酸菌发酵产物的GAM中的  KK-2和总肠道菌群)   76   81  酸处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％酸处理人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-2和总肠道菌群)   67   88  高温处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％高温处理人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-2和总肠道菌群)   82   68  加压处理人参的乳酸菌发酵产物  (培养在含有1％加压处理人参的乳酸菌发酵产物的  GAM中的KK-2和总肠道菌群)   71   78

从表4和表5可知发酵的人参产物在吸收入细胞时具有抗癌功能，抑制肠道细菌所产生的β-葡糖醛酸酶和色氨酸的活性，从而具有预防结肠癌和肝损伤的功能。

实施例B1

将1g的花旗参根粉末(可含有0.1g的维生素C)悬浮在100ml的乳中。然后，对其接种预培养的乳酸菌保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌KK-1各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着，在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B2

将1g花旗参根粉末(可含有0.1g的维生素C)悬浮在100ml的乳中。然后，对其接种预培养的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌KK-1各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B3

将1g干燥的花旗参根粉末(可含有0.1g的维生素C)悬浮在100ml的乳中。然后，对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B4

将干燥的花旗参根粉末悬浮于水中，并向其中添加乳酸至终浓度1％。然后在60℃条件下孵育5小时，随后进行中和、干燥。将如前述制备的1g干燥的人参根粉末(可含有0.1g的维生素C)悬浮在100ml的乳中。然后，对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-2各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B5

将1g干燥的花旗参根粉末润湿并蒸制2小时(可含有0.1g的维生素C)。然后将其悬浮在100ml的乳中。然后，对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-11各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B6

将干燥的花旗参根粉末(可含有0.1g的维生素C)在120℃条件下加压2小时，将其1g悬浮在100ml的乳中。然后对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-11各1ml(约10⁹细胞/ml)，然后在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B7

将干燥的花旗参根粉末(可含有0.1g的维生素C)在120℃条件下加压2小时，并将其悬浮在100ml的乳中至终浓度5％。然后，对其接种预培养的双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-11各1ml(约10⁹细胞/ml)，接着在37℃下孵育24小时来获得酸乳。

实施例B8～B14

通过同样重复上述实施例B1～B7的方法来获得每一种的人参乳酸发酵产物，区别在于使用2g(湿重)预培养的乳酸菌和100ml蒸馏水而不是100ml乳。

实验例B1：皂苷成分的含量分析

商购普通花旗参(加拿大产4年生高丽参，购自Hongrim贸易有限公司)1g及其干燥粉末、酸处理、高温处理和加压处理的形式各1g分别与含有0.1g维生素C的100ml的乳相混合。上述各个混合物随后用1g双歧杆菌KK-1和双歧杆菌KK-11接种，在37℃下发酵72小时，然后通过减压浓缩分别获得干燥花旗参、高温处理花旗参、酸处理花旗参和加压处理花旗参的发酵酸乳。随后，将花旗参及其干燥粉末形式、酸处理形式、高温处理形式和加压处理形式、以及上述每种的发酵产物各2g～20g用100ml甲醇提取3次。浓缩每一提取物并悬浮在水中，随后用100ml的乙醚提取3次。每一乙醚馏分被进一步用100ml丁醇提取3次。浓缩丁醇馏分，然后溶解在甲醇中，并进行TLC分析(溶剂系统：CHCl₃∶MeOH∶H₂O＝65∶35∶10/CHCl₃∶EtOAc∶MeOH∶H₂O＝15∶40∶22∶9；喷射剂：溶于甲醇中的5％的硫酸；TLC扫描仪：岛津CS-9301PC)。获得的结果如表6所示。

下表所示皂苷的量以其占最终提取馏分的百分比进行计算。对照组产物除了不含有人参，其它与实验例完全相同。

                                        表6

   组分名称                    化学组分含量(％)  花旗参  花旗参的  发酵酸乳  (实施例B3)  高温处理  花旗参  高温处理花旗  参的发酵酸乳  (实施例B5)  人参皂苷Rb1  45.9  11.2  20.3  5.9  人参皂苷Rb2  1.1  ＜1  ＜1  ＜1  人参皂苷Rc  4.8  ＜1  1.5  ＜1  人参皂苷Re  23.6  12.3  9.9  3.5  人参皂苷Rg3  ＜1  ＜1  19.1  4.6  20-人参皂苷Rg3  ＜1  ＜1  2.5  ＜1  化合物K  0  25.4  ＜1  5.3  人参皂苷Rh2  ＜1  ＜1  ＜1  4.6  Δ²⁰-人参皂苷Rh2  ＜1  ＜1  ＜1  1.2  人参皂苷Rh1  ＜1  2.8  4.8  1.8  原人参二醇  ＜1  ＜1  ＜1  ＜1   组分名称                     化学组分含量(％)  酸处理  花旗参  酸处理花旗参  的发酵酸乳  (实施例B4)  加压处理  花旗参  加压处理花旗  参的发酵酸乳  (实施例B6)  人参皂苷Rb1  4.5  1.4  11.8  3.2  人参皂苷Rb2  ＜1  ＜1  1  ＜1  人参皂苷Rc  ＜1  ＜1  ＜1  ＜1  人参皂苷Re  6.8  4.2  9.3  3.1  人参皂苷Rg3  28  11.5  23.2  9.6  20-人参皂苷Rg3  2.5  ＜1.1  6.5  3.1  化合物K  0  2.8  0  3.7  人参皂苷Rh2  0.2  11.3  ＜1  8.6  Δ²⁰-人参皂苷Rh2  0.1  1.4  ＜1  1.1  人参皂苷Rh1  1.5  3.7  1.2  2.5  原人参二醇  ＜1  ＜1  ＜1  1.4

实验例B2：抗癌功效的分析

将HepG2(人肝癌细胞系；KCLB-10023)，A-549(人肺癌细胞系；KCLB-10185)，P-388(小鼠淋巴瘤细胞系；KCLB-10046)和L-1210(小鼠淋巴细胞白血病细胞系；KCLB-10219)分别培养在添加了10％FBS、1％抗生素-抗菌素(GIBCO，美国)和2.2g NaHCO₃的RPMI 1640培养基中。随后，将HepG2和A-549细胞通过胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶)消化收获，将每180μl收获的细胞接种至96孔板的每个孔(3×10⁴细胞/孔)。然后该板在含5％CO₂的温箱中于37℃孵育24小时。对于P-388和L-1210细胞，将每180μl通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶)收获的细胞接种至96孔板的每一孔(4×10⁴细胞/孔)。然后该板在含5％CO₂的温箱中于37℃条件下孵育2小时。花旗参的提取物和表3所示的人参的乳酸发酵产物(乳酸菌发酵后的丁醇提取馏分)被高压灭菌，每种20μl分别加入到前述制备的96孔板的每一孔中至浓度为10mg/ml。然后将该96孔板在含5％CO₂的温箱中于37℃条件下孵育48小时。48小时后，向每孔中加入20mg/ml的MTT，然后继续在含5％CO₂的温箱中孵育4小时。4小时后，从96孔板的每一孔移走培养基并向其中添加100μl的DMSO。随后，在580nm处用ELISA读数测定每一孔的吸光率以此检测细胞毒性。所得结果如表7所示。

                       表7

   人参种类                 ED50(μl/ml))  P388  L1210  A549  HepG2  普通花旗参的提取物  ＞100  ＞100  ＞100  ＞100  花旗参乳酸菌发酵产物  78  65  ＞100  89  酸处理花旗参的乳酸  发酵产物  89  65  95  85  高温处理花旗参的乳酸  发酵产物  92  50  89  95  加压处理加工花旗参的乳  酸发酵产物   92   60   110   95

实验例B3：对E.Coli HGU-3和有害肠道酶的影响

经过24小时培养的E.Coli HGU-3(来自庆熙大学Dong-Hyun Kim药学院，其特性与一般大肠杆菌几乎完全相同)(或新鲜制备的人总肠道菌群)与双歧杆菌KK-1(或双歧杆菌KK-2或双歧杆菌H-1或双歧杆菌KK-11)中的每一个以10⁵个细胞的浓度一起接种到5ml的GAM溶液中(该溶液在此之前含有人参；不含人参)，并孵育24小时。随后测量细菌菌株所产生的β-葡糖醛酸酶和色氨酸酶的酶活性，这两种酶被认为分别是结肠癌和肝功能紊乱的原因。

β-葡糖醛酸酶的酶活性通过下述方法测定：向0.38ml的0.1M磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)添加0.02ml的10mM对硝基苯-β-D-葡糖苷酸和0.1ml的酶溶液，然后在37℃下孵育1小时，随后添加0.5ml的0.5N NaOH终止反应，并向其中添加1ml蒸馏水，然后进行离心(2000×g，20min)。测定每一所得产物上清液在405nm处的吸光率。

色氨酸酶的酶活性通过下述方法测定：添加0.2ml完全反应混合物(0.1M的N-(二羟乙基)甘氨酸，pH 8.0，4％吡哆醛-5-磷酸盐，20％牛血清白蛋白)，0.2ml的0.02M色氨酸和0.1ml的酶溶液，然后孵育30分钟。随后添加2ml染色溶液(对二甲氨基苯甲醛14.7g，95％乙醇948ml，C-H₂SO₄ 52ml)终止反应，然后以2000×g离心20分钟。测定每一所得产物上清液在550nm处的吸光率。

所产生的氨按照下述方法进行定量分析：添加0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，20μl的馏分上清和100μl的1N H₂SO₄，并向其中添加溶液混合物1(1％丙醇，0.005％硝普钠)和溶液混合物2(0.1％次氯酸钠，0.5％氢氧化钠，5.5％磷酸二钠)各1ml，然后在60℃条件下加热20分钟，随后冷却至室温，测定660nm处的吸光率。

所得结果如表8所示，其中显示E.coli HUG-3和乳酸菌的混合培养物以及人体总肠道菌群及乳酸菌的混合物(对照组只包含E.coli HUG-3)对导致结肠癌的酶的活性的抑制效应。

                     表8

              抑制百分比 β-葡糖醛酸酶  色氨酸酶  氨产量  对照组 0  0  0  双歧杆菌KK-1 85  78  67  双歧杆菌KK-2 70  89  75  双歧杆菌H-1 32  45  59  双歧杆菌KK-11 68  75  69

从表8可知，人参的发酵产物当吸收入细胞中时具有抗癌功能，并抑制肠道细菌所产生的β-葡糖醛酸酶和色氨酸的活性以及氨的产量，从而具有预防结肠癌和肝损伤的功效。

实验例B4：对E.coli 0157生长的抑制效应

研究了来自于发酵人参的乳酸菌对E.coli 0157的生长的抑制效应。将E.coli 0157接种至每5ml的GAM中，浓度为10⁵/ml。将然后上述各培养物与表9所列的各乳酸菌以1∶1和1∶10的比例进行混合(E.coli 0157：乳酸菌)。然后，将该混合物在37℃条件下孵育20小时，随后在TS琼脂板上划线，接着在37℃条件下孵育20小时。然后，对琼脂板上的E.coli0157克隆进行计数。

                             表9

                 抑制百分比  1(有害菌10⁵个/ml)：  1(乳酸菌10⁵个/ml)  1(有害菌10⁵个/ml)：  10(乳酸菌10⁶个/ml) 对照组 (仅有有害细菌)  0  0 双歧杆菌KK-1和有害细菌  82  95 双歧杆菌KK-2和有害细菌  80  85 双歧杆菌H-1和有害细菌  78  88 双歧杆菌KK-11和有害细菌  67  85

工业实用性

如上所述，根据本发明，包含高丽参以及花旗参的发酵产物含有大量的化合物K、人参皂苷Rh1和Rh2、以及Δ²⁰-人参皂苷Rh2，它们在未加工的人参中几乎不存在，或以极小的量存在。结果，这提示人参的发酵产物不仅具有抗癌和抗过敏功效，而且还能改善肠道环境。此外，它对于预防结肠癌、防止肝损伤和抑制有害肠道细菌生长方面具有很强的效应。因此，含有人参的发酵产物作为活性成分的酸乳作为具有能提供上述皂苷的生理学活性这一特定功能的酸乳将具有产业及商业用途。